雞肉干中金剛乙胺和3,5-二甲基金剛胺殘留量的測(cè)定

王智瑋

(上海天祥質(zhì)量技術(shù)服務(wù)有限公司，上?！?00233)

?

雞肉干中金剛乙胺和3,5-二甲基金剛胺殘留量的測(cè)定

王智瑋

(上海天祥質(zhì)量技術(shù)服務(wù)有限公司，上海200233)

采用固相萃取柱對(duì)樣品中的金剛乙胺和3,5-二甲基金剛胺進(jìn)行濃縮與凈化，建立了一種靈敏測(cè)定雞肉干中金剛乙胺和3,5-二甲基金剛胺殘留量的超高效液相色譜-質(zhì)譜串聯(lián)儀法。試驗(yàn)結(jié)果表明，采用MCX固相萃取柱進(jìn)行富集與凈化，金剛乙胺和3,5-二甲基金剛胺在1～20 μg/L濃度范圍內(nèi)與其響應(yīng)值呈良好的線性關(guān)系，檢出限均為0.5 μg/kg。該方法分析速度快，靈敏度高，重復(fù)性好，適用于動(dòng)物源食品中金剛乙胺和3,5-二甲基金剛胺殘留量的測(cè)定。

金剛乙胺；3,5-二甲基金剛胺；美金剛；超高液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法

金剛乙胺和3,5-二甲基金剛胺，屬于金剛烷胺類，3,5-二甲基金剛胺又稱美金剛。金剛烷胺類屬于三環(huán)胺類抗病毒藥物，在人類上有廣泛應(yīng)用。據(jù)其藥理作用，國(guó)內(nèi)現(xiàn)在主要將金剛烷胺類藥物用于雞、豬流感的預(yù)防和早期治療，及豬傳染性胃腸炎的防治。但是，將人用抗病毒藥物用于畜禽，不僅容易導(dǎo)致動(dòng)物性食品中藥物殘留、動(dòng)物中毒、動(dòng)物機(jī)體產(chǎn)生免疫抑制和耐藥性等問題，還可導(dǎo)致病毒發(fā)生變異， 影響動(dòng)物疫病控制及人用抗病毒藥物的有效性[1-3]。我國(guó)于2005 年 12 月發(fā)布《關(guān)于清查金剛烷胺等抗病毒藥物的緊急通知》，禁止金剛烷胺等抗病毒藥作為獸用藥，但由于其價(jià)格低廉、效果良好，仍有不法分子大量使用金剛烷胺類藥物用于動(dòng)物疾病的預(yù)防和治療。濫用金剛烷胺類藥物會(huì)導(dǎo)致動(dòng)物中毒，使病毒產(chǎn)生不同程度的耐藥性，并誘發(fā)病毒產(chǎn)生變異，嚴(yán)重影響了國(guó)家動(dòng)物疫病防控工作[4]。我國(guó)對(duì)于動(dòng)物源性食品中金剛烷胺殘留含量的相關(guān)研究報(bào)道較少，少數(shù)的報(bào)道主要集中在液相色譜法[5]、氣相色譜法[6-10]和液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[11-15]，也未曾制定或立項(xiàng)過國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)。因此，研究建立動(dòng)物源食品中金剛烷胺類的殘留檢測(cè)方法具有重要意義。

1　實(shí)　驗(yàn)

1.1儀器與試劑

AB 4500超高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀；XS105分析天平，METLER；XW-80A渦旋混合器，上海精科；SF-DL-4M冷凍離心機(jī)，上海菲恰爾分析儀器有限公司；SK3300HP超聲波清洗器，KUDOS；N-EVAP111氮吹儀，ASSOCIATES；57265固相萃取裝置，SUPELCO。

甲醇、異丙醇和甲酸為色譜純，鹽酸、正己烷、三氯乙酸、氨水和乙酸銨為分析純，實(shí)驗(yàn)用水為去離子水。鹽酸金剛乙胺、3,5-二甲基金剛胺和鹽酸金剛烷胺-D15,購(gòu)自德國(guó)Dr. Ehrenstorfer公司。

1.2標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

1.2.1標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液

準(zhǔn)確稱量1.0 mg金剛烷胺-d15標(biāo)準(zhǔn)品至5 mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容，混勻，濃度為200 μg/mL。-18 ℃保存12個(gè)月。

