葡萄柚籽提取物（GSE）對(duì)醪糟保藏期的影響及其菌群變化的工藝研究

姚宇晨，呂　欣，周　元，梁名偉，王振猛，杜若曦，葉　萌，劉變芳

（西北農(nóng)林科技大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，陜西楊凌　712100）

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葡萄柚籽提取物（GSE）對(duì)醪糟保藏期的影響及其菌群變化的工藝研究

姚宇晨，呂欣，周元，梁名偉，王振猛，杜若曦，葉萌，*劉變芳

（西北農(nóng)林科技大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，陜西楊凌712100）

醪糟是一種營養(yǎng)豐富、口感獨(dú)特的風(fēng)味食品，葡萄柚籽提取物是潛在的廣譜性細(xì)菌、真菌殺菌劑，在食品保鮮中具有較好的效果。為了探究在醪糟低溫保藏的過程中加入葡萄柚籽提取物（Grapefruit seed extract，GSE）后產(chǎn)品菌群及各項(xiàng)指標(biāo)變化，試驗(yàn)通過檢測(cè)醪糟保藏過程中細(xì)菌總數(shù)、酵母菌、霉菌等微生物指標(biāo)，酸度、糖度等理化指標(biāo)和感官評(píng)定的方法，研究葡萄柚籽提取物對(duì)醪糟飲品的保鮮功能，以期為開發(fā)新型植物源的食品防腐劑提供理論依據(jù)。

醪糟；葡萄柚籽提取物；微生物；保鮮

醪糟是我國傳統(tǒng)的大米發(fā)酵制品，具有口味鮮美、營養(yǎng)價(jià)值豐富等特點(diǎn)。醪糟中除含有水、乙醇和糖外，還含有多種有機(jī)酸、蛋白質(zhì)、氨基酸和多肽等易被人體消化吸收的營養(yǎng)物質(zhì)［1］，長期食用可強(qiáng)身健體、活血通脈、防病驅(qū)寒，其淀粉降解產(chǎn)物含有豐富的麥芽低聚糖和異麥芽低聚糖，具有較強(qiáng)的保健功能。市場上售賣的醪糟若不完全殺菌會(huì)繼續(xù)發(fā)酵甚至腐敗變質(zhì)，采用高溫殺菌又會(huì)導(dǎo)致醪糟的部分營養(yǎng)成分破壞。

葡萄柚籽提取物（GSE）是一種商業(yè)化的植物提取物，是從葡萄柚（Citrus paradisi Macfaden） 種籽和果肉中提取出的，化學(xué)名稱為復(fù)合聯(lián)苯酚羥基苯，分子量為565。GSE中含有大量的多酚類物質(zhì)，如兒茶酚、表兒茶酸以及二聚體、三聚體和四聚體原花青素。盡管GSE中主要的抗菌物質(zhì)還不完全清楚，但是多酚類物質(zhì)具有很強(qiáng)的抗氧化活性，特別是類黃酮，它們的含量與GSE被認(rèn)為在抑菌方面發(fā)揮了很重要的作用［2］。GSE是一種非常有潛力的高效廣譜抑菌化合物，在極低質(zhì)量分?jǐn)?shù)時(shí)就可取得明顯的殺菌效果，它能抑制革蘭氏陰性、革蘭氏陽性細(xì)菌［3-4］和真菌［5］，抑制病毒與寄生蟲［6］。美國農(nóng)業(yè)部（USDA）1980年檢測(cè)結(jié)果表明，GSE對(duì)動(dòng)物沒有毒性，并獲得批準(zhǔn)生產(chǎn)［7］。

