首批肝素抗Ⅱa因子效價測定用國家標準品協作標定

李京，王悅，范慧紅

(中國食品藥品檢定研究院，北京 100050)

首批肝素抗Ⅱa因子效價測定用國家標準品協作標定

李京，王悅，范慧紅Δ

(中國食品藥品檢定研究院，北京 100050)

目的建立肝素抗Ⅱa因子效價測定用國家標準品。方法通過理化分析及效價測定，篩選出適合的標準品原料，溶解、分裝、凍干后制備成肝素國家標準物質待標品(140817-201501)。以第6次肝素國際標準品07/328為標準品，分別采用《中國藥典》2015年版和2010年版肝素鈉效價測定方法測定待標品的抗Ⅱa因子效價、抗Ⅹa因子效價和抗凝效價，由13個實驗室協作標定。為考察肝素國家標準品的延續性，上一批肝素鈉國家標準品(150509-200912)在協作標定中使用。結果效價標化結果經統計學分析，實驗室內及實驗室間的幾何變異系數(geometric coefficient of variation， gcv)均小于10%；以第6次肝素國際標準品07/328作為標準品，待標品抗Ⅱa因子效價為2011 IU/安瓿，抗Ⅹa因子效價為1998 IU/安瓿，抗凝效價為1992 IU/安瓿；對各實驗室抗Ⅱa因子效價、抗Ⅹa因子效價、抗凝效價幾何均值進行單因素方差分析，結果沒有顯著性差異；各實驗室使用國際標準品測定待標品抗Ⅱa因子效價和使用上一批肝素鈉國家標準品(150509-200912)測定的待標品抗凝效價幾何均值進行welch檢驗，結果沒有顯著性差異，肝素國家標準品的延續性良好。結論經國家藥品標準物質委員會審定后批準，待標品(140817-201501)用作肝素效價測定用國家標準品，效價為2011 IU/安瓿。

肝素；國家標準品；效價測定；協作標定；生色底物法；抗Ⅱa因子效價；抗Ⅹa因子效價； 抗凝效價

《中國藥典》2015年版肝素鈉、肝素鈣效價測定方法由2010年版收載的血液凝固法測定抗凝效價改為生色底物法測定抗Ⅱa因子效價，因此急需建立肝素抗Ⅱa因子效價測定用國家標準品。傳統的肝素效價測定方法是血液凝固法[1]， 雖然能全面反映樣品的抗凝活性，但專屬性不強，在2009年肝素鈉注射液全國評價性抽驗中發現[2]，有部分樣品抗凝活性明顯高于抗IIa因子活性，有關物質檢查結果顯示，上述樣品的類肝素雜質超標。生色底物法[3]是肝素與純化的凝血因子形成復合物，該復合物可以定量水解特異性生色底物，方法專屬性強、操作簡便，國際上已有使用生色底物法測定肝素效價替代血液凝固法的趨勢。2009年第六次肝素國際標準品協作標定中[4]，世界衛生組織(World Health Organization，WHO)已將抗Ⅱa因子和抗Ⅹa因子活性測定方法作為推薦使用的標定方法；美國藥典(The United States Pharmacopeia，USP)于2010年USP33版中收載肝素抗Ⅱa因子效價測定方法[5]替代原來的羊血漿法[6]；歐洲藥典(European pharmacopoeia，EP)于2015年EP8.3版中收載肝素抗Ⅱa因子效價測定方法[7]替代原來的活化部分凝血酶時間法(activated partial thrombin time，APTT)[8]；中國藥典(Chinese pharmacopeia，CHP)于2015年CHP2015版中收載肝素抗Ⅱa因子效價測定方法[9]替代原來的血液凝固法[1]。

原有的肝素鈉國家標準品(150509-200912，197 IU/mg)是采用血液凝固法[1]賦值的，為保證CHP2015版的順利執行，決定換批制備新的肝素國家標準品(140817-201501)，采用抗IIa因子效價測定法[9]賦值。中國食品藥品檢定研究院(中檢院)通過理化分析及效價測定，篩選出適合的標準品原料，溶解、分裝、凍干后制備成肝素國家標準物質待標品(140817-201501)。以第6次肝素國際標準品07/328為標準品，分別采用CHP2015和CHP2010年肝素鈉效價測定方法測定待標品的抗Ⅱa因子效價、抗Ⅹa因子效價和抗凝效價，由13個實驗室協作標定。為考察肝素國家標準品的延續性，上一批肝素鈉國家標準品(150509-200912)在協作標定中使用。下面重點介紹協作標定的結果。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 國際標準品：WHO第六次肝素國際標準品，2009年建立，批號07/328，標示效價為2145 IU/安瓿，凍干品，包裝為玻璃安瓿，-20 ℃避光保存，每個實驗室1支。

