注射用曲克蘆丁有效成分含量測(cè)定方法研究*

金榮富，陳　靜，張　暉，梁麗麗，賀文欣，宮文武，林溪鋮，薛洪寶

(1 安徽宏業(yè)藥業(yè)有限公司，安徽　蚌埠　233045；2 蚌埠醫(yī)學(xué)院 化學(xué)教研室，安徽　蚌埠　233030；3 安徽省蚌埠市食品藥品監(jiān)督管理局，安徽　蚌埠　233000)

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注射用曲克蘆丁有效成分含量測(cè)定方法研究*

金榮富1，陳靜1，張暉2，梁麗麗2，賀文欣2，宮文武3，林溪鋮3，薛洪寶2

(1 安徽宏業(yè)藥業(yè)有限公司，安徽蚌埠233045；2 蚌埠醫(yī)學(xué)院 化學(xué)教研室，安徽蚌埠233030；3 安徽省蚌埠市食品藥品監(jiān)督管理局，安徽蚌埠233000)

采用高效液相色譜法，建立藥品生產(chǎn)企業(yè)檢測(cè)中心快速、有效測(cè)定曲克蘆丁注射液有效成分曲克蘆丁含量的方法。條件為色譜柱：Zorbax Eclipse XDB-C18250 mm×4.6 mm, 5 μm Column (P/N 993967-902/5063-6600)填料色譜柱；柱溫：室溫；流動(dòng)相：磷酸鹽緩沖液:乙腈=80:20為流動(dòng)相；流速：1 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：252 nm。該方法樣品前處理簡(jiǎn)單、精密度高、準(zhǔn)確可靠。能夠滿(mǎn)足藥品生產(chǎn)企業(yè)對(duì)曲克蘆丁含量檢測(cè)要求，操作簡(jiǎn)捷易行，適合于曲克蘆丁注射液的質(zhì)量控制。

曲克蘆丁; 高效液相色譜; 含量

圖1　曲克蘆丁化學(xué)結(jié)構(gòu)

曲克蘆丁(Troxerutin)又名托克蘆丁、三氧乙基蘆丁、維腦路通、維生素P4、羥乙基蘆丁等為蘆丁經(jīng)羥乙基化制成的半合成黃酮化合物[1]，其化學(xué)結(jié)構(gòu)見(jiàn)圖 1。曲克蘆丁可抑制紅細(xì)胞和血小板聚集，防止血栓形成，同時(shí)能增加血中氧飽和度、改善微循環(huán)，在臨床上主要用于治療靜脈障礙、血栓癥、腦血管疾病、抗凝血藥及溶栓藥[2-3]，此外，曲克蘆丁還能對(duì)抗5-羥色胺、緩激肽引起的血管損傷進(jìn)行修復(fù)，增加毛細(xì)血管抵抗力，降低毛細(xì)血管通透性，可防止血管通透性升高引起的水腫，對(duì)急性缺血性腦損傷有顯著的保護(hù)作用等。由于蘆丁分子中有4個(gè)酚羥基，其反應(yīng)產(chǎn)物為多種羥乙基衍生物的混合物[4]。國(guó)內(nèi)目前使用的曲克蘆丁主要成分是7,3’,4’-三羥乙基蘆丁，其它成分還包括單羥乙基蘆丁、二羥乙基蘆丁、三羥乙基蘆丁異構(gòu)體和四羥乙基蘆丁等[5]。本研究擬采用高效液相色譜法測(cè)定曲克蘆丁的含量，將其作為注射用曲克蘆丁的質(zhì)量控制方法。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：該法精密度高、重現(xiàn)性好、結(jié)果準(zhǔn)確可靠。

1　材料與方法

1.1儀器與試劑

儀器：Agilent 1260 LC System (G1312C VL型二元梯度泵，G1329B型自動(dòng)控溫自動(dòng)進(jìn)樣器，G4121A/B型二極管陣列檢測(cè)器)，USA；FA/JA系列精密電子天平(精度：0.0001 g)，天津天馬衡基儀器有限公司；雷磁PHSJ-4A型酸度計(jì) 上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司；微孔過(guò)濾器及濾膜(0.45 μm), 江蘇省鹽城市超宇電子科技有限公司。

