當(dāng)前新發(fā)偽狂犬病的分子流行特點(diǎn)及防控方案

吳成龍胡睿銘,王 滇湯細(xì)彪,（武漢科前生物股份有限公司，湖北武漢 430070；華中農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物疫病診斷中心，湖北武漢 430070）

當(dāng)前新發(fā)偽狂犬病的分子流行特點(diǎn)及防控方案

吳成龍1胡睿銘1,2王 滇1湯細(xì)彪1,2
（1武漢科前生物股份有限公司，湖北武漢 430070；2華中農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物疫病診斷中心，湖北武漢 430070）

豬偽狂犬病（PR）是由偽狂犬病毒（PRV）引起的一種急性傳染病，主要以種豬繁殖障礙、新生仔豬急性死亡、斷奶-育肥豬莫名發(fā)熱和呼吸道癥狀為主要臨床表現(xiàn)，已成為豬場重點(diǎn)防控的病毒性傳染病。20 世紀(jì)80 年代，該病在我國大面積暴發(fā)流行，給國內(nèi)養(yǎng)殖業(yè)帶來嚴(yán)重?fù)p失。隨著偽狂犬病疫苗的廣泛應(yīng)用，該病得到了很好的控制，在國內(nèi)一直處于平息狀態(tài)。但自2011 年以來，豬偽狂犬病卷土重來，先后在全國不同地區(qū)暴發(fā)流行，引起了業(yè)界的廣泛關(guān)注和深刻反思?！皞慰袢《臼欠癜l(fā)生變異或毒力增強(qiáng)”、“豬偽狂犬病防控方案是否出現(xiàn)漏洞”、“傳統(tǒng)疫苗還能不能提供有效保護(hù)”等種種猜測一直在業(yè)內(nèi)流傳，筆者所在實(shí)驗(yàn)室近年來進(jìn)行了大量的研究，并相繼從臨床分離到三十多株偽狂犬病新變異毒株，一些研究結(jié)果和數(shù)據(jù)分析或許為豬偽狂犬病疫情再發(fā)找到了佐證。針對(duì)豬偽狂犬病流行新形勢和發(fā)病新特點(diǎn)，結(jié)合臨床疫情處理和成功防控案例，及時(shí)調(diào)整免疫策略，探尋一種更為有效的偽狂犬病免疫方案，在當(dāng)前變異偽狂犬病陽性感染場或受威脅場推廣應(yīng)用中顯得尤為重要。

偽狂犬病；變異；進(jìn)化樹分析；免疫方案；保護(hù)力

1　豬偽狂犬病的新流行

1.1流行背景

2011 年10 月份，從黃河以北養(yǎng)殖密集區(qū)域開始，疫情從北向南蔓延開來；2012 年3—11 月在華北、華中、華東形成長時(shí)間、大面積的偽狂犬病疫情暴發(fā)流行；2013 年4 月開始，疫情擴(kuò)散至南方多省，以廣東、廣西最為突出；2014 年6 月份以來，云、貴、川、渝等西南地區(qū)部分規(guī)模化豬場偽狂犬病野毒感染率明顯上升（圖1）。根據(jù)華中農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物疫病診斷中心疫情監(jiān)測數(shù)據(jù)，大面積的偽狂犬病暴發(fā)疫情似乎逐漸趨于穩(wěn)定，但偽狂犬gE野毒陽性感染率還在持續(xù)上升，豬場在防控偽狂犬病上壓力巨大，絲毫不能松懈。

圖1　2010—2014年偽狂犬gE野毒陽性感染率統(tǒng)計(jì)（引自華中農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物疫病診斷中心檢測數(shù)據(jù)）