我國常用的化學(xué)防腐劑有苯甲酸鈉、山梨酸鈉等，天然防腐劑主要有殼聚糖、茶多酚等，葡萄柚籽提取物作為防腐劑的研究并不多見。Park等人研究表明，葡萄柚籽提取物（GSE）可破壞微生物的細(xì)胞壁并可抑制微生物的生長，另外也有研究表明GSE還具有抗氧化特性，因此將其作為防腐劑用于食品加工，可防止被微生物感染，并有效地延長貨架期。本研究擬通過添加不同質(zhì)量濃度的葡萄柚籽提取物，探究其對(duì)傳統(tǒng)醪糟的保藏過程、品質(zhì)等多方面影響，以pH值、糖度、菌落總數(shù)、酵母菌、霉菌、感官評(píng)定等為評(píng)價(jià)指標(biāo)，探討傳統(tǒng)醪糟保藏的有效方法，為進(jìn)一步新型非化學(xué)天然防腐劑的開發(fā)提供理論依據(jù)。

1　主要原料與設(shè)備

1.1主要原料與試劑

圓江米、蒸餾水、革蘭氏染液、石碳酸棉蘭染液、復(fù)紅染液、美藍(lán)染液；甜酒曲發(fā)酵劑為安琪甜酒曲；葡萄柚籽提取物（GSE），購自楊凌天成試劑公司。

1.2主要培養(yǎng)基

營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、孟加拉紅培養(yǎng)基、月桂基硫酸鹽胰蛋白胨肉湯（LST）、EC肉湯、EMB培養(yǎng)基、LB培養(yǎng)基等。

1.3主要儀器設(shè)備

超凈工作臺(tái)、電熱恒溫培養(yǎng)箱、電熱套、水浴鍋、高壓蒸氣滅菌鍋、pH計(jì)、酒精計(jì)、手持糖度計(jì)、電子分析天平、溫度計(jì)、蒸鍋、發(fā)酵桶、超凈工作臺(tái)、光學(xué)顯微鏡等。

1.4醪糟釀造方法

圓江米浸泡5 h左右，泡好的圓江米再次清洗瀝干水分后放入蒸鍋蒸熟，蒸的過程中稍微翻拌，待蒸熟沒有硬心時(shí)關(guān)火晾涼，或過1次涼水使其稍降溫。將糯米飯翻面，使其溫度降至30℃左右，這時(shí)撒入已搟成粉的甜酒曲拌勻，在桶里按壓使其表面平整，在中間掏一個(gè)洞，在洞口壁以及表面再撒上少量甜酒曲，蓋上蓋子，使桶溫保持在30～35℃，并恒溫培養(yǎng)2～3 d。

2　試驗(yàn)方法

2.1樣品處理及GSE對(duì)比添加

將制好的醪糟分裝到6個(gè)500 mL玻璃罐頭瓶中，經(jīng)巴氏消毒后待用，將商品化的粉末狀葡萄柚籽提取物（GSE）水浴加熱溶解制成質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%的溶液，按照0，0.05%，0.10%，0.15%的質(zhì)量濃度梯度添加入已分裝處理好的醪糟樣品中，振搖混合均勻。其余設(shè)置1個(gè)空白對(duì)照組和1個(gè)市售玻璃瓶裝醪糟組，保證樣品組間液體量相等。

2.2甜酒曲菌種分析

取適量醪糟的發(fā)酵劑甜酒曲加水加熱溶解制成質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%的溶液，制備10倍系列稀釋樣品勻液，稀釋度10-1～10-7，選擇10-2～10-4稀釋度的樣品液，吸取1 mL接種于營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基和孟加拉紅培養(yǎng)基，培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)并觀察菌落情況。培養(yǎng)結(jié)束后，取培養(yǎng)物制片在光學(xué)顯微鏡下觀察其特征。

2.3發(fā)酵醪糟的微生物分離培養(yǎng)

2.3.1菌落總數(shù)測(cè)定

采用營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，根據(jù)國家標(biāo)準(zhǔn)GB 47892—2010測(cè)定。樣品組進(jìn)行統(tǒng)一的預(yù)處理后進(jìn)行10倍系列稀釋，取10-2～10-4稀釋度的樣品液作為接種樣，吸取1 mL樣品液接種于營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上并涂抹均勻，于36±1℃條件下倒置培養(yǎng)48±2 h，做2組重復(fù)，最后記錄稀釋倍數(shù)和相應(yīng)的菌落數(shù)量并做計(jì)算。