分別準(zhǔn)確稱量金剛乙胺和3,5-二甲基金剛胺標(biāo)準(zhǔn)品至50 mL 容量瓶中，用甲醇溶解并定容，混勻，濃度均為200 μg/mL。-18 ℃保存12個(gè)月。

1.2.2標(biāo)準(zhǔn)中間液

精確吸取金剛烷胺-d15儲(chǔ)備液0.25 mL至50 mL的容量瓶中，用甲醇定容，混勻，濃度為1.0 μg/mL。-18 ℃保存6個(gè)月。

精確吸取標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液0.25 mL至50 mL的容量瓶中，用甲醇定容，混勻，金剛乙胺和3,5-二甲基金剛胺濃度均為1.0 μg/mL。-18 ℃保存6個(gè)月。

1.2.3標(biāo)準(zhǔn)工作液的配制

從標(biāo)準(zhǔn)中間液中分別吸取0.01 mL、0.02 mL、0.05 mL、0.1 mL、0.2 mL至10 mL容量瓶中，再?gòu)慕饎偼榘?d15標(biāo)準(zhǔn)中間液中分別吸取0.25 mL至10 mL容量瓶中，用水定容，混勻，金剛乙胺和3,5-二甲基金剛胺濃度為1.0 ng/mL、2.0 ng/mL、5.0 ng/mL、10.0 ng/mL、20.0 ng/mL，內(nèi)標(biāo)金剛烷胺-d15濃度為25.0 ng/mL。標(biāo)準(zhǔn)工作液現(xiàn)配現(xiàn)用。

1.3樣品制備

準(zhǔn)確稱取2 g(精確到0.01 g)試樣至50 mL塑料離心管中，加入內(nèi)標(biāo)(金剛烷胺-D15，濃度為1.0 μg/mL)0.025 mL，再加入10 mL甲醇：1%三氯乙酸(1:1)，渦旋振蕩1 min，超聲30 min，4000 r/min冷凍離心15 min。上清液轉(zhuǎn)移至另一50 mL 離心管中，加入5 mL正己烷輕微振搖3 min，4000 r/min冷凍離心5 min，除去上層正己烷層，取下層液待凈化。取下層液轉(zhuǎn)移至已活化(用3 mL甲醇，3 mL水活化)MCX固相萃取柱中，依次用3 mL 0.1 mol/L鹽酸溶液、3 mL甲醇淋洗，棄去全部流出液，在負(fù)壓下干燥5 min，然后用5 mL氨水-甲醇-異丙醇(5+80+15)洗脫。收集洗脫液于45 ℃ 氮吹至干，精密加入1 mL水至殘?jiān)?，渦旋振蕩溶解殘?jiān)鐪啙?，?3000 r/min離心10 min，取上清液供LC-MS/MS測(cè)定。

1.4儀器條件

1.4.1液相條件

色譜柱：C18柱(100 mm×2.1 mm，1.8 μm)或相當(dāng)者；

流動(dòng)相：A相5 mmol/L乙酸銨水溶液(含0.1%甲酸)，B相甲醇。

流速：0.3 mL/min；

進(jìn)樣量：5 μL；

柱溫：30 ℃。

表1　流動(dòng)相梯度條件Table 1　The elution conditions of mobile phase

1.4.2質(zhì)譜條件

離子源：電噴霧ESI離子源；

掃描方式：正離子掃描；

檢測(cè)方式： MRM；

電噴霧電壓：5500 V ；

霧化氣壓力：50 psi；

氣簾氣壓力：35 psi；

輔助氣壓力：50 psi；

碰撞氣壓力：9 psi；

離子源溫度：500 ℃；

碰撞室入口電壓：10 V；

碰撞室出口電壓：6 V。

監(jiān)測(cè)離子對(duì)情況見表2。

表2　金剛乙胺和3,5-二甲基金剛胺及金剛烷胺-d15的離子對(duì)Table 2　The MS parameters for detecting rimantadine and memantine

2　結(jié)果與討論

2.1線性關(guān)系及檢出限

表3　測(cè)試結(jié)果Table 3　Testing results of calibration curve

圖1　金剛乙胺標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1　The standard curve of rimantadine