1.1.2 國家標準品：肝素鈉國家標準品，2009年建立，批號150509-200912，標示效價為197 IU/mg，白色粉末，包裝為硬質玻璃管，避光冷藏保存，每個實驗室1支。

1.1.3 待標品：肝素國家標準品待標品，批號140817-201501，估計效價為2 000 IU/安瓿，凍干品，包裝為玻璃安瓿，-20 ℃避光保存，每個實驗室4支。

1.2 方法

1.2.1 納入實驗室：在全國范圍內作問卷調查，從有意愿參加協作研究的實驗室中挑選了13家經驗豐富的實驗室，其中5家是藥檢所(中國食品藥品檢定研究院、上海市食品藥品檢驗所、江蘇省食品藥品監督檢驗研究院、廣東省食品藥品檢驗所、天津市藥品檢驗所)，8家為制藥企業(河北常山生化藥業股份有限公司QC實驗室、河北常山生化藥業股份有限公司研發實驗室、常州千紅生化制藥股份有限公司、南京健友生化制藥股份有限公司、煙臺東誠藥業集團股份有限公司、東營天東制藥有限公司、深圳市海普瑞藥業股份有限公司、成都市海通藥業有限公司)。

1.2.2 抗IIa因子效價：CHP2015二部肝素鈉效價測定項下抗IIa因子效價測定法[9]。

1.2.3 抗Xa因子效價：CHP2015二部肝素鈉效價測定項下抗Xa因子效價測定法[9]。

1.2.4 抗凝效價：CHP2010二部附錄XII D肝素生物測定法[1]。

1.2.5 具體過程：每個實驗室分別以國際標準品和國家標準品對4支待標品進行抗IIa因子、抗Хa因子、抗凝效價測定，提供4個有效數據。為考察日間差異，上述3種實驗方法的4次測定應分別在4 d完成，填寫結果報告表，報告實驗所用試劑、儀器等基本信息，原始數據及效價計算結果。

要求每次測定均應將標準品(S)和供試品(T)稀釋成4個或3個濃度，每個濃度平行作2管。以反應值(A)與濃度(C)的對數值作線性回歸。基于量反應平行線法的測定原理[10]，S和T的劑量與反應呈直線關系，并且S和T兩條直線應平行。要首先對實驗結果進行可靠性測驗，回歸關系應非常顯著(P<0.01)，偏離平行不顯著(P>0.05)，二次曲線、反向二次曲線不顯著(P>0.05)，實驗可靠性測驗通過者計算效價(PT)和95%概率水平的可信限率(FL%)。

對每個實驗室提供的4個效價估計值進行合并計算，得到每個實驗室效價測定的幾何平均值，再對所有實驗室的幾何平均值匯總進行合并計算，得到所有實驗室效價測定的幾何平均值及95%均值置信區間。實驗室內及實驗室間的測定差異用幾何變異系數(geometric coefficient of variation，gcv)表示，gcv的計算參照文獻[11]中的公式。合并計算的方法與實驗誤差的表示參照第六次肝素國際標準品的效價計算方法[4]。

1.2.6 標準品使用說明：國際標準品和國家標準品按標準品附帶說明書使用，待標品參考國際標準品說明書使用。標準品和待標品可復溶后制成母液分裝保存，每次實驗稀釋液應新鮮制備。

1.3 統計學方法 除9號實驗室使用了歐洲藥典生物統計軟件CombiStats(版本5.0)外，其余實驗室均使用了中國藥典生物檢定統計程序BS2000(中國食品藥品檢定研究院編制)進行數據統計及效價計算。