1.2最新臨床表現(xiàn)與病理變化

在此次偽狂犬病疫情流行中，豬偽狂犬病的臨床癥狀出現(xiàn)一些新的表現(xiàn)：母豬妊娠中后期發(fā)生整窩流產(chǎn)、產(chǎn)死胎、白胎，母豬產(chǎn)仔數(shù)減少；15 日齡內(nèi)新生哺乳仔豬出現(xiàn)口吐白沫、轉(zhuǎn)圈、抽搐、尖叫、四肢劃水等神經(jīng)癥狀，發(fā)病24～36 小時(shí)后死亡，死亡率高達(dá)100%；育肥豬出現(xiàn)莫名發(fā)熱和呼吸道癥狀，同時(shí)繼發(fā)感染傳染性胸膜肺炎引起急性死亡。病理變化主要體現(xiàn)在：肝臟、脾臟表面布滿白色壞死結(jié)節(jié)；扁桃體出現(xiàn)潰瘍；肺臟呈水腫、有出血點(diǎn)；表現(xiàn)神經(jīng)癥狀的哺乳仔豬腦膜充血、水腫（圖2～4）。

圖2　妊娠母豬后期流產(chǎn)

圖3　產(chǎn)房仔豬整窩死亡

圖4　扁桃體發(fā)生潰瘍，出現(xiàn)壞死

圖5　肝臟表面布滿白色壞死灶

2　豬偽狂犬病疫情背后的反思

造成偽狂犬病疫情再次來襲的原因到底是什么？這是一個(gè)值得深思的問題。難道真是疫苗免疫出現(xiàn)漏洞？但根據(jù)偽狂犬病暴發(fā)疫情豬場的流行病學(xué)調(diào)查來看，很多豬場都進(jìn)行過疫苗免疫，而且免疫劑量和免疫頻率也都有保證，之所以出現(xiàn)這種現(xiàn)象，分析可能存在以下兩方面的原因：一是偽狂犬病流行毒株的毒力增強(qiáng)，疫苗產(chǎn)生的保護(hù)力不足以抵抗強(qiáng)病毒入侵；二是偽狂犬病流行毒株抗原發(fā)生變異，傳統(tǒng)疫苗不足以提供全面保護(hù)力。2012 年以來，華中農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物疫病診斷中心已陸續(xù)從臨床發(fā)病案例中分離到三十多株豬偽狂犬病毒，并將其中6 株豬偽狂犬病毒進(jìn)行毒力測定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：臨床所分離的偽狂犬病毒的毒力與國內(nèi)20 世紀(jì)90 年代出現(xiàn)的偽狂犬病毒（鄂A株分離株）毒力相當(dāng)，無明顯差異。由此說明，本次流行的偽狂犬病野毒相比于以前流行株（鄂A株）的毒力并沒有明顯增強(qiáng)。

因此，更多懷疑聚焦在當(dāng)前偽狂犬病流行毒株是否發(fā)生變異，從而導(dǎo)致疫苗保護(hù)力失效。這種猜測隨后也被得到證實(shí)。華中農(nóng)業(yè)大學(xué)、中國農(nóng)業(yè)大學(xué)、南京農(nóng)業(yè)大學(xué)、吉林大學(xué)、中國動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心、國家獸用藥品工程技術(shù)研究中心、中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所、中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所、山東農(nóng)業(yè)大學(xué)等9 家國內(nèi)科研單位都相繼研究報(bào)道證實(shí)，豬偽狂犬病開始出現(xiàn)新一輪流行，且發(fā)生于偽狂犬病疫苗（Bartha-K61 株）免疫豬群。后續(xù)進(jìn)一步研究表明，Bartha-K61 株對(duì)當(dāng)前流行的偽狂犬病毒已不能提供有效保護(hù)，主要是因?yàn)楫?dāng)前偽狂犬病流行毒株已經(jīng)發(fā)生變異。

3　豬偽狂犬病疫情再次流行的真正原因

為了進(jìn)一步驗(yàn)證偽狂犬病野毒是否發(fā)生變異，華中農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物疫病診斷中心將臨床分離偽狂犬病野毒進(jìn)行基因測序分析（圖6），結(jié)果顯示，當(dāng)前分離流行毒株在TK、gB、gC、gE等基因發(fā)生了多個(gè)堿基的標(biāo)志性突變和連續(xù)性缺失，這些突變和缺失有可能導(dǎo)致流行毒株的毒力或抗原發(fā)生改變，這或許是當(dāng)前豬偽狂犬病再次流行的真正原因，不過這還需要進(jìn)一步的試驗(yàn)數(shù)據(jù)來驗(yàn)證分析。