圖2　3,5-二甲基金剛胺標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.2　The standard curve of memantine

準(zhǔn)確移取金剛乙胺和3,5-二甲基金剛胺儲(chǔ)備液適量，用水稀釋成一系列的標(biāo)準(zhǔn)工作液，其濃度分別為0.5、1.0、2.0、5.0、10、20 μg/L。以標(biāo)準(zhǔn)溶液中被測(cè)組分峰面積為縱坐標(biāo)，以濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。平行測(cè)定10次空白試劑加標(biāo)(1.0 ng/mL)的標(biāo)準(zhǔn)偏差為Sb，檢出限CL=3Sb，得出該方法的檢出限為0.5 μg/kg。

線性方程為：

金剛乙胺：y=0.03498x+0.00537 (r=0.99974)

3,5-二甲基金剛胺:y=0.02640x+-0.00168(r=0.99985)

2.2回收率

本方法選擇雞肉干作為加標(biāo)基質(zhì)。分別選取0.5 μg/kg、2.5 μg/kg、10 μg/kg進(jìn)行加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)，每個(gè)水平重復(fù)測(cè)定7次，加標(biāo)情況見表4、表5，回收率見表6、表7。

表4　雞肉干中金剛乙胺的加標(biāo)情況Table 4　Measured values of Rimantadine in chicken dry

表5　雞肉干中3,5二甲基金剛胺的加標(biāo)情況Table 5　Measured value of Memantine in chicken dry

表6　雞肉干中金剛乙胺加標(biāo)回收Table 6　The recovery rate of Rimantadine in chicken dry

表7　雞肉干中3,5-二甲基金剛胺加標(biāo)回收Table 7　The recovery rate of Memantine in chicken dry

表8　基質(zhì)加標(biāo)一覽表Table 8　The recovery rate list

2.3實(shí)驗(yàn)譜圖

2.3.1標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)色譜圖(0.5 ng/mL)

圖3　0.5 ng/mL標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)色譜圖Fig.3　The UPLC-MS/MS of rimantadine and memantine (0.5 ng/mL)

金剛乙胺和3,5二甲基金剛胺為同分異構(gòu)體，4.85 min為金剛乙胺，5.02 min為3,5-二甲基金剛胺。

2.3.2空白基質(zhì)色譜圖(雞肉干)

圖4　空白基質(zhì)色譜圖(雞肉干)Fig.4　The UPLC-MS/MS of blank sample(chicken dry)

2.3.3空白樣品(雞肉干)加標(biāo)色譜圖(加標(biāo)濃度0.5 μg/kg)

圖5　空白樣品加標(biāo)色譜圖Fig.5　The UPLC-MS/MS of rimantadine and memantine in samples after adding standard concentration

2.4精密度分析

同回收率部分選擇雞肉干作為加標(biāo)基質(zhì)。進(jìn)行三個(gè)水平加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)，每個(gè)水平重復(fù)測(cè)定7次，基質(zhì)添加回收的變異系數(shù)(CV)與GB/T 27404-2008要求的變異系數(shù)(CV)范圍比較見表9和表10。

表9　基質(zhì)添加回收的變異系數(shù)與GB/T 27404-2008要求的 變異系數(shù)范圍比較(金剛乙胺)Table 9　The comparison of coefficient of variation (rimantadine)

表10　基質(zhì)添加回收的變異系數(shù)與GB/T 27404-2008要求的 變異系數(shù)范圍比較(3,5-二甲基金剛胺)Table 10　The comparison of coefficient of variation (memantine)

3　結(jié)　論

本實(shí)驗(yàn)采用弱酸性溶液提取，固相萃取法進(jìn)行凈化與富集，運(yùn)用UHPLC-MS/MS技術(shù)對(duì)金剛乙胺和3,5-二甲基金剛胺進(jìn)行測(cè)定。固相萃取法能夠更有效的分離分析物與雜質(zhì)，回收率以及富集倍數(shù)高，有毒溶劑用量少，通過簡(jiǎn)單的操作就能達(dá)到無(wú)相分離，提升了前處理操作安全性，節(jié)省了前處理時(shí)間，提高了實(shí)驗(yàn)效率。本法的檢出限、回收率、精密度能夠滿足實(shí)驗(yàn)要求。相較傳統(tǒng)的化學(xué)方法而言，本方法快速、高效、重現(xiàn)性好，可以應(yīng)用于常規(guī)分析檢測(cè)。

[1]尹暉,孫雷,畢言鋒,等.雞肉和雞蛋中金剛烷胺與金剛乙胺殘留檢測(cè)UPLC-MS/MS法研究[J].中國(guó)獸藥雜志，2014,48(6):32-35.