2 結果

2.1 各實驗室使用的試劑及儀器 13個實驗室進行抗Xa因子和抗IIa因子效價測定，11個實驗室進行了抗凝效價測定。各實驗室抗Xa因子、抗IIa因子效價及抗凝效價測定使用的試劑及儀器見表1、表2。 從表1、表2的結果可以看出，各實驗室使用了各自常用的試劑及儀器，來源、規格及生產廠商都不盡相同。在抗Xa因子、抗IIa因子效價測定實驗中：除1個實驗室使用人源的Xa因子外，其余實驗室使用的Xa因子是牛源的；4個實驗室使用了牛源FIIa，8個實驗室使用人源IIa因子；所有實驗室使用了人源ATIII；除兩個實驗室外，大部分實驗室使用了Chromogenix公司的發色底物；在儀器方面，7個實驗室使用了酶標儀，4個實驗室使用分光光度計，2個實驗室使用血凝儀。在抗凝效價測定實驗中，有4個實驗室使用血漿復鈣法，2個實驗室使用兔全血法，4個實驗室使用APTT法，1個實驗室使用USP羊血漿法；使用的底物包括兔血漿、兔全血、豬血漿、羊血漿；終點觀察方法，4個實驗室使用血凝儀、8個實驗室使用肉眼觀察。從實驗結果看(見圖1)，不同廠商、不同來源的試劑、不同的儀器均可以使用，對效價測定沒有顯著影響。在以往多次的肝素與低分子肝素效價國際、國內協作標定中[4，12-13]，各實驗室也均使用了多種試劑及儀器，結果沒有顯著差異。

表1 抗Xa因子、抗IIa因子效價測定使用試劑及儀器Tab.1 The reagents and instruments used in anti-FXa and anti-FIIa chromogenic assays

B和H代表試劑的動物來源，B為牛源，H為人源。括號中字母代表試劑生產廠商，A: 北京艾德豪克國際技術有限公司，C：Chromogenix 公司，H：HYPHEN BioMed公司, HN:湖南一格制藥有限公司，N：中國食品藥品檢定研究院，S：Sigma-Aldrich 公司。 “/”為企業未提供數據

表2 抗凝效價測定使用試劑及儀器

APTT法：活化部分凝血活酶時間測定法。括號中字母代表試劑生產廠商，U：unknown，N:南京新百藥業有限公司，S：Siemens公司，ST：Stago公司，SD：山東蒼山向陽生化助劑廠，G：廣東蕊特生物科技有限公司;SH:上海銘睿生物科技有限公司

2.2 各實驗室提交數據統計結果 各實驗室提交的抗Xa因子效價測定結果共52個，抗IIa因子效價測定結果共52個，抗凝效價測定結果88個，均通過了可靠性測驗，底物法、兔全血法APTT法FL%小于10%，血漿復鈣法FL%小于5%，所有數據均為有效數據，可以參與合并計算。

2.3 抗IIa因子效價測定結果 各實驗室抗IIa因子效價測定結果見表3。

表3 以IS 07/328標定肝素標準品(140817-201501)抗IIa因子效價結果(IU/安瓿)Tab.3 The anti-FIIa potency of heparin national standard(140817-201501) determined by heparin international standard(07/328)(IU/ampoule)

帶*數據為離群值，排除后計算；gcv為幾何變異系數

2.4 抗Xa因子效價測定結果 各實驗室抗Xa因子效價測定結果見表4。

表4 以IS 07/328標定肝素標準品(140817-201501)抗Xa因子效價結果(IU/安瓿)Tab.4 The anti-FXa potency of heparin national standard(140817-201501) determined by heparin international standard(07/328) (IU/ampoule)

帶*數據為離群值，排除后計算；gcv為幾何變異系數

2.5 抗凝效價測定結果 各實驗室抗凝效價測定結果，見表5、表6。

表5 以IS 07/328標定肝素標準品(140817-201501)抗凝效價結果(IU/安瓿)Tab.5 The anticoagulation potency of heparin national standard(140817-201501) determined by heparin international standard(07/328) (IU/ampoule)

gcv為幾何變異系數

表6 以上一批肝素鈉國家標準品((150509-200912)標定肝素標準品(140817-201501)抗凝效價結果(IU/安瓿)Tab.6 The anticoagulation potency of heparin national standard(140817-201501) determined by last heparin standard(150509-200912) (IU/ampoule)

gcv為幾何變異系數

2.6 離群值處理結果 4號實驗室安瓿4的抗IIa因子效價結果(見表3)和抗Xa因子效價結果(見表4)明顯離群，但安瓿4的抗凝效價結果(見表5)在正常范圍內，因此將4號實驗室安瓿4的抗IIa因子效價和抗IIa因子效價作為離群值處理，不參與合并計算。

2.7 抗Xa因子與抗IIa因子效價比 肝素的抗Xa因子與抗IIa因子效價比應在0.9～1.1范圍內，這是肝素活性的重要特征，肝素標準品(140817-201501)的抗Xa因子與抗IIa因子效價比值為1.0，符合規定。