圖6　豬偽狂犬病流行野毒基因組學(xué)分析（偽狂犬gE基因多序列比對(duì)分析）（引自華中農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物疫病診斷中心分析數(shù)據(jù)）

豬偽狂犬病毒進(jìn)化樹分析顯示（圖7、8），當(dāng)前流行的偽狂犬病毒處于亞洲亞群的分支上，為亞洲流行毒株進(jìn)化而來，而以Bartha毒株為代表的歐美毒株處于歐美亞群的分支上，兩者處于完全不同的水平分支上，親緣關(guān)系相差較遠(yuǎn)。相反，鄂A毒株（HB-98 株）與當(dāng)前流行偽狂犬病毒同屬于亞洲亞群，處于相同的進(jìn)化分支，親緣關(guān)系最近，同源性為99%。

圖7　偽狂犬病流行毒株gC基因的進(jìn)化樹分析（引自華中農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物疫病診斷中心分析數(shù)據(jù)）

圖8　偽狂犬病流行毒株gE基因的進(jìn)化樹分析（引自華中農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物疫病診斷中心分析數(shù)據(jù)）

分析造成此次疫苗免疫豬群再發(fā)偽狂犬病的原因，排除疫苗免疫失敗和存在免疫漏洞，可能主要還是在于當(dāng)前流行偽狂犬病毒為亞洲變異毒株，Bartha-K61 株已失去全面保護(hù)力。（Bartha-K61 株）局限性主要體現(xiàn)在以下3 個(gè)方面。

（1）通過毒株基因測序分析和分子遺傳關(guān)系分析證實(shí)，當(dāng)前流行的偽狂犬病毒屬于亞洲亞群，以Barhta-K61為代表的疫苗毒株屬于歐美亞群，兩者同源性只有93%～95%，親緣關(guān)系相差較遠(yuǎn)。

（2）傳統(tǒng)疫苗毒株（Batha-K61 株）存在一定安全隱患，因未缺失主要毒力基因TK，存在毒力返強(qiáng)風(fēng)險(xiǎn)。雖然還未進(jìn)一步證實(shí)偽狂犬病疫情再流行是否是因?yàn)閭鹘y(tǒng)毒株Bartha-K61在高強(qiáng)度、高頻率免疫下發(fā)生毒力返強(qiáng)，但也不排除這樣的可能。

（3）常規(guī)免疫不能阻止野毒感染，細(xì)胞免疫在抗PRV感染中具有重要作用，雖然傳統(tǒng)疫苗可以產(chǎn)生較高的血清抗體，但這與保護(hù)力的高低并不成正相關(guān)。

4　偽狂犬病傳統(tǒng)疫苗保護(hù)力的有限性

20 世紀(jì)50 年代，國內(nèi)首次報(bào)道豬偽狂犬病的暴發(fā)流行，Bartha-K61 疫苗在20 世紀(jì)70 年代從匈牙利被引回中國用于偽狂犬病的防控。國內(nèi)率先由中國工程院院士陳煥春開展偽狂犬病毒的分離鑒定，并成功研制出基因工程疫苗（HB-98 株），提出了偽狂犬病的根除計(jì)劃。隨著偽狂犬病疫苗的應(yīng)用，從20 世紀(jì)90 年代到2011 年，國內(nèi)80%的豬群在接種Bartha-K61 疫苗后，偽狂犬病都控制的很好。然而，從2011 年開始后，很多規(guī)?；i場在接種偽狂犬病疫苗后的豬群中暴發(fā)流行偽狂犬病，在暴發(fā)流行的第一個(gè)月時(shí)間，流行區(qū)域50%的樣品檢測gE野毒抗體都呈陽性，且引起新生仔豬出現(xiàn)神經(jīng)癥狀而急性死亡。

