利用SSR分子標(biāo)記構(gòu)建四倍體雜交冰草的遺傳連鎖圖譜

姜志艷，于肖夏，于卓*，張志成，石悅，姜超

(1.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010019；2.內(nèi)蒙古科技大學(xué)數(shù)理與生物工程學(xué)院，內(nèi)蒙古 包頭 014010)

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利用SSR分子標(biāo)記構(gòu)建四倍體雜交冰草的遺傳連鎖圖譜

姜志艷1，2，于肖夏1，于卓1*，張志成1，石悅1，姜超1

(1.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010019；2.內(nèi)蒙古科技大學(xué)數(shù)理與生物工程學(xué)院，內(nèi)蒙古 包頭 014010)

為構(gòu)建四倍體雜交冰草分子遺傳連鎖圖譜，對(duì)深入開(kāi)展冰草產(chǎn)量、抗性等重要性狀的QTL定位及分子標(biāo)記輔助育種提供依據(jù)，以四倍體雜種F2分離群體的347個(gè)單株及親本蒙古冰草和航道冰草為材料，采用SSR分子標(biāo)記技術(shù)和Joinmap 4.0軟件進(jìn)行了遺傳作圖研究。試驗(yàn)從256對(duì)SSR引物中篩選出條帶清晰穩(wěn)定、多態(tài)性豐富的適宜引物30對(duì)，PCR擴(kuò)增得到224個(gè)SSR標(biāo)記位點(diǎn)，平均每對(duì)引物擴(kuò)增出7.47個(gè)位點(diǎn)，其中多態(tài)性標(biāo)記位點(diǎn)185個(gè)，占82.6%。偏分離分析顯示，在185個(gè)SSR多態(tài)性標(biāo)記位點(diǎn)中有24個(gè)標(biāo)記產(chǎn)生偏分離，占13.0%，符合植物遺傳作圖時(shí)通常偏分離標(biāo)記比率<30%的要求，可用于遺傳作圖。構(gòu)建了1張四倍體雜交冰草的分子遺傳連鎖框架圖譜，該圖譜包含14個(gè)連鎖群、185個(gè)標(biāo)記，其長(zhǎng)度范圍在123.0～202.6 cM之間，連鎖群LG4最長(zhǎng)、LG12最短，各連鎖群的平均長(zhǎng)度167.32 cM，覆蓋基因組總長(zhǎng)度2342.5 cM，標(biāo)記間的平均距離12.66 cM。

雜交冰草；四倍體；SSR標(biāo)記；遺傳連鎖圖譜

冰草為多年生草本植物，隸屬于禾本科小麥族(Triticeae)。其抗逆性強(qiáng)、適應(yīng)性廣，飼用和生態(tài)價(jià)值高，可用于退化的天然草地改良、人工草地建植及公路和鐵路護(hù)坡等水土保持[1-2]。四倍體雜交冰草(Agropyronmongolicum×A.cristatumcv. Fairway，2n=4x=28)是課題組利用國(guó)產(chǎn)蒙古冰草(A.mongolicum，2n=2x=14)與產(chǎn)自美國(guó)的航道冰草(A.cristatumcv. Fairway，2n=2x=14)相組配，人工去雄授粉雜交獲得的二倍體雜種F1，經(jīng)秋水仙堿溶液加倍染色體而育成的優(yōu)良牧草，其既有母本蒙古冰草耐寒抗旱、適應(yīng)性強(qiáng)等優(yōu)良特性，又有父本航道冰草再生性和分蘗性強(qiáng)、耐倒伏、葉量大、營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和產(chǎn)量高的特點(diǎn)[3-5]。