試劑：曲可蘆丁對(duì)照品(純度≥98.5%)，上海恒遠(yuǎn)生物科技有限公司；曲可蘆丁注射液(60 mg/支)，安徽宏業(yè)藥業(yè)有限公司(批號(hào)：150401，150409，150421，150426)；乙腈(色譜純)，江蘇漢邦科技有限公司；磷酸二氫鈉(分析純)；磷酸(分析純)；二次蒸餾水。

1.2相關(guān)溶液的配制

準(zhǔn)確稱(chēng)取曲可蘆丁對(duì)照品0.12 g(精確到0.0001 g)，用流動(dòng)相溶液配制成1000 mL標(biāo)準(zhǔn)溶液；分別取不同批次(4批)注射用曲克蘆丁凍干粉針成品(凈含量約60 mg/支)(5支/批)，精確稱(chēng)取，用流動(dòng)相溶液配制成100 mL樣品溶液原液，取原液5 mL用流動(dòng)相稀釋至100 mL，所得樣品溶液濃度約為0.1500 mg/mL；每?jī)蓚€(gè)批次為一組，再分別取批號(hào)為150401，150409的曲可蘆丁注射液樣品(2支/批)，配制成兩個(gè)批次的混合樣品，濃度約為0.3750 mg/mL，作為曲克蘆丁有關(guān)物質(zhì)供試品溶液；采用同樣的方法，配制兩個(gè)批次的混合樣品，濃度約為0.0750 mg/mL，作為曲克蘆丁有關(guān)物質(zhì)對(duì)照品溶液。采用同樣的方法將批號(hào)為150421，150426的曲克蘆丁注射液樣品配成相應(yīng)的溶液。將上述溶液4℃下保存，待測(cè)。樣品溶液測(cè)定前使用0.45 μm濾膜過(guò)濾。

1.3實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1色譜條件

色譜柱：Zorbax Eclipse XDB-C18250 mm×4.6 mm, 5 μm Column (P/N 993967-902/5063-6600)填料色譜柱；柱溫：室溫；流動(dòng)相：磷酸鹽緩沖液:乙腈=80:20為流動(dòng)相(磷酸鹽緩沖液為0.1 mol/L磷酸二氫鈉溶液，用磷酸調(diào)節(jié)pH值至4.4)；流速：1 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：252 nm。

分別取上述待測(cè)溶液20 μL，進(jìn)行高效液相色譜分離分析，記錄色譜圖。在本實(shí)驗(yàn)條件下，曲克蘆丁色譜峰保留時(shí)間約為5.7 min。根據(jù)外標(biāo)定量法計(jì)算色譜峰面積。

1.4數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)所得數(shù)據(jù)采用Origin 7.0軟件處理、統(tǒng)計(jì)、分析、作圖。

2　結(jié)　果

2.1色譜條件的優(yōu)化

2.1.1流動(dòng)相的選擇

由于曲克蘆丁分子中含有多個(gè)酚羥基和多個(gè)鄰位醇羥基(圖 1)，因此，化學(xué)性質(zhì)具備酚和多元醇的性質(zhì)，具有弱酸性。為了保證色譜分離過(guò)程中，曲克蘆丁樣品處于分子狀態(tài)，而不是離子狀態(tài)，流動(dòng)相選擇弱酸性流動(dòng)相，采用磷酸調(diào)節(jié)pH值4.4左右。由于此化合物含多個(gè)酚羥基和多個(gè)鄰位醇羥基，分子具有一定極性，流動(dòng)相選擇極性較大的體系，采用水:乙腈=80:20作為流動(dòng)相。此流動(dòng)相比例既能保證注射劑中曲克蘆丁有效成分得到有效分離，又能保證保留時(shí)間盡可能短，以免保留時(shí)間過(guò)長(zhǎng)產(chǎn)生縱向擴(kuò)散，產(chǎn)生分離度降低的不利影響。