同時(shí)，中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所童光志研究員研究發(fā)現(xiàn)，Bartha-K61 免疫豬群產(chǎn)生的血清抗體不能完全中和最新流行毒株HeN1，攻毒保護(hù)性試驗(yàn)結(jié)果表明，對(duì)于傳統(tǒng)野毒（SC株）的攻擊，Barhta-K61可以為免疫動(dòng)物提供100%的保護(hù)力，而對(duì)于最新流行毒株HeN1， Barhta-K61 提供的保護(hù)力只有50%。中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所仇吉華課題組研究表明，從Bartha-K61 免疫豬群中分離到的偽狂犬病變異毒株（TJ株），其毒力和致病性發(fā)生改變，免疫保護(hù)試驗(yàn)結(jié)果顯示，Bartha-K61的免疫保護(hù)力僅為33.3%。南京農(nóng)業(yè)大學(xué)姜平教授課題組研究發(fā)現(xiàn)，Bartha-K61免疫豬群產(chǎn)生針對(duì)新分離毒株ZJ01的中和抗體水平較低，經(jīng)新分離毒株ZJ01攻毒后，Batha-K61免疫豬群均表現(xiàn)出抽搐、共濟(jì)失調(diào)等神經(jīng)癥狀。張改平院士課題組研究進(jìn)一步證實(shí)，當(dāng)前偽狂犬病流行毒株在gE、gB、gC基因片段上發(fā)生較大變異（2.3%、2.7%、7.6%），系統(tǒng)進(jìn)化樹分析結(jié)果表明，Bartha-K61 毒株與國內(nèi)偽狂犬病流行毒株的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，兩者處于不同進(jìn)化分支上，這也為解釋國內(nèi)Bartha-K61 免疫豬群出現(xiàn)偽狂犬病暴發(fā)與流行提供了科學(xué)依據(jù)。綜上研究結(jié)果表明，對(duì)于當(dāng)前流行的偽狂犬病野毒，傳統(tǒng)疫苗（Bartha-K61 株）已不能提供全面而有效的保護(hù)力。

5　豬偽狂犬病疫苗免疫方案的制定與疫病凈化

疫苗免疫是防控豬偽狂犬病的唯一手段，加強(qiáng)生物安全措施，及時(shí)調(diào)整疫苗免疫策略，陽性種豬的檢測淘汰與陰性后備豬的擴(kuò)群，逐漸降低豬場偽狂犬病野毒的陽性感染率，以達(dá)到凈化偽狂犬病的目的。

5.1有效疫苗的選擇

目前市面上有不同種類的偽狂犬病疫苗：以HB-98株為代表的豬偽狂犬基因工程疫苗，以傳統(tǒng)Bartha-K61為代表的豬偽狂犬弱毒疫苗，偽狂犬滅活疫苗（鄂A株）。豬偽狂犬病的免疫防控以細(xì)胞免疫占主要，因此，應(yīng)優(yōu)先選擇豬偽狂犬活疫苗。以HB-98 株為代表的豬偽狂犬基因工程疫苗屬于TK-/gG-/gE-三基因缺失疫苗，來源于中國地方毒株，針對(duì)性強(qiáng)；人工定向缺失主要毒力基因TK，安全性好；缺失gG基因，提升細(xì)胞免疫優(yōu)勢明顯；缺失gE基因，可區(qū)分野毒與疫苗毒，用于偽狂犬病的凈化。研究發(fā)現(xiàn)，對(duì)于偽狂犬病野毒陽性感染場或受威脅場，為減少散毒、減輕癥狀，豬群應(yīng)選擇不同的疫苗（即活疫苗和滅活疫苗同時(shí)使用），活疫苗和滅活疫苗免疫種豬，活疫苗免疫仔豬。近年來，通過臨床應(yīng)用研究也發(fā)現(xiàn)，偽狂犬活疫苗（HB-98 株）與滅活疫苗（鄂A株）的結(jié)合使用在偽狂犬病發(fā)病場和陽性感染場確實(shí)取得了顯著的臨床應(yīng)用效果。

