中藥多糖對免疫抑制小鼠T細胞亞群影響的差異研究*

羅　霞，胡明華，馬方勵，溫如燕，鄭彥懿，周　聯

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中藥多糖對免疫抑制小鼠T細胞亞群影響的差異研究*

羅霞，胡明華，馬方勵，溫如燕，鄭彥懿，周聯*

目的比較巴戟天多糖（BJT）、酒黃精多糖（JHJ）、淫羊藿多糖（YYH）、人參多糖（RS）、黃芪多糖（HQ）、何首烏多糖（HSW）、生地多糖（SD）、枸杞多糖（GQ）對免疫抑制小鼠T細胞亞型影響的差異。方法采用環磷酰胺腹腔注射制成免疫抑制小鼠模型，通過流式細胞技術（flow cytometry，FCM）檢測T細胞比例及分型。結果給予環磷酰胺后，與正常組比小鼠外周血中CD3+T細胞比值明顯升高（P＜0.01），YYH，高劑量HQ，低、高劑量RS、HSW、SD、GQ多糖對CD3+T細胞比值具有恢復作用（P＜0.05）；多糖對環磷酰胺所致Th1/Th2平衡失調具有恢復作用，其中YYH低劑量組，RS、HQ、JHJ、GQ低、高劑量組，HSW、SD高劑量組與模型組比較，差異具有統計學意義（P＜0.05）；而JHJ、GQ低、高劑量，HSW、SD高劑量多糖對Th2的影響較明顯；此外，低、高劑量BJT、YYH、RS、GQ多糖對環磷酰胺所致Treg比例減少有恢復作用，與模型相比差異具有統計學意義（P＜0.05或P＜0.01）。結論補益類中草藥多糖具有調節免疫系統平衡的作用，在這一過程中，性味不同中藥來源的多糖可能通過作用于不同的免疫細胞起作用，滋補陰血中藥的多糖免疫調節活性主要偏向于Th2細胞，溫補陽氣中藥的多糖對Treg細胞作用較明顯。

中藥多糖；免疫抑制；T細胞亞群

［Abstract］ObjectiveTo compare the differences of morinda polysaccharide（BJT），wine sibiricum（JHJ），epimedium（YYH），ginseng polysaccharides（RS），astragalus polysaccharide（HQ），polygonum polysaccharide（HSW），habitatpolysaccharide（SD），andlyciumbarbarumpolysaccharide（GQ）inaffectingonTcellsubsetin immunosuppressed mouse.MethodsImmunosuppressed mice model was made by intraperitoneal injection of cyclophosphamide，the ratio and subtype of T cell were detected by flow cytometry（FCM）.ResultsAfter administration of cyclophosphamide，the ratio of CD3 cells in peripheral blood in mice was significantly higher（P＜0.01）；compared with the control group，low dose of YYH，high dose of HQ，low and high dose polysaccharide of RS，HSW，SD，GQ had a recovery ratio effect on CD3 cell（P＜0.05）；polysaccharides had recovery ratio effect on Th1/Th2 imbalance induced bycyclophosphamide，which the difference was statistically significant in low and high dose polysaccharide of YYH，RS，HQ，JHJ，GQ，high dose polysaccharide of HSW，SD compared with the model（P＜0.05）；however，low and high dose polysaccharide of JHJ，GQ，high dose polysaccharide of HSW，SD had an obvious effect on Th2；in addition，low and high dose polysaccharide of BJT，YYH，RS，GQ had a recovery ratio effect on Treg induced by cyclophosphamide，compared with the model group，the difference was statistically significant（P＜0.05，or P＜0.01）.ConclusionTonic Chinese herb polysaccharides have effect of regulating the balance of immune system，in this process，the function of polysaccharide derived from Chinese medicine with differentproperties and taste reflected in effecting on difference immune cell，and the immunoregulatory activity of polysaccharides derived from Chinese medicine with nourishing Yin and blood is mainly related to Th2 cells，in addition，the polysaccharides derived from Chinese medicine with warming Yang-qi have obvious effect on Treg cell.