2.1.2檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇

曲克蘆丁分子中有多個(gè)苯環(huán)結(jié)構(gòu)(圖 1)，在254 nm附近具有較大紫外吸收峰。通過(guò)預(yù)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)高效液相色譜檢測(cè)器波長(zhǎng)設(shè)置為252 nm時(shí)，有最大紫外吸收。因此檢測(cè)器波長(zhǎng)選擇252 nm。可能原因是曲克蘆丁分子在水溶液中多個(gè)酚羥基產(chǎn)生的溶劑化作用，使檢測(cè)最大波長(zhǎng)比254 nm略有偏差。

2.2曲克蘆丁的定性分析及重現(xiàn)性分析

分別取1.2中的曲可蘆丁標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照品溶液，連續(xù)重復(fù)5次進(jìn)樣，并以空白溶劑為對(duì)照。所得色譜圖見(jiàn)圖 2曲克蘆丁標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照品高效液相色譜圖。曲克蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品平均保留時(shí)間約為5.728 min。對(duì)譜圖進(jìn)行積分，計(jì)算重現(xiàn)性結(jié)果見(jiàn)表 1。實(shí)驗(yàn)相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差<2.5%，表明本實(shí)驗(yàn)條件下精密度較高，重現(xiàn)性好。

圖2　曲克蘆丁標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照品高效液相色譜圖(n=5)

曲克蘆丁的定性分析結(jié)果和重現(xiàn)性試驗(yàn)結(jié)果滿(mǎn)足《中華人民共和國(guó)藥典》(2010版)中的定性分析實(shí)驗(yàn)要求，定性分析結(jié)果相對(duì)客觀[6]。

表1　曲克蘆丁重現(xiàn)性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.3定量分析方法的建立

分別取批號(hào)為150401，150409的曲可蘆丁注射液樣品，在給定的色譜條件下進(jìn)樣分析，每個(gè)樣品重復(fù)兩次，得出相應(yīng)的待測(cè)樣品色譜圖(圖 3 A, B)，根據(jù)面積歸一化法求出色譜峰面積。將峰面積、保留時(shí)間、峰寬對(duì)稱(chēng)因子等色譜峰定量信息匯總于表 2中。采用同樣的方法測(cè)定批號(hào)為150401，150409的曲克蘆丁有關(guān)物質(zhì)對(duì)照品和曲克蘆丁有關(guān)物質(zhì)供試品溶液，得出色譜圖定量分析信息匯總于表2中。計(jì)算出樣品溶液平均值，偏差和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差。根據(jù)測(cè)定的樣品溶液曲克蘆丁含量值計(jì)算出原批次中每支藥效成分曲克蘆丁含量。采用同樣方法對(duì)批號(hào)為150421，150426的曲可蘆丁注射液樣品進(jìn)行上述測(cè)定分析，所得實(shí)驗(yàn)結(jié)果匯總于表 2中。

圖3　曲克蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品及待測(cè)樣品高效液相色譜圖

曲克蘆丁注射液樣品有效成分測(cè)定結(jié)果表明：兩個(gè)測(cè)試組中，曲克蘆丁有關(guān)物質(zhì)對(duì)照品和曲克蘆丁有關(guān)物質(zhì)供試品的保留時(shí)間與對(duì)應(yīng)樣品的保留時(shí)間基本接近，第一組RSD<1.1，第二組RSD<0.2.此結(jié)果驗(yàn)證了定性分析結(jié)果的客觀性。兩測(cè)試組中對(duì)應(yīng)樣品的色譜峰參數(shù)：峰面積、峰高、峰寬、對(duì)稱(chēng)因子等所產(chǎn)生的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差均較小，符合定量分析實(shí)驗(yàn)要求。

表2　曲克蘆丁注射液樣品有效成分測(cè)定結(jié)果

注：S150401-1表示批號(hào)，每一批號(hào)樣品測(cè)定兩次；有對(duì)：曲克蘆丁有關(guān)物質(zhì)對(duì)照品；有供：曲克蘆丁有關(guān)物質(zhì)供試品。

曲克蘆丁注射液樣品藥效成分含量分析結(jié)果顯示：每支注射用曲克蘆丁所含藥效成分曲克蘆丁在(58～63) mg之間，區(qū)間范圍在質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)控制范圍(60±5) mg/支之內(nèi)，屬于合格產(chǎn)品。

3　結(jié)　論

本研究建立了制藥企業(yè)化驗(yàn)檢測(cè)中心快速有效測(cè)定曲克蘆丁注射液有效成分曲克蘆丁含量的方法。該方法樣品前處理簡(jiǎn)單、精密度高、準(zhǔn)確可靠。能夠滿(mǎn)足藥品生產(chǎn)企業(yè)對(duì)曲克蘆丁含量檢測(cè)要求，操作簡(jiǎn)捷易行，可靠性高。

[1]李正,王曉江,趙語(yǔ). 反相高效液相色譜法測(cè)定血漿中曲克蘆丁含量[J], 藥物研究, 2009, 18(2):23-24.