5.2免疫方案的制定

針對(duì)當(dāng)前流行的豬偽狂犬病毒，建議首選親緣性關(guān)系近、同源性高（99%）的豬偽狂犬病疫苗：活疫苗（HB-98株）和滅活疫苗（鄂A株）。受威脅場或偽狂犬病野毒陽性感染場建議強(qiáng)化免疫，根據(jù)豬場偽狂犬病發(fā)生情況，制定不同的免疫方案。華中農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物疫病診斷中心聯(lián)合武漢科前生物股份有限公司通過長期跟蹤處理國內(nèi)偽狂犬病問題豬場，針對(duì)豬群偽狂犬病不同感染情況，提出了全面有效的偽狂犬病防疫方案與轉(zhuǎn)陰計(jì)劃，在快速控制偽狂犬病疫情，降低豬群陽性感染率等方面獲得了大量成功經(jīng)驗(yàn)。偽狂犬病免疫防控方案與轉(zhuǎn)陰計(jì)劃主要針對(duì)以下三種情況：偽狂犬病出現(xiàn)野毒陽性感染，暫時(shí)生產(chǎn)穩(wěn)定場（見表1）；偽狂犬病野毒感染嚴(yán)重，且生產(chǎn)不穩(wěn)定場（見表2）；偽狂犬病疫情正在發(fā)生場（見表3）。

表1　“偽狂犬病野毒陽性感染，暫時(shí)生產(chǎn)穩(wěn)定場”免疫方案

表2　“偽狂犬病野毒感染嚴(yán)重，且生產(chǎn)不穩(wěn)定場”免疫方案

表3　“偽狂犬病疫情正在發(fā)生場”免疫方案

5.3疫病凈化細(xì)則

豬偽狂犬病控制的最終目標(biāo)是凈化與根除，主要有4個(gè)步驟：本底調(diào)查階段，了解豬群的免疫情況和野毒感染情況；強(qiáng)制免疫階段，“檢測-分群-免疫-檢測”，逐步淘汰和縮小陽性豬群；凈化清除階段，當(dāng)豬群豬偽狂犬病野毒感染率≤5%時(shí)，全群逐頭豬進(jìn)行淘汰；凈化后的維持階段，每半年進(jìn)行一次檢測，確保凈化豬群的健康狀態(tài)。

6　小結(jié)

在當(dāng)前流行的偽狂犬病疫情威脅下，調(diào)整免疫策略，探尋一種有效的豬偽狂犬病防控方案。選擇針對(duì)性強(qiáng)、安全性好、細(xì)胞免疫水平高的偽狂犬活疫苗（HB-98 株），同時(shí)結(jié)合使用同源性高、安全性好、體液免疫水平高的豬偽狂犬滅活疫苗（鄂A株），加強(qiáng)豬群疫苗免疫，以減少陽性豬群的排毒量、減輕臨床癥狀、降低豬群陽性感染率，逐步達(dá)到疫病凈化目的。

■簡訊

福州市農(nóng)業(yè)局調(diào)配專項(xiàng)資金600萬 重災(zāi)養(yǎng)殖場可申請(qǐng)補(bǔ)助

【本刊輯】據(jù)2016 年8 月3 日福州日?qǐng)?bào)報(bào)道，為幫助閩清和永泰重災(zāi)區(qū)畜牧業(yè)盡快恢復(fù)生產(chǎn)，福建省福州市農(nóng)業(yè)局積極調(diào)配生豬轉(zhuǎn)產(chǎn)轉(zhuǎn)業(yè)專項(xiàng)資金600 萬元，用于支持災(zāi)區(qū)畜牧業(yè)重建工作，損失5 萬元以上的養(yǎng)殖場（戶）可申報(bào)重建項(xiàng)目。

