大孔樹脂混用技術分離純化竹葉黃酮的工藝研究*

周健飛，陶文亮

(1 貴州大學化學與化工學院，貴州　貴陽　550025; 2 貴州工程應用技術學院，貴州　畢節　551700)

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大孔樹脂混用技術分離純化竹葉黃酮的工藝研究*

周健飛1，陶文亮2

(1 貴州大學化學與化工學院，貴州貴陽550025; 2 貴州工程應用技術學院，貴州畢節551700)

采用大孔樹脂混合使用技術,用于分離純化竹葉黃酮的工藝研究。通過研究8種大孔樹脂對竹葉黃酮的靜態吸附與解吸實驗，篩選出兩種較好的樹脂D101-1和AB-8，采用混用技術進行實驗，結果表明：D101-1與AB-8的最優混合比例為2:1；上樣液質量濃度1.2 mg/mL、上樣量為3.5 BV、上樣流速2 BV/h為最佳上樣條件，洗脫劑體積分數70%、洗脫體積4 BV、洗脫流速2 BV/h的條件下進行洗脫。在此條件下進行純化實驗，分離純化效果最好，樣品中黃酮純度由原來的8.46%上升至28.16%。

竹葉黃酮；純化；大孔吸附樹脂；混用技術

竹子是禾本科、竹亞科多年生常綠植物，在我國具有悠久的食用和藥用歷史。全世界竹子約有70多屬、1250多種，其中53%分布在中國。竹葉黃酮是一種安全無毒副作用[1]的天然抗氧化劑，其抗氧化作用可替代銀杏提取物、茶葉提取物和葡萄籽提取物，已列入國標GB30615-2014，被衛生部批準作為天然食品抗氧化劑使用。此外，竹葉黃酮還具有清除自由基[2]、抗氧化[3]、防衰老[4]和預防老年癡呆，抗炎，殺菌[5-6]，抗腫瘤[7]，肝肌保護[8]，降低心腦血管疾病發生的危險[9]等多種生物學功效。

大孔吸附樹脂是一類有機高聚物吸附劑，具有選擇性好、吸附量大、吸附速率快、機械強度高、易再生等優點，已被廣泛運用于天然產物黃酮類化合物的分離純化[10-12]。目前關于兩種及多種樹脂混用在天然產物分離純化上的運用研究已有相關報道[13-15]，而關于大孔樹脂在竹葉黃酮類化合物的分離純化的研究多為單一樹脂的研究，未見多種樹脂的混用技術的研究報道。

本研究采用大孔樹脂混用技術，在8種大孔吸附樹脂中選取兩種進行混合，對竹葉黃酮進行分離特性的研究，分離純化效果好，樣品中黃酮純度得以大大提高，為竹葉黃酮的純化提供了新方法，具有較好的應用價值，對竹葉資源的利用具有重要意義。

1　實　驗

1.1材料、試劑與儀器

竹葉采于2013年貴州赤水,并通過自然風干，備用。

蘆丁標準品(中國食品藥品檢定研究院；批號：100080-201409)；氫氧化鈉、亞硝酸鈉、硝酸鋁、石油醚、乙醇、甲醇、鹽酸均為國產分析純；大孔吸附樹脂(D101-1、D101、AB-8、DM130、DM301、ADS-17、S-8)來自安徽三星樹脂有限公司、NKA-9來自滄州寶恩樹脂有限公司。

恒溫水浴鍋、旋轉蒸發器，上海亞榮生化儀器廠；SHB-IV循環水式多用真空泵，鄭州長城科工貿有限公司；HH-4數顯恒溫水浴鍋，常州澳華儀器有限公司；恒溫循環器，北京博醫康實驗儀器有限公司；JC-100恒溫培養振蕩器，上海精旭實業有限公司；酒精計，河北省武強縣同輝儀表廠；JF1204電子分析天平，余姚市金諾天平儀器有限公司；101-1AB電熱鼓風干燥箱，天津市泰斯特儀器有限公司；UV-6100S紫外/可見分光光度計，上海美譜達儀器有限公司；雷磁PHS-25pH計，上海儀電科學儀器股份有限公司；玻璃層析柱。

1.2實驗方法

1.2.1竹葉黃酮提取方法

取干燥未粉碎的竹葉，先按料液比1:20(g/mL)加入50%乙醇提取一次分離固液后，再以料液比1:15(g/mL)進行二次提取.合并兩次提取液，醇沉過夜以除去糖類、蛋白質等，濃縮至一定濃度，備用。

1.2.2樹脂處理方法

先用體積分數95%乙醇溶液充分浸泡過夜，然后用無水乙醇洗至洗出液加適量水后無白色渾濁，再用去離子水洗至洗出液無醇味，轉入酸堿處理，用4 BV的5%HCL溶液以5 BV/h流經層析柱后浸泡3 h,然后用去離子水洗至pH值為中性，用4 BV的5%NaOH溶液以5 BV/h流經層析柱后浸泡3 h,然后用去離子水洗至pH值為中性，浸泡于95%乙醇中備用，使用前用水洗至無醇味。