2.3.2酵母菌、霉菌測(cè)定

采用孟加拉紅培養(yǎng)基，根據(jù)國家標(biāo)準(zhǔn)GB 478915—2010測(cè)定。樣品組進(jìn)行統(tǒng)一的預(yù)處理后進(jìn)行10倍系列稀釋，取10-2～10-4稀釋度的樣品液作為接種樣，吸取1 mL樣品液接種于孟加拉紅培養(yǎng)基上并涂抹均勻，于28±1℃條件下倒置培養(yǎng)5 d，做2組重復(fù)，最后記錄稀釋倍數(shù)和相應(yīng)的菌落數(shù)量并做計(jì)算。

2.3.3大腸菌群測(cè)定

采用月桂基硫酸鹽胰蛋白胨肉湯（LST）、EC肉湯、EMB培養(yǎng)基，根據(jù)國家標(biāo)準(zhǔn)GB 47893—2010測(cè)定。樣品組進(jìn)行統(tǒng)一的預(yù)處理后進(jìn)行10倍系列稀釋，取10-2～10-4稀釋度的樣品液作為接種樣，每個(gè)稀釋度取1 mL接種3管LST肉湯，于36±1℃條件下培養(yǎng)24±2 h，若有產(chǎn)氣者進(jìn)行復(fù)發(fā)酵試驗(yàn)，未產(chǎn)氣則繼續(xù)培養(yǎng)48±2 h，復(fù)發(fā)酵試驗(yàn)中產(chǎn)氣者進(jìn)行EMB平板分離培養(yǎng)和營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)，最后取培養(yǎng)物進(jìn)行革蘭氏染色和生化試驗(yàn)，報(bào)告大腸埃希氏菌MPN結(jié)果。

2.3.4菌群初步鑒定

（1）霉菌培養(yǎng)物直接鏡檢。在長有霉菌的平板上挑取少量菌絲，采用水浸片法（石碳酸棉蘭）制片并置于低倍顯微鏡下，分別觀察它們的孢子囊梗的形狀排列、著生位置、分支情況及孢子囊的形狀，并注意有無假根等特征。

（2）酵母菌培養(yǎng)物直接鏡檢。將長有酵母菌的平板挑取少量菌絲用水浸法（美藍(lán)染液）制片，并置于低倍顯微鏡下觀察酵母菌細(xì)胞形狀、有無出芽、芽體形狀大小。

（3）乳酸菌培養(yǎng)物制片鏡檢。將長有疑似乳酸菌的平板挑取少量細(xì)菌按照細(xì)菌的革蘭氏染色法制片，并置于高倍顯微鏡下用油鏡觀察。

2.4醪糟的理化指標(biāo)測(cè)定

2.4.1pH值測(cè)定

取保藏期的醪糟原液適量，用精密pH計(jì)測(cè)定pH值，測(cè)定3次取平均值，測(cè)定頻率1次/d，繪制變化曲線圖［8］。

2.4.2糖度測(cè)定

取保藏期的醪糟原液適量，用手持糖度儀測(cè)定糖度，測(cè)定3次取平均值，測(cè)定頻率1次/d，繪制變化曲線圖。

2.4.3酒精度測(cè)定

取保藏期的醪糟原液500 mL，經(jīng)紗布過濾得清液100 mL，加入200 mL蒸餾水進(jìn)行蒸餾，得蒸餾液約100 mL，插入酒精比重計(jì)并根據(jù)酒精度換算表測(cè)定室溫下的酒精度，于保藏起點(diǎn)和終點(diǎn)進(jìn)行測(cè)定。

2.5醪糟的感官評(píng)定

取50 g樣品于潔凈的白瓷盤中，目測(cè)其色澤、組織狀態(tài)和外來雜質(zhì)，用鼻嗅其氣味，并嘗其滋味，與以下標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行比較，作出評(píng)價(jià)。