3 討論

3.1 方法比較 使用肝素國際標準品(07/328)對肝素標準品(140817-201501)進行抗IIa因子效價、抗Xa因子效價、抗凝效價測定，圖1為3種方法測定結果的頻數圖，圖2為箱線圖。使用JMP10統計軟件對各實驗室幾何均值進行單因子方差分析，F值為0.4554(大于0.05)，結果沒有顯著性差異。3種測定方法中，抗IIa因子測定的誤差較大，這是因為抗IIa因子的顯色濃度范圍較窄，反應濃度較低，加大了實驗操作的難度。

圖1 肝素國家標準品(140817-201501)效價測定結果頻數圖A-抗IIa因子效價，B-抗Xa因子效價，C-抗凝效價以肝素國際標準品(07/328)標定，圖中每一個方塊表示一次獨立的測定結果，方塊中的數字為實驗室代號Fig.1 Frequency distribution of potency of national standard for heparin(140817-201501),A- anti-FIIa potency, B-anti-FXa potency, C-anticoagulation potency The potencies were determined against international standard of heparin(07/328).Each square represents an individual assay estimate. The number in the square denotes the laboratory code

圖2 以肝素國際標準品(07/328)為標準品，采用不同方法測定的肝素國家標準品(140817-201501)效價廂線圖Fig.2 Box plot of the potency of national standard for heparin(140817-201501)by different methods ,using heparin international standard(07/328) as standard

3.2 肝素國家標準品延續性考察 各實驗室使用國際標準品測定肝素標準品(140817-201501)抗Ⅱa因子效價和使用上一批肝素鈉國家標準品(150509-200912)測定肝素標準品(140817-201501)抗凝效價的幾何均值進行welch檢驗，結果沒有顯著性差異，肝素國家標準品的延續性良好。圖3為2種標準品測定肝素標準品(140817-201501)效價的箱線圖。使用上一批肝素鈉國家標準品(150509-200912)測定抗凝效價與使用國際標準品(07/328)測定抗IIa因子效價比較，實驗間誤差較大，原因可能是因為上一批肝素鈉國家標準品為硬質玻璃管包裝的固體粉末，使用時需稱重，國際標準品為安瓿包裝凍干品，使用時為整支溶解，稱重后配制溶液的誤差較大。

圖3 以國際標準品測定抗IIa因子效價與以上批國家標準品測定的抗凝效價Fig.3 Box plot of the anti-FIIa potency by international standard and the anticoagulation potency by last national standard

3.3 實驗注意事項 有部分實驗室對標準品分裝步驟不太清楚，可參考如下操作：取待分裝標準品1支，放置至室溫，小心開啟安瓿，加水1 mL溶解，放置使充分溶解。用1 mL無菌注射器，取出安瓿中溶液，至25 mL量瓶中。在安瓿中加水1 mL，取出，重復至少8次，每次盡量將安瓿中溶液取盡。將25 mL量瓶加水至刻度，搖勻。將溶液分裝至1.5 mL塑料離心管中，每支1 mL，將分裝后的樣品放在-20 ℃凍存，有效期為3個月。每天實驗時取出1支復溶后使用，復溶后的樣品不能再次凍存。分裝后貯備的標準品溶液濃度不宜過低，應在80 IU/mL以上，濃度過低，標準品的穩定性無法保證。效價測定時的實驗濃度通常在0.05 IU/mL以下，因此需要經過多個稀釋步驟，正確的稀釋步驟十分重要，應盡量保證標準品和供試品采用相同的稀釋步驟。

3.4 標準品穩定性考察 肝素類標準品穩定性較好，國際標準品-20 ℃儲存超過10年[4]。我們對肝素國家標準品(140817-201501)進行了初步穩定性考察，將其置于40 ℃、80%RH的恒溫恒濕箱中，于第5天、第10天分別取樣并存放于-20 ℃冰箱中，再同時進行效價測定，結果與-20 ℃冰箱保存樣品比較，抗FXa效價與抗FIIa效價均在95%均值置信區間內，本品在40 ℃的儲存條件下10 d內都是穩定的，因此本品的運輸條件為常溫，長期儲存溫度為-20 ℃。

3.5 賦值方式 中國藥典2015年版與美國藥典38版肝素標準效價測定方法類似，均以抗IIa因子效價表示肝素效價，同時測定抗Xa因子效價，計算抗Xa因子效價與抗II因子效價比值作為肝素鑒別試驗。美國藥典肝素效價測定用標準品(F0I187)的賦值方式是多個實驗室使用國際標準品測定抗IIa因子效價，對抗IIa因子效價結果合并計算。因此肝素標準品(140817-201501)的賦值方式為采用13個實驗室使用肝素國際標準品(07/328)測定的抗IIa因子效價合并計算。