1.2.3竹葉黃酮的測定方法

1.2.3.1標準曲線的繪制

由于蘆丁和黃酮類化合物都是以 2-苯基色原酮為母核，具有相同的吸光度測試性質，故用蘆丁為標準品，采用 NaNO2-Al(NO3)3-NaOH 比色法測定總黃酮含量[16]。精確稱量0.0150 g蘆丁標準品，置于100 mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，搖勻得濃度為0.15 mg/mL的標準溶液。準確吸取蘆丁標準溶液0 mL、1.0 mL、2.0 mL、3.0 mL、4.0 mL、5.0 mL、6.0 mL、7.0 mL于25 mL具塞比色管中，用30%乙醇補齊至10 mL，加0.7 mL 5%NaNO2溶液搖勻放置5 min后，加入0.7 mL 10% Al(NO3)3溶液搖勻6 min后，再加入5 mL 1 mol/L NaOH溶液，搖勻，用30%乙醇定容至刻度。靜止15 min后置于分光光度計于510 nm處測吸光度A，記錄數值。以吸光度為縱坐標，蘆丁質量濃度為橫坐標，繪制標準曲線，所得線性標準回歸方程為y=11.66071x+0.00186,相關系數R2=0.99972。

1.2.3.2樣品含量及純度的測定

取一定量待測試樣溶液，按繪制標準曲線的步驟，于510 nm處測定吸光度，根據標準曲線方程計算樣品黃酮濃度。

竹葉黃酮精制后于50 ℃條件放置烘箱干燥至恒重，取精制產品100 mg,用30%乙醇溶解并定容至100 mL,搖勻待測其黃酮濃度。

(1)

1.2.4單一大孔吸附樹脂的篩選

1.2.4.1靜態吸附與解吸實驗

準確稱取1 g已處理好的8種吸附樹脂(用濾紙吸干后稱重)裝入100 mL錐形瓶中，精密加入30 mL質量濃度0.8 mg/mL竹葉黃酮樣品溶液，于25 ℃下置恒溫培養振蕩器中振蕩吸附24 h,過濾，測定剩余黃酮的質量濃度，按式(1)、(2)計算吸附量和吸附率；吸附后的樹脂用濾紙吸干后加入30 mL 的95%乙醇,在25 ℃下置恒溫培養振蕩器中振蕩解吸24 h，過濾測定洗脫液中黃酮質量濃度，按式(3)、(4)計算其解吸率。

(2)

(3)

(4)

1.2.4.2靜態吸附與解吸動力學實驗

根據1.2.4.1結果所示，選擇其中2種較理想的樹脂進行靜態吸附與解吸動力學實驗。按1.2.4.1的方法，每隔1 h取樣檢測，測定其中吸附液剩余黃酮濃度,以樹脂對黃酮的吸附量與時間作圖，繪制大孔樹脂靜態吸附動力學吸附曲線及靜態動力學解吸曲線。

1.2.5混合大孔吸附樹脂比例的篩選

將上述兩種效果較好的樹脂以一定質量比混合，按1.2.4.1的方法，于25 ℃下置恒溫培養振蕩器中振蕩吸附5 h，解吸4 h，按公式(1)～(4)計算吸附量、吸附率和解吸率。篩選出最優樹脂混合比例。

1.2.6混合大孔吸附樹脂靜態吸附、解吸實驗

1.2.6.1上樣液質量濃度對吸附效果的影響

各取30 mL上樣液質量濃度分別為0.4 mg/mL、0.8 mg/mL、1.2 mg/mL、1.6 mg/mL、2.0 mg/mL的竹葉總黃酮提取液。加入1 g樹脂(AB-8:D101-1=1:2)，于25 ℃下恒溫振蕩吸附5 h，取一定量上層清液按繪制標準曲線的方法測定其總黃酮濃度，計算其吸附率和吸附量。

1.2.6.2洗脫液體積分數對解吸率的影響

將吸附飽和的1 g樹脂(AB-8:D101-1=1:2)用濾紙吸干后，分別加入體積分數為40%、50%、60%、70%、80%、90%乙醇各30 mL。下同1.2.6.1，計算其解吸率。