［Key words］Polysaccharide；Immunosuppress；T-cell subset

性味是中藥的重要屬性和用藥基礎，基于中藥多糖HPLC圖譜的寒熱屬性分析發現［1］，中藥多糖成分與其寒熱藥性存在相關性，中藥多糖成分在一定程度上可以反映其性味。多糖不僅參與細胞的生命活動，也是機體的結構物質。作為中藥的主要活性成分之一，在中藥發揮調節免疫功能方面尤為重要。由此衍生出來的抗腫瘤、抗炎、抗病毒，以及抗氧化等藥理作用中，不同中藥提取的多糖不盡相同［2，3］。此外，也發現部分多糖的免疫抑制作用［4］。由此可見，中藥多糖生物學活性的差異與其來源有關。鑒于此，本研究選擇了部分滋陰和補陽中藥提取的多糖，通過免疫抑制小鼠模型，觀察不同性味來源中藥的多糖成分對T細胞亞群的影響，以探究不同中藥性味在免疫活性上的差異。

1　材料與方法

1.1實驗動物及分組SPF級BALB/c小鼠，體重18～22 g，雌雄各半，由廣東省醫學實驗動物中心提供。隨機分為：空白對照組；免疫抑制模型組；巴戟天多糖低、高（BJTL、BJTH）劑量組；酒黃精多糖低、高（JHJL、JHJH）劑量組；淫羊藿多糖低、高（YYHL、YYHH）劑量組；人參多糖低、高（RSL、RSH）劑量組；黃芪多糖低、高（HQL、HQH）劑量組；何首烏多糖低、高（HSWL、HSWH）劑量組；生地多糖低、高（SDL、SDH）劑量組；枸杞多糖低、高（GQL、GQH）劑量組。以上各組每組動物10只。

1.2主要試劑及儀器環磷酰胺：山西普德藥業股份有限公司，批號04131204；CD3-FITC：Biolegend公司產品，批號B172735；CD4-PE：BioLegend公司產品，批號B180856；CD8a-PEcy5：BioLegend公司產品，批號B187949；CD69-PE：eBioscience公司產品，批號：E01331-1631。IL-4-PE：Biolegend公司產品，批號：B172983。INF-γ-FITC：Biolegend公司產品，批號：B162926。Treg&kit：eBioscience公司產品，批號E09666-1646。MCO-20AIC型二氧化碳培養箱：日本SANYO公司；酶標儀：美國THERMO公司；FACSCantoⅡ型流式細胞儀：美國BD公司。

1.3實驗方法

1.3.1動物模型制作免疫抑制小鼠模型采用腹腔注射環磷酰胺40 mg/kg，連續2 d，并于末次注射給藥后第5天測定指標。以成人口服的等效劑量為低劑量（表1），等效劑量的2倍為高劑量，每天按0.2 ml/10 g體重灌胃給藥1次，連續20 d，空白對照組給予等體積蒸餾水。

1.3.2不同多糖對CD3+、CD4+、CD8+T細胞的影響摘眼球取小鼠眼眶靜脈血于肝素鈉抗凝管中搖勻，用淋巴細胞分離液分離淋巴細胞，調整細胞濃度106個/ml，分別加入CD3-FITC、CD4-PE、CD8-PEcy5染色后于流式細胞儀檢測。

1.3.3不同多糖對Th1、Th2及其比例的影響摘眼球取小鼠眼眶靜脈血于肝素鈉抗凝管中搖勻，用淋巴細胞分離液分離淋巴細胞，調整細胞濃度為2× 106/ml，按200 μl/孔接種于96孔版。加入8 μl（25×）PMA/Ionomycin混合液，振蕩混勻后，于37℃，5%CO2培養箱中孵育4 h。孵育完成后用PBS洗細胞，去上清后，用剩余PBS重懸，將其中一樣品管分為A、B，將B管作為樣品管的同型對照管。每管加入100 μl Fix&Perm中的Reagent A（固定液），混勻，室溫避光孵育15 min。加2 ml PBS，300 g，4℃，離心10 min去上清后，用剩余PBS重懸，加入100 μl Fix&Perm中的Reagent B（破膜液），同時破膜質控管加入Anti-mouse CD69-PE，樣品同型對照管加入Mouse IgG1κIsotype Control-FITC，其余樣品管加入Anti-mouse INF-γ-FITC以及Anti-mouse IL-4-PE。室溫避光孵育40 min。加2 ml PBS，300 g，4℃，離心10 min上清，各加入400 μl PBS重懸，上機檢測。