[2]周昌奎,吳曉華. 曲克蘆丁臨床研究新進(jìn)展[J]. 中國(guó)生化藥物雜志, 2005, 26(5): 317-319.

[3]施潔明,陳偉盛,林玲. 梯度洗脫HPLC法測(cè)定曲克蘆丁片的組分含量[J], 今日藥學(xué), 2012,22(5): 285-288.

[4]王厚全, 任慧霞, 王本杰, 等. 三羥乙基蘆丁對(duì)照品的制備[J]. 中國(guó)藥學(xué)雜志, 2004, 39(7): 548-549.

[5]李軍,徐本明,劉珂. 曲克蘆丁對(duì)照品的制備液相色譜法分離[J]. 中國(guó)醫(yī)藥工業(yè)雜志, 2004,35(5): 285-287.

[6]國(guó)家藥典委員會(huì). 中華人民共和國(guó)藥典2010年版二部 [M], 北京：中國(guó)醫(yī)藥科技出版社,附錄:890-891.

Determination of Active Ingredient Content in Injection Troxerutin*

JINRong-fu1,CHENJing1,ZHANGHui2,LIANGLi-li2,HEWen-xin2,GONGWen-wu3,LINXi-cheng3,XUEHong-bao2

(1 Anhui Hongye Pharmaceutical Co., Ltd., Anhui Bengbu 233045; 2 Department of Chemistry, Bengbu Medical College, Anhui Bengbu 233030; 3 Bengbu Food & Drug Administration in Anhui, Anhui Bengbu 233030, China)

The effective rapid measurement method to detect the Troxerutin active ingredient in injection Troxerutin was established based on High Performance Liquid Chromatography (HPLC). The method can be used in Laboratory Centre of the pharmaceutical production enterprises. The optimum conditions were as follows: Zorbax Eclipse XDB-C18250×4.6 mm, 5 μm Column (P/N 993967-902/5063-6600) packing column was used at room temperature, and phosphate buffer:acetonitrile=80:20 was applied as mobile phase in flow rate of 1 mL/min, and 252 nm detection wavelength were chosen by experiment. It provided a new, convenient, rapid, accurate and reliable method for the detection of Troxerutin active ingredient in injection Troxerutin. The method can be used on troxerutin quality control in the drug manufacturer.

troxerutin; HPLC; content

蚌埠市社會(huì)科學(xué)規(guī)劃項(xiàng)目(No.BB15B016)；安徽省高等學(xué)校省級(jí)優(yōu)秀青年人才基金重點(diǎn)項(xiàng)目(No.2013SQRL051ZD)；安徽省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(No.1308085QB24)；安徽省高等教育振興計(jì)劃重大教學(xué)改革研究項(xiàng)目(No.2015zdjy101);安徽省省級(jí)質(zhì)量工程教學(xué)研究項(xiàng)目(No.2014jyxm211)；安徽省高等教育振興計(jì)劃部分項(xiàng)目(No.201510367003)；國(guó)家級(jí)大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃項(xiàng)目(No.201410367014)；蚌埠醫(yī)學(xué)院教學(xué)研究項(xiàng)目(No.jyxm1506)。

金榮富(1964-)，男，安徽宏業(yè)藥業(yè)有限公司質(zhì)量負(fù)責(zé)人，本科，執(zhí)業(yè)藥師，主要從事藥物生產(chǎn)質(zhì)量控制研究工作。

薛洪寶(1979-)，男，蚌埠醫(yī)學(xué)院副教授，博士,碩士生導(dǎo)師。

R917

A

1001-9677(2016)03-0106-03