綜上，我國首批肝素抗IIa因子效價測定用國家標準品經13個實驗室協作標定，結果接近，實驗室間gcv小于10%，本批肝素國家標準品(140817-201501)效價定值為2011 IU/安瓿。2015年版中國藥典肝素鈉、肝素鈣抗IIa因子與抗Xa因子效價測定實驗中，均使用該值作為標準品賦值。

志謝衷心感謝參與協作標定實驗室：上海市食品藥品檢驗所、江蘇省食品藥品監督檢驗研究院、廣東省食品藥品檢驗所、天津市藥品檢驗所、河北常山生化藥業股份有限公司、常州千紅生化制藥股份有限公司、南京健友生化制藥股份有限公司、煙臺東誠藥業集團股份有限公司、東營天東制藥有限公司、深圳市海普瑞藥業股份有限公司、成都市海通藥業有限公司(上述實驗室排序與文中實驗室代號順序不同)。

[1] 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典：二部[S]. 2010年版，北京：中國醫藥科技出版社，2010：附錄118-119.

[2] 李京，王悅，宋玉娟，等. 肝素質量評價與研究[J].中國藥學雜志，2013，48(16)：1412-1418.

[3] 李京，范慧紅. 微量生色底物法測定肝素抗Ⅹa因子和抗Ⅱa因子活性[J].中國生化藥物雜志，2010，31(1)：45-47.

[4] 李京，鄧利娟，李湛軍，等.第六次肝素國際標準品協作標定[J].中國藥學雜志，2010，45(24)：1954-1958.

[5] USP33/NF28[S].2010.

[6] USP32/NF27[S].2009:2552-2554.

[7] EP 8.3[S].2015:4341-4343.

[8] EP 8.0[S].2014:2390-2391.

[9] 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典：二部[S]. 2015年版，北京: 中國醫藥科技出版社，2015：517-519.

[10] 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典：四部[S]. 2015年版，北京: 中國醫藥科技出版社，2015： 182-200.

[11] Kirkwood TBL.Geometric means and measure of dispersion[J].Biometrics,1975,35(10):908-909.

[12] 李京，王悅，范慧紅.第3次低分子肝素國際標準品協作標定[J].藥物分析雜志，2014，34(1)：71-74.

[13] 李京，郝蘇麗，范慧紅，等.第一次低分子量肝素效價測定用國家標準品協作標定[J].2008，22(12)：1077-1080.

(編校：吳茜)

Acollaborativestudytoestablishthenationalstandardforheparinwithanassignedvalueobtainedfromanti-FIIachromogenicmethod

LI Jing, WANG Yue, FAN Hui-HongΔ
(National Institutes for Food and Drug Control, Beijing 100050)

ObjectiveTo establish a national standard for heparin with an assigned value obtained from anti-FIIa chromogenic method.MethodsThrough physical, chemical and biological tests, one batch of heparin sodium was selected to prepare the national standard for heparin assay. The bulk material was dissolved with distilled water, distributed into ampoules and freeze-dried. The candidate sample(140817-201501) was assayed against the 6thinternational standard(07/328). Thirteen laboratories took part in the study. Three methods were used in the study, including anti-FIIa chromogenic assay, anti-FXa chromogenic assay and clot-based plasma assay. For the purpose of the continuity check between subsequent batch of national standard, the current heparin national standard for assay(150509-200912) was also included in the study.ResultsBased on the statistical analysis, the candidate gave low intra- and inter-laboratories variations, geometric coefficient variations were all less than 10%. Against the 6thinternational standard(07/328), Anti-FIIa potency of the candidate sample(140817-201501) was 2011 IU per ampoule, anti-FXa potency was 1998 IU per ampoule, anticoagulation potency was 1992 IU per ampoule. The results between three methods were not significant difference by statistics analysis. The results between international standard(07/328) and national standard(150509-200912) were not significant difference by statistics analysis. The continuity of the national standard of heparin is good.ConclusionAfter the examination of the expert committee on pharmaceutical standardization, the candidate(140817-201501) was approved as the national standard of heparin for assay with an assigned value 2011 IU per ampoule.

heparin; national standard; assay; collaborative study; chromogenic method; anti-FIIa potency; anti-FXa potency; anticoagulation potency

10.3969/j.issn.1005-1678.2016.10.003

李京，女，主任藥師，研究方向：多糖類藥物質量控制，E-mail：lijing317@nifdc.org.cn；范慧紅，通信作者，女，博士，研究員， 研究方向：生化藥物的質量控制，E-mail：shihuayaoshi@126.com。

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