1.3.4不同多糖對調節性T細胞（regulatory T，Treg）的影響摘眼球取小鼠眼眶靜脈血于肝素鈉抗凝管中搖勻，用淋巴細胞分離液分離淋巴細胞，調整細胞濃度為2×106/ml。取制備好的100 μl細胞懸液于流式管中，加入Anti-mouse CD4-FITC和Anti-mouse CD25-APC。4℃孵育30 min。加入2 ml預冷的PBS重懸，300 g，4℃，離心10 min。去上清，重懸細胞后加入1 ml新鮮配制的固定/破膜工作液，并再次旋渦混勻。室溫避光孵育30 min后，加入2 ml破膜緩沖液工作液，300 g，4℃，離心10 min。去上清液，用剩余液輕輕振蕩后，加入Anti-mouse Foxp3-PE，同型對照管加Anti-mouse Rat lgG2a-PE，室溫避光孵育30 min。加入2 ml破膜緩沖工作液洗滌細胞，離心后棄去上清，加200 μl Flow Cytometry Staining Buffer重懸細胞，上機檢測并分析。

1.4統計學分析數據以“均數±標準差”表示，采用SPSS17.0統計軟件進行分析，組間比較采用單因素方差分析。P＜0.05為差異具有統計學意義。

2　結果

2.18種多糖對免疫抑制小鼠CD3+CD4+、CD3+CD8+及其比值的影響給予環磷酰胺后，小鼠外周血中CD3+細胞比值明顯升高，與文獻報道一致［5］；與空白對照組比較，差異有統計學意義（P＜0.01）。在此模型基礎上，給予供試多糖，CD3+細胞比值升高，其中YYHL、RSLH、HQH、HSWLH、SDLH、GQLH與模型組比較，差異具有統計學意義（P＜0.05）。然而，環磷酰胺對小鼠外周血中CD4+、CD8+T細胞比例及其比值沒有顯著影響，給予不同多糖后，也沒有明顯變化（表1）。

2.28種多糖對免疫抑制小鼠Th1、Th2的影響給予環磷酰胺后，小鼠外周血中Th1/Th2細胞比值明顯降低，表現為向Th2漂移，Th1/Th2細胞平衡被打破，與文獻報道一致［6］。這一差異與空白對照組比較有極顯著的統計學意義（P＜0.01）。在此模型基礎上，給予供試多糖，Th1/Th2細胞比值升高，二者的平衡在各多糖組均有不同程度地恢復，其中YYHH、RSLH、HQLH、JHJLH、HSWH、SDH、GQLH與模型組比較，差異具有統計學意義（P＜0.05，或P＜0.01）。進一步比較發現，相對Th1細胞而言，JHJLH、HSWH、SDH、GQLH對Th2的影響更為顯著，而YYHH、RSLH、HQLH則對Th1、Th2的影響沒有明顯區別（表2）。