2　結果與討論

2.1單一大孔吸附樹脂的篩選

2.1.1靜態吸附與解吸實驗

竹葉黃酮具有一定的酚羥基且有一定的極性，而大孔吸附樹脂是種表面吸附劑，吸附性能主要取決于吸附劑的表面性質,即樹脂的極性(功能基)和空間結構(孔徑、比表面積、孔容等),由于不同樹脂結構性質的不同，從而對竹葉黃酮樹脂的吸附解吸難易程度不同。由表1可知，如D101-1型樹脂吸附效果較好，吸附率達到71.04%； S-8型樹脂雖然吸附效果最好，但是其解吸效果較低；而解吸率最高的是AB-8型樹脂達95.07%。綜合考慮黃酮的吸附率、解吸率，本實驗擬采用D101-1和AB-8兩種樹脂按一定比例混合，篩選出對竹葉黃酮分離純化效果更好的樹脂混合比例。

表1　8種樹脂對竹葉黃酮的吸附和解吸效果Tabel 1　Results of adsorption and desorption capacity of bamboo leaf flavonoids on eight macroporous resins

2.1.2靜態吸附與解吸動力學實驗

分別考察其靜態吸附解吸動力學特性，結果如圖1、圖2所示，D101-1與AB-8兩種大孔樹脂能夠達到快速吸附與解吸平衡，在5 h時，D101-1與AB-8的吸附量分別是15.37 mg/g和15.09 mg/g，基本達到吸附平衡；在4 h時，D101-1與AB-8的洗脫液濃度分別是0.490 mg/mL和0.487 mg/mL，基本達到解吸平衡。

圖1　D101-1與AB-8兩種大孔樹脂對竹葉黃酮的靜態吸附動力學吸附曲線Fig.1　Static adsorption kinetic curves of D101-1 and AB-8 macroporous resins towards bamboo leaf flavonoids

圖2　D101-1與AB-8兩種大孔樹脂靜態吸附動力學解吸曲線Fig.2　Static desorption kinetic curves of D101-1 and AB-8 macroporous resins towards bamboo leaf flavonoids

2.2混合大孔吸附樹脂比例的篩選

大孔樹脂對竹葉黃酮的吸附作用與其空間結構和功能團息息相關，考慮到不同樹脂的協同作用和空間結構參數的不同，通過不同比例樹脂的混合，混合樹脂的空間結構和功能團有所差異。由表2可知，當兩種樹脂以一定比例混合時，其不同的吸附率和解吸率作為判斷對竹葉黃酮分離純化效果的標準，當AB-8:D101-1=1:2時，吸附率與解吸率均較高所以選擇以此比例混合后對竹葉黃酮進行分離純化。

表2　不同混合樹脂比例對竹葉黃酮吸附與解吸效果Tabel 2　comparison of adsorption and desorption capacities of D101-1:AB-8 mixtures in different proportions towards bamboo leaf flavonoids

2.3不同條件下混合大孔吸附樹脂對竹葉黃酮純化工藝的實驗

2.3.1上樣液質量濃度對吸附效果的影響

大孔樹脂對竹葉黃酮溶液吸附過程是一種液固吸附過程，而液固之間的吸附不僅存在吸附劑與溶質之間的作用，還存在溶質-溶質、溶質-溶劑、溶劑-吸附之間的作用[17]。由圖3可知，隨著上樣液濃度的增加，吸附率逐漸降低，吸附量逐漸增大。綜合考慮黃酮的吸附率與樹脂的吸附量，選擇最適上樣液濃度為1.2 mg/mL。

圖3　不同上樣液質量濃度對樹脂吸附性能的影響Fig.3　Effect of sample concentration on adsorption properties

2.3.2洗脫劑體積分數對解吸率的影響

常用的洗脫劑多為甲醇、乙醇、丙酮等，由于乙醇安全、無毒、易回收等優點，本實驗選擇乙醇作為洗脫劑，通過靜態吸附解吸實驗，吸附5 h后，考察不同乙醇體積分數對竹葉黃酮分離純化的影響，如圖4所示。從圖4中可以看出，隨著乙醇體積分數的增加，解吸率先增加后減少，在70%時解吸率達到最大值90.81%。當體積分數大于70%時解吸率降低，這是由于當乙醇濃度過高時，醇溶性雜質增加，降低洗脫液中黃酮純度。

圖4　乙醇體積分數對解吸效果的影響Fig.4　Effect of ethanol concentration on desorption quantity

2.3.3最佳上樣體積的確定

取1.2 mg/mL竹葉黃酮提取液，以2 BV/h流經層析柱。每0.5BV為一收集段收集流出液，測定其黃酮質量濃度，繪制其泄漏曲線如圖5所示。流出液黃酮濃度隨著上樣量的增加而增加，則吸附率逐漸降低；而上樣量過少時，樹脂的吸附量減小，樹脂利用率降低。綜合考慮樹脂的吸附率與樹脂的吸附量，選擇3.5 BV為最佳上樣量體積。