據(jù)統(tǒng)計(jì)，“尼伯特”臺(tái)風(fēng)造成福州市834 家畜牧場受災(zāi)，圈舍倒塌損毀36 111 m2，受災(zāi)損失2 849.6 萬元。其中，閩清、永泰擬列入標(biāo)準(zhǔn)化改造的53 家畜牧養(yǎng)殖場經(jīng)濟(jì)損失達(dá)640 余萬元。市農(nóng)業(yè)局表示，畜禽圈舍（含養(yǎng)殖設(shè)備）、水電設(shè)施、污染治理設(shè)施、場內(nèi)道路和進(jìn)場專用道路等基礎(chǔ)設(shè)施受損經(jīng)濟(jì)損失在5 萬元以上的養(yǎng)殖場（戶），均可持有效的工商營業(yè)執(zhí)照申報(bào)重建項(xiàng)目，若無執(zhí)照可立即新辦或由所在村委會(huì)集中申報(bào)。

修復(fù)或重建的養(yǎng)殖場（戶）應(yīng)在非禁養(yǎng)區(qū)，享受2014 年生豬生態(tài)環(huán)保型養(yǎng)殖項(xiàng)目、2015 年生態(tài)農(nóng)業(yè)污染源減排項(xiàng)目、2015 年和2016 年病死豬機(jī)械無害化處理補(bǔ)貼項(xiàng)目、2015 年和2016 年規(guī)模養(yǎng)豬場標(biāo)準(zhǔn)化升級(jí)改造項(xiàng)目建設(shè)的養(yǎng)殖場在建或已竣工驗(yàn)收的工程被沖毀受損的，可以申報(bào)本項(xiàng)目，并獲得相應(yīng)補(bǔ)助。

■ 簡訊

福州市農(nóng)業(yè)局調(diào)配專項(xiàng)資金600萬 重災(zāi)養(yǎng)殖場可申請(qǐng)補(bǔ)助

【本刊輯】據(jù)2016 年8 月3 日福州日?qǐng)?bào)報(bào)道，為幫助閩清和永泰重災(zāi)區(qū)畜牧業(yè)盡快恢復(fù)生產(chǎn)，福建省福州市農(nóng)業(yè)局積極調(diào)配生豬轉(zhuǎn)產(chǎn)轉(zhuǎn)業(yè)專項(xiàng)資金600 萬元，用于支持災(zāi)區(qū)畜牧業(yè)重建工作，損失5 萬元以上的養(yǎng)殖場（戶）可申報(bào)重建項(xiàng)目。

據(jù)統(tǒng)計(jì)，“尼伯特”臺(tái)風(fēng)造成福州市834 家畜牧場受災(zāi)，圈舍倒塌損毀36 111 m2，受災(zāi)損失2 849.6 萬元。其中，閩清、永泰擬列入標(biāo)準(zhǔn)化改造的53 家畜牧養(yǎng)殖場經(jīng)濟(jì)損失達(dá)640 余萬元。市農(nóng)業(yè)局表示，畜禽圈舍（含養(yǎng)殖設(shè)備）、水電設(shè)施、污染治理設(shè)施、場內(nèi)道路和進(jìn)場專用道路等基礎(chǔ)設(shè)施受損經(jīng)濟(jì)損失在5 萬元以上的養(yǎng)殖場（戶），均可持有效的工商營業(yè)執(zhí)照申報(bào)重建項(xiàng)目，若無執(zhí)照可立即新辦或由所在村委會(huì)集中申報(bào)。

修復(fù)或重建的養(yǎng)殖場（戶）應(yīng)在非禁養(yǎng)區(qū)，享受2014 年生豬生態(tài)環(huán)保型養(yǎng)殖項(xiàng)目、2015 年生態(tài)農(nóng)業(yè)污染源減排項(xiàng)目、2015 年和2016 年病死豬機(jī)械無害化處理補(bǔ)貼項(xiàng)目、2015 年和2016 年規(guī)模養(yǎng)豬場標(biāo)準(zhǔn)化升級(jí)改造項(xiàng)目建設(shè)的養(yǎng)殖場在建或已竣工驗(yàn)收的工程被沖毀受損的，可以申報(bào)本項(xiàng)目，并獲得相應(yīng)補(bǔ)助。

S858.28

A

1673-4645（2016）08-0015-06

2015-12-13

吳成龍（1987-），男，主要從事規(guī)?；i場臨床疫病診斷與防控工作，E-mail：402803118@qq.com