表1　8種多糖對免疫抑制小鼠CD3+CD4+、CD3+CD8+及其比值的影響（x±s，n=8）

表2　8種多糖對免疫抑制小鼠Th1、Th2的影響（±s，n=8）

表2　8種多糖對免疫抑制小鼠Th1、Th2的影響（±s，n=8）

注：與空白對照組比較，△P＜0.05，▲P＜0.01；與模型組比較，*P＜0.05，#P＜0.01。

組別劑量（mg/kg）IFN-γ（%）IL-4（%）Th1/Th2（IFN-γ/IL-4）空白對照等體積蒸餾水2.59±0.700.40±0.136.74±1.47模型等體積蒸餾水2.64±0.600.55±0.16△4.90±0.67▲BJTL801.73±0.21#0.33±0.01*5.42±1.27 BJTH1601.50±0.51#0.32±0.13#5.25±2.09 YYHL501.52±0.23*0.30±0.10*5.53±2.10 YYHH1001.50±0.47*0.26±0.08*5.93±1.27*RSL1602.25±0.770.43±0.215.70±1.05*RSH3202.35±0.430.43±0.135.89±1.53*HQL1502.36±0.380.43±0.105.68±1.11*HQH3002.32±0.530.40±0.226.69±2.38*JHJL2001.65±0.89*0.29±0.15#5.23±2.14*JHJH4001.63±0.34*0.26±0.07#6.50±1.69#HSWL1602.46±0.710.46±0.175.61±0.99 HSWH3203.00±0.420.50±0.156.48±2.04*SDL2002.20±0.400.44±0.074.96±0.52 SDH4002.10±0.430.36±0.08*6.00±1.21*GQL1601.93±0.48*0.34±0.05#5.57±0.68*GQH3202.11±0.430.36±0.13*6.33±1.53*

2.38種多糖對免疫抑制小鼠Treg細胞的影響

給予環磷酰胺后，小鼠外周血中Treg細胞比值明顯降低，這一差異與空白對照組比較有統計學意義（P＜0.01），與文獻報道一致［7，8］。在此模型基礎上，給予供試多糖后發現，Treg細胞比值升高，其中BJTLH、YYHLH、RSLH、GQLH與模型組比較，差異具有統計學意義（P＜0.05，或P＜0.01）。見表3。

3　討論

成熟的T細胞是一個復雜的異質性群體，根據其表面分子表達的差異可以分成不同的亞型。其中，根據CD分子表達不同可將成熟T細胞分為CD4+T細胞和CD8+T細胞；CD4+T細胞又可依據其產生細胞因子的不同又分為Th1和Th2細胞，以及Treg和Th17細胞等。T細胞不同的亞型的功能各異，正常情況下，機體各亞群數量處于動態平衡狀態，一旦平衡被打破，可能引發疾病，這也是中藥多糖調節免疫功能的物質基礎［9，10］。與多糖免疫調節相關研究較多的亞群主要包括CD4+T、CD8+T、Th1、Th2以及Treg細胞等。

CD4+T細胞識別MHCⅡ類分子提呈的抗原肽，激活后通過分泌細胞因子發揮效應，起誘導和輔助作用；CD8+識別靶細胞表面抗原肽-MHCI類分子復合物，活化后具有直接殺傷效應。CD4+與CD8+T細胞亞群間的平衡，對維持機體的免疫功能至關重要。本實驗中給予環磷酰胺后，T細胞比例明顯升高，這與其作用機制有關。環磷酰胺以抑制B細胞為主，很自然地表現為T細胞比例的升高，由此并結合實驗中小鼠的體重、臟器指數等（與空白對照組相比明顯降低，數據未列出）變化可以看出，本實驗環磷酰胺所致免疫抑制模型造模成功。環磷酰胺對CD4+T、CD8+T細胞的比例及其比值影響不大，給予多糖后，對T細胞比例均有的明顯恢復作用，說明其對環磷酰胺所致的免疫抑制具有改善作用。

表38　種多糖對免疫抑制小鼠Treg細胞的影響（±s，n=8）

表38　種多糖對免疫抑制小鼠Treg細胞的影響（±s，n=8）

注：與空白對照組比較，▲P＜0.01；與模型組比較，*P＜0.05，#P＜0.01

組別劑量（mg/kg）CD4+CD25+Foxp3+（%）空白對照等體積蒸餾水4.79±0.63模型等體積蒸餾水3.26±0.45▲BJTL804.33±0.83#BJTH1604.35±0.77#YYHL504.41±1.11*YYHH1004.34±0.89*RSL1604.43±0.67#RSH3204.44±0.64#HQL1503.57±0.75 HQH3003.40±0.44 JHJL2003.91±0.81 JHJH4003.46±0.82 HSWL1603.69±0.82 HSWH3203.27±0.49 SDL2003.57±0.58 SDH4003.93±0.54 GQL1604.61±0.77#GQH3203.71±0.36*