圖5　竹葉黃酮的泄漏曲線Fig.5　Leakage curve of bamboo flavounoids

2.3.4最佳上樣流速的確定

上樣液通過樹脂床的流速對樹脂的吸附效率及生產效率均有著一定的影響。本實驗通過控制不同流速考察對吸附效果的影響，將樹脂(AB-8:D101-1=1:2)裝柱，竹葉黃酮上樣量濃度1.2 mg/mL，上樣量3.5 BV，分別以1 BV/h、 2 BV/h、3 BV/h、 4 BV/h、 5 BV/h的流速流經層析柱，測定吸附過程中流出液的黃酮質量濃度，計算黃酮吸附總量。結果如圖6所示。隨著上樣流速的增加，吸附量降低，反之，流速降低，有利于總黃酮的吸附，但會影響生產效率，增加吸附時間，生產周期和成本增加。綜合考慮樹脂的處理量和黃酮的利用率，選擇2 BV/h為最佳上樣流速。

圖6　上樣流速對樹脂吸附量的影響Fig.6　Effect of sample loading velocity on adsorption quantity

2.3.5最佳洗脫體積的確定

按確定的最佳吸附條件上柱，用1 BV水洗去水溶性雜質，再用70%乙醇作為洗脫劑以2 BV/h的流速洗脫，每0.5 BV作為一收集段收集洗脫液，檢測其中總黃酮質量濃度，繪制洗脫曲線如圖7所示。當洗脫體積達到4 BV時，洗脫液中黃酮濃度接近于0，考慮到洗脫效率與洗脫劑用量，選擇4 BV為最佳洗脫體積。

圖7　洗脫曲線Fig.7　Dynamic desorption curve

2.3.6最佳洗脫流速的確定

按確定的吸附條件上柱，先用1 BV水洗去水溶性雜質，用4 BV的70%乙醇分別以1 BV/h、2 BV/h、3 BV/h、4 BV/h、5 BV/h的速度進行洗脫。測定洗脫液總黃酮質量濃度計算解吸率，如圖8所示。不同的流速對其解吸效果影響不大，考慮洗脫時間不至于過長，選用2 BV/h為最佳洗脫流速。

圖8　洗脫流速對樹脂解吸性能的影響Fig.8　Effect of elution flow rate on desorption rate

2.4混合樹脂純化工藝驗證實驗

上樣條件：上樣質量濃度1.2 mg/mL，上樣量體積3.5 BV，上樣流速2 BV/h；洗脫條件：洗脫劑體積分數70%，4 BV洗脫劑體積，洗脫流速2 BV/h。以此條件對竹葉黃酮進行精制，收集洗脫液經旋轉蒸發器濃縮后烘干。測得其黃酮純度為28.16%，與純化前黃酮純度8.46%相比，純度為原來的3.3倍。純化效果顯著。

3　結　論

在8種大孔吸附樹脂中選取兩種(D101-1與AB-8)，采用混用技術進行分離純化竹葉黃酮工藝條件考察，結論如下：D101-1與AB-8以2:1比例混合，上樣液質量濃度1.2 mg/mL、上樣量為3.5 BV、上樣流速2 BV/h條件下上柱吸附、洗脫劑體積分數70%、洗脫體積4 BV、洗脫流速2 BV/h的條件下進行洗脫。比較純化前后黃酮純度，較純化前8.46%，純化后黃酮純度為28.16%，純度為原來的3.3倍。大孔樹脂混用技術為竹葉黃酮的純化提供了新方法，具有較好的應用價值。

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Separation and Purification of Flavonoids from Bamboo Leaves by Mixed Macroporous Resins Technique*

ZHOU Jian-fei1, TAO Wen-liang2

(1 College of Chemical and Chemical Engineering, Guizhou University, Guizhou Guiyang 550025;2GuizhouUniversityofEngineeringScience,GuizhouBijie551700,China)

The macroporous resins mixing technology was used for separation and purification of flavonoids from bamboo leaves technology research. To screen two kinds of better resin for separation and purification of flavonoids from bamboo leaves by using mixed technology experiment, 8 macroporous resins were compared by the static adsorption and desorption experiments, D101-1 and AB-8 were found more suitable to separate and purify flavonoids. Experimental results showed that the optimal mixing ratio of D101-1 to AB-8 was 2:1. The best of loading conditions by loading 3.5 BV(bed volume) of the sample concentration 1.2 mg/mL onto the mixed column at a flow rate of 2 BV/h and eluting the column with 4 BV of 70% ethanol at a flow rate of 2 BV/h. The effect of purification experiment under these conditions was best, the sample flavonoids purity increased from 8.46% to 28.16%.

flavonoids from bamboo leaves; purification; macroporous resins; mixing technology

貴州大學博士基金項目“赤水地區竹葉黃酮的提取分離與純化關鍵技術”[貴大人基合字(2008)001]。

周健飛(1992-)，男，在讀碩士，研究方向：化工分離技術開發研究。

陶文亮，男，教授，博士，研究方向為化工分離過程研究。

Q946

A

1001-9677(2016)09-0069-05