感官評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)見表1。

表1　感官評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)

3　結(jié)果與分析

3.1甜酒曲菌種分析結(jié)果

取10-3稀釋度培養(yǎng)液1 mL在培養(yǎng)基中培養(yǎng)，觀察孟加拉紅培養(yǎng)基中菌株生長狀況，并取待鑒定菌株在光學(xué)顯微鏡下觀察［9-10］。

根霉平板生長情況見圖1，酵母菌平板生長情況見圖2，酵母菌見圖3，根霉見圖4，孟加拉紅培養(yǎng)基上霉菌生長情況見表2，孟加拉紅培養(yǎng)基上酵母菌生長情況見表3，鏡檢結(jié)果見表4，。

圖1　根霉平板生長情況

經(jīng)光學(xué)顯微鏡觀察和相關(guān)文獻(xiàn)查詢，甜酒曲發(fā)酵劑中主要有米根霉（Rhizopus oryzae）和釀酒酵母（Saccharomyzes cerevisiae） 2種菌種［10］，其中霉菌屬于較高等的微生物，主要依靠形態(tài)學(xué)特征進(jìn)行鑒定。本試驗(yàn)主要集中在對(duì)酵母菌的形態(tài)鑒定，并根據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)進(jìn)行鑒定。

圖2　酵母菌平板生長情況

圖3　酵母菌

圖4　根霉

表2　孟加拉紅培養(yǎng)基上霉菌生長情況

表3　孟加拉紅培養(yǎng)基上酵母菌生長情況

表4　鏡檢結(jié)果

3.2醪糟的微生物培養(yǎng)及微生物學(xué)檢驗(yàn)

3.2.1優(yōu)勢(shì)菌株的確定

添加GSE后酵母菌鏡檢見圖5，不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)GSE處理組菌落生長情況見圖6。

圖5　添加GSE后酵母菌鏡檢

圖6　不同質(zhì)量濃度GSE處理組菌落生長情況

醪糟樣品經(jīng)添加GSE后在其保藏過程中無霉菌和其他雜菌生長，僅有酵母菌生長。醪糟培養(yǎng)過程中，酵母菌是主要的酒化發(fā)酵劑，在發(fā)酵中期，伴隨霉菌分解淀粉產(chǎn)生大量的糖，酵母菌的數(shù)量開始增多，到后期則占絕對(duì)優(yōu)勢(shì)，使醪糟酒精度適量增高抑制了其他細(xì)菌的生長繁殖；同時(shí)隨保藏過程的延長，酵母菌菌落數(shù)逐漸降低，避免了過度產(chǎn)生酒精影響飲品口感風(fēng)味，對(duì)醪糟的保藏過程產(chǎn)品性質(zhì)的穩(wěn)定起到一定作用。初步判定GSE有抑制雜菌，使酵母菌在一定時(shí)間段內(nèi)產(chǎn)生菌種優(yōu)勢(shì)的特點(diǎn)。

3.2.2菌落數(shù)量變化

（1）不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)GSE處理對(duì)醪糟保藏期間細(xì)菌菌落總數(shù)的影響。

GSE對(duì)醪糟保藏期菌落總數(shù)的影響見圖7。

圖7　GSE對(duì)醪糟保藏期菌落總數(shù)的影響

由圖7可知，隨著貯藏時(shí)間的延長，菌落總數(shù)呈先上升后下降的趨勢(shì)，且同一時(shí)間測(cè)定的菌落總數(shù)基本隨著GSE質(zhì)量分?jǐn)?shù)增加而減少。保藏后期對(duì)照組菌落總數(shù)呈上升趨勢(shì)，GSE處理組都呈下降趨勢(shì)，但變化不明顯，添加GSE對(duì)菌落總數(shù)無明顯效果。

（2）不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)GSE處理對(duì)醪糟保藏期間酵母菌、霉菌的影響。