Th1細胞主要介導細胞免疫應答，促進細胞毒T細胞（CTL）的殺傷作用，激活巨噬細胞殺滅細胞內病原體（包括病毒和細菌）以及輔助B細胞產生與吞噬作用有關的抗體等，其功能亢進是引發器官特異性自身免疫疾病及急性排斥反應的重要原因［11］；Th2細胞主要參與體液免疫，抵御細胞外病原體和介導過敏反應，輔助IgG亞類轉化為IgG1、IgE和IgA，負責非吞噬作用的宿主防御功能。Th1/Th2細胞的平衡狀態是免疫功能的重要考察指標，兩種細胞通過細胞因子作用的相互促進和制約使機體處于免疫應答的動態平衡，既能清除抗原性異物，又不至于損傷自身組織。本實驗環磷酰胺導致免疫抑制時，其Th1/Th2平衡明顯被打破，給予多糖后，小鼠外周血Th1/Th2平衡明顯恢復，YYHH對Th1細胞較明顯的作用，JHJLH、HSWH、SDH、GQLH對Th2細胞的作用顯著。以上研究說明，不同中藥來源的多糖在調節免疫平衡時對Th1、Th2細胞的作用有差異。

調節性T細胞具有免疫負調節功能，在維持自身耐受和避免罹患自身免疫性疾病中起著極其重要的作用。天然的調節性T細胞（即nTreg）主要表達CD4+、CD25以及其特征性標志Foxp3分子，通過這幾種分子可以鑒定nTreg［12］。在環磷酰胺致免疫抑制小鼠模型中，其外周血Treg細胞明顯減少，BJTLH、YYHLH、RSLH和GQLH對小鼠Treg細胞比例的明顯恢復表明這些多糖有助于維持機體自身穩定。

多糖JHJ、HSW、SD、GQ來源于中藥黃精、何首烏、生地、枸杞子，藥性平和，均具有滋補陰血，扶正補虛的功效；多糖BJT、YYH、RS來源于中藥巴戟天、淫羊藿、人參，藥性甘溫，均具有溫補益陽氣的功效。前者在恢復環磷酰胺免疫抑制小鼠Th1/Th2平衡的過程中，對Th2細胞的作用顯著；后者對環磷酰胺所致Treg減少恢復明顯。通過本次實驗，結合多糖為中藥性味主要的物質基礎這一特點可以看出，這四味具有滋補陰血作用的中藥來源的多糖免疫調節活性主要與其調節Th2細胞有關；另外四味相對于滋補陰血作用中藥來源的多糖，具有溫補陽氣作用中藥來源的多糖則偏重于對Treg細胞作用。然而本研究只從免疫平衡角度研究中藥性味分類，僅僅是一個初步探討，如若總結比較完善的規律，還需要進行更大樣本量的研究。

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［本文編輯：劉一洋］

Different impacts of polysaccharides from Chinese materia medica on T－cell subsets in immuno-suppressed mice

LUO Xia①，HU Ming-hua，MA Fang-li，et al.①School of Chinese Materia Medica，Guangzhou University of TCM and Materia Medica，Guangzhou，Guangdong 510006，China

R284.1

A

10.14172/j.issn1671-4008.2016.07.019

廣東省教育廳科研項目基金資助（2013LYM0014）

510006廣東廣州，廣州中醫藥大學中藥學院（羅霞，溫如燕，鄭彥懿，周聯）；510623廣東廣州，無限極（中國）有限公司（胡明華，馬方勵）

周聯，Email：zl@gzucm.edu.cn