[2]陸學(xué)勝,朱天夫,許敏,等.金剛烷胺對(duì)帕金森病患者角膜內(nèi)皮細(xì)胞損害作用的研究[J].世界臨床藥物，2010,31(7):417-421.

[3]葉金朝,葉菲.美多巴及金剛烷胺誘發(fā)精神分裂癥及下肢水腫病案分析[J].藥物流行病學(xué)雜志，2002,11(4):219-220.

[4]胡麗芳,張金艷,羅林廣.超高效液相色譜-電噴霧串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定豬尿中金剛烷胺與金剛乙胺的殘留量[J].分析測(cè)試學(xué)報(bào),2014,33(6):678-682.

[5]朱勝平,鐘華,何飛,等.高效液相色譜法測(cè)定鹽酸美金剛脘胺片的含量[J].中南藥學(xué)，2005,3(4):209-210.

[6]徐文彤，劉紅.氣相色譜法測(cè)定硫酸金剛烷胺的含量[J].中國(guó)藥師，2007,10(11):1082-1083.

[7]姜大為,范振莉.氣相色譜法測(cè)定硫酸金剛烷胺的含量[J].黑龍江科技信息，2012(7):32.

[8]龔美義.氣相色譜法測(cè)定1-溴-3,5-二甲基金剛烷的含量[J].化學(xué)工程與裝備，2008(11):121-122.

[9]張麗,張迪,黃海,等.氣相色譜法測(cè)定鹽酸金剛乙胺中3種有關(guān)物質(zhì)[J].中國(guó)藥師，2012,15(10):1450-1452.

[10]姜小林,應(yīng)志洪,吳寧蘋.氣象色譜內(nèi)標(biāo)法測(cè)定鹽酸美金剛含量和有關(guān)物質(zhì)[J].化學(xué)工業(yè)與工程技術(shù)，2014,35(5):75-77.

[11]劉正才,楊方,余孔捷,等.液相色譜-電噴霧串聯(lián)質(zhì)譜法同時(shí)檢測(cè)雞組織中5種抗病毒類藥物的殘留量[J].色譜,2012,30(12):1253-1259.

[12]陳慧華，韋敏玨，周煒，等.液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定動(dòng)物組織中金剛烷胺和金剛乙胺的殘留量[J].質(zhì)譜學(xué)報(bào),2013,34(4):226-232.

[13]魏秀麗,高迎春,陳玲,等.超高效液相-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定雞肉組織中金剛烷胺殘留[J].中國(guó)獸藥雜志，2013,47(6):53-55.

[14]張秀芹,杜柏林.雞組織中金剛烷胺、金剛乙胺殘留檢測(cè)及消減規(guī)律研究[J].實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)，2014(9):210-213.

[15]吳銀良,趙健,葉宇飛,等.同位素稀釋液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定雞蛋中金剛烷胺類藥物殘留量[J].分析測(cè)試學(xué)報(bào),2014,33(8):905-910.

Determination of Rimantadine and Memantine Residues in Chicken Dry by UHPLC-MS/MS

WANG Zhi-wei

(Shanghai Intertek Testing Services Co., Ltd., Shanghai 200233, China)

A simple, fast, accurate method for determination of rimantadine and memantine in chicken dry was developed by ultra high performance liquid chromatography-tandem quadrupole mass spectrometry (UPLC-MS/MS). The sample was concentrated by solid phase extraction column. The linear range of the method was from 1 μg/L to 20 μg/L with a good correlation coefficient, and the detection limit was 0.5 μg/kg. The proposed method exhibited high sensitivity and good reproducibility for determining rimantadine and memantine.

rimantadine;3,5-dimethyl amantadine; memantine; UHPLC-MSMS

王智瑋(1990-)，檢測(cè)工程師，主要從事食品檢測(cè)。

TS207.3

A

1001-9677(2016)09-0120-04