GSE對(duì)醪糟保藏期真菌數(shù)的影響見圖8。

圖8　GSE對(duì)醪糟保藏期真菌數(shù)的影響

經(jīng)鏡檢已知GSE處理組中保藏期平板上所有菌均為酵母菌，所以圖8也可看作是酵母菌數(shù)量變化圖。由圖8可知，隨著貯藏時(shí)間的延長，GSE處理組中酵母菌數(shù)量明顯增多，且隨著GSE質(zhì)量分?jǐn)?shù)增加而增加，到保藏后期則占絕對(duì)優(yōu)勢(shì)，使醪糟酒精度適量增高，抑制了微生物的生長繁殖；同時(shí)隨保藏過程的延長，酵母菌落數(shù)逐漸降低，避免了過度產(chǎn)生酒精影響飲品口感風(fēng)味。整體上講，GSE有一定的保鮮效果。

3.3不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)GSE處理對(duì)醪糟保藏期間理化性質(zhì)的影響

（1）不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)GSE處理對(duì)醪糟保藏期間酸度的影響。

根據(jù)DB 31433—2009酒釀衛(wèi)生要求，原汁酒釀醪糟的總酸（以乳酸計(jì)）要求≤10.0 g/kg。

GSE對(duì)醪糟貯藏期間影響pH值變化見圖9。

圖9　GSE對(duì)醪糟貯藏期間影響pH值變化

由圖9可知，隨著貯藏時(shí)間的延長，對(duì)照組的pH值初期短時(shí)間內(nèi)變化不穩(wěn)定，后期呈現(xiàn)逐漸降低的趨勢(shì)，且在保藏第15天降至較低水平；而GSE處理組初期pH值下降較快，原因可能由于GSE本身呈酸性，保藏過程一開始加入樣品中，導(dǎo)致其pH值迅速降低，后期呈現(xiàn)下降的趨勢(shì)，但保藏后期pH值的下降速度明顯低于對(duì)照組，pH值下降緩慢則減緩了醪糟口感風(fēng)味的降低速度，更有利于鮮食。這說明GSE的保鮮效果較好，且質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.10%處理的樣品保鮮效果最好［11］。

（2）不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)GSE處理對(duì)醪糟保藏期間糖度的影響。

根據(jù)DB 31433—2009酒釀衛(wèi)生要求，原汁酒釀（醪糟）的還原糖（以葡萄糖計(jì)）要求≥15.0 g/100 g。

GSE對(duì)醪糟貯藏期間影響糖度變化見圖10。

圖10　GSE對(duì)醪糟貯藏期間影響糖度變化

由圖10可知，隨著貯藏時(shí)間的延長，對(duì)照組的糖度初期短時(shí)間內(nèi)變化不穩(wěn)定，后期呈現(xiàn)逐漸降低趨勢(shì)且保藏12 d后下降速度較快；而GSE處理組初期變化不穩(wěn)定，可能由于GSE加入后影響霉菌等微生物的正常代謝，使微生物的代謝一定程度上紊亂，后期再保藏5 d糖度下降的速度明顯變緩，且在15 d的保藏期內(nèi)低于對(duì)照組，對(duì)醪糟口感風(fēng)味的保持有一定作用。其中，質(zhì)量濃度為0.05%和0.10%的GSE保鮮效果較好。

3.4不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)GSE處理對(duì)醪糟保藏期間整體感官品質(zhì)的影響

根據(jù)DB 31433—2009酒釀衛(wèi)生要求，原汁酒釀（醪糟）的感官要求如下。

感官評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)見表5，感官評(píng)定結(jié)果見表6。

表5　感官評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)

不同質(zhì)量濃度GSE對(duì)醪糟保藏期整體感官品質(zhì)的影響如表6所示，各項(xiàng)指標(biāo)最低分為10分，即感官評(píng)分總分低于40分則樣品已喪失食用價(jià)值。根據(jù)表5所示，基本感官要求醪糟樣品需保持米粒呈白色、乳白色或微黃色，酒液呈乳白色或淡黃色；有酒釀固有的氣味，酒香味濃郁；有酒釀固有的滋味，味濃甜，略帶酸味，爽口，不得有苦澀、酸敗味。對(duì)照組在保藏過程中氣味和滋味等逐漸降低，保存至15 d時(shí)評(píng)分低于40分已不能食用。GSE處理組色澤評(píng)分較低，由于GSE為黃色粉末，加入樣品后樣品整體呈微黃色，且添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)越高、黃色越深，同時(shí)處理組的氣味評(píng)分也較低，米酒特有香氣較快散失，但滋味部分比對(duì)照組的評(píng)分普遍高，口感保持度較好，也印證了酸度和糖度的變化。從整體看，在保藏期15 d內(nèi)，整體感官評(píng)分GSE處理組的評(píng)分高于對(duì)照組，其中質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.05%和0.10%的GSE保鮮效果較好［12］。

表6　感官評(píng)定結(jié)果

4　結(jié)論

霉菌是醪糟生產(chǎn)的主要糖化發(fā)酵劑。霉菌不形成孢子囊孢子，依靠大量的菌絲進(jìn)行增殖，生長過程中產(chǎn)生大量的蛋白酶、糖化酶、液化酶以及酒化酶，生成大量的營養(yǎng)成分和形成醪糟獨(dú)特的風(fēng)味。醪糟培養(yǎng)過程中，酵母菌是主要的酒化發(fā)酵劑。從醪糟成品中分離出來的主要是酵母菌，經(jīng)過鑒定為釀酒酵母。在發(fā)酵中期，伴隨霉菌分解淀粉產(chǎn)生大量酵母菌，到后期則占絕對(duì)優(yōu)勢(shì)［13］。

本試驗(yàn)通過對(duì)醪糟樣品的菌落總數(shù)、真菌數(shù)、pH值、糖度以及感官評(píng)定的測(cè)定，可以得出試驗(yàn)組比對(duì)照組的樣品在保藏期內(nèi)整體品質(zhì)較好，且有明顯的發(fā)酵菌種優(yōu)勢(shì)，GSE起到一定的防腐保鮮作用。通過0.05%GSE，0.10%GSE和0.15%GSE處理的樣品保鮮效果相比較得出，經(jīng)0.10%GSE處理的樣品保藏后期pH值和糖度最高，且感官評(píng)定總分最高，綜合分析得出GSE對(duì)醪糟保藏期有較好的影響。

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Effect of Grapefruit Seed Extract on Preserving Quality and Microbial Flora of Rice Wine

YAO Yuchen，LV Xin，ZHOU Yuan，LIANG Mingwei，WANG Zhenmeng，DU Ruoxi，YE Meng，*LIU Bianfang
（College of Food Science and Engineering，Northwest A&F University，Yangling，Shannxi 712100，China）

The rice wine is a kind of rich nutrition and unique flavor food.Grapefruit seed extract（GSE）is a broad spectrum antibiotics for bacteria，fungi and fungicide and it should have very good effect on food preservation.Study on the effect of grapefruit seed extract on preserving quality and microbial flora of rice wine.After adding different concentrations of GSE in the low temperature preservation rice wine，test its flora change including yeast，mold and other microorganism.Test the sugar concentration，alcohol concentration and other physical and chemical index.Use sensory evaluation method to assess the rice wine with grapefruit seed extract.Reveal the function of GSE on preservation of rice wine and provide theoretical basis for the further development of novel food preservatives.

rice wine；grapefruit seed extract；microorganism；preservation

TS201.2

A

10.16693/j.cnki.1671-9646（X）.2016.07.038

1671-9646（2016）07b-0030-05

2016-06-04

中國博士后基金項(xiàng)目（K308021301）；大學(xué)生科技創(chuàng)新項(xiàng)目（2014107）。

姚宇晨（1995— ），女，在讀本科，研究方向?yàn)槭称焚|(zhì)量與安全。

劉變芳（1975— ），女，博士，副教授，研究方向?yàn)槭称肺⑸铩?/p>