簡(jiǎn)單序列重復(fù)SSR(simple sequence repeat)是一項(xiàng)成熟的DNA標(biāo)記技術(shù)，因其具有重復(fù)性好、多態(tài)性豐富、標(biāo)記呈共顯性等優(yōu)點(diǎn)，在作物品種和雜種真實(shí)性鑒定、種質(zhì)資源遺傳差異分析、輔助選擇育種、分子遺傳連鎖圖譜建立等方面已得到應(yīng)用[6-9]。由于大多數(shù)多年生禾本科或豆科牧草都具有多倍性和異花授粉等生物學(xué)特性[10]，其復(fù)雜的遺傳背景使得牧草的遺傳作圖、重要性狀QTL定位及分子標(biāo)記輔助育種研究工作相比作物進(jìn)展較慢。1993年Brummer等[11]最早利用RFLP分子標(biāo)記構(gòu)建了四倍體紫花苜蓿(Medicagosativa)的遺傳連鎖圖，之后在二倍體的羊茅(Festucaspp.)、黑麥草(Loliumspp.)、高丹草(Sorghum-Sudangrass)及二倍體雜交冰草等牧草上構(gòu)建了分子遺傳連鎖圖譜[12-15]，而有關(guān)四倍體雜交冰草的遺傳作圖至今未見(jiàn)有研究報(bào)道。本試驗(yàn)以四倍體雜交冰草F2群體為作圖材料，擬利用SSR分子標(biāo)記技術(shù)構(gòu)建四倍體雜交冰草分子遺傳連鎖圖譜，為深入開(kāi)展四倍體冰草重要農(nóng)藝性狀的QTL定位、分子標(biāo)記輔助育種及基因圖位克隆等奠定基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1供試材料

材料為四倍體雜交冰草F2群體的單株及其親本蒙古冰草和航道冰草，種植于呼和浩特市賽罕區(qū)內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)場(chǎng)的飼草材料圃內(nèi)。試驗(yàn)于2014年5月—2015年5月在田間和室內(nèi)進(jìn)行。

1.2DNA的提取與純度檢測(cè)

從四倍體雜交冰草F2群體內(nèi)隨機(jī)取347個(gè)單株及其父母本各10個(gè)單株的嫩葉，用北京天根公司生產(chǎn)的植物基因組試劑盒提取DNA，1.6%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)其DNA純度后稀釋至50 ng/μL，置于-20℃冰箱中備用[16]。

1.3SSR-PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系和程序

SSR-PCR擴(kuò)增體系：反應(yīng)液總體積為20 μL，其中含50 μmol/L 的10×Buffer 2.0 μL、2.5 mmol/L的 dNTP 2.0 μL、25 mmol/L的MgCl21.8 μL、50 μmol/L的Forward primer和 Reverse primer各 1.0 μL、5 U/μL的Taq DNA聚合酶0.1 μL、模板DNA 1.0 μL、ddH2O 11.1 μL。SSR-PCR擴(kuò)增程序：94℃ 5 min，94℃ 30 s，56℃ 30 s，72℃ 1 min，30個(gè)循環(huán)，72℃延伸10 min[17]。

1.4PCR擴(kuò)增產(chǎn)物檢測(cè)及SSR引物來(lái)源

PCR反應(yīng)結(jié)束后，加入6.0 μL變性劑，于PCR儀上95℃變性5 min，用7%的變性聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行電泳，功率70 W，預(yù)電泳30 min，電泳時(shí)間2 h。電泳膠板在乙醇-冰乙酸溶液中固定，AgNO3溶液中染色，NaOH-甲醛溶液中顯影，風(fēng)干后照相[18]。

試驗(yàn)所用的256對(duì)SSR引物，是從NCBI網(wǎng)站公布的禾本科作物小麥(Triticumaestivum)、玉米(Zeamays)和高粱(Sorghumbicolor)上開(kāi)發(fā)的部分SSR引物中選取，送至上海生物工程有限公司進(jìn)行合成。

1.5SSR多態(tài)性位點(diǎn)統(tǒng)計(jì)

按膠板點(diǎn)樣順序?qū)γ總€(gè)位點(diǎn)上的多態(tài)性位點(diǎn)條帶進(jìn)行記錄，有帶記為“1”，無(wú)帶記為“0”，帶型模糊不清或缺失的記為“—”，生成“0”和“1”組成的原始矩陣進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。多態(tài)性標(biāo)記位點(diǎn)百分率計(jì)算公式：P(%)=(K/N)×100，式中,K為多態(tài)性位點(diǎn)數(shù)目、N為觀測(cè)位點(diǎn)總數(shù)[19]。同一SSR引物PCR擴(kuò)增2～3次，統(tǒng)計(jì)電泳膠板條帶清晰穩(wěn)定后的多態(tài)性位點(diǎn)。

1.6SSR標(biāo)記偏分離統(tǒng)計(jì)

依據(jù)孟德?tīng)柗蛛x規(guī)律，四倍體雜交冰草F2群體基因型理論分離比為3∶1，將每個(gè)SSR標(biāo)記的基因型數(shù)目進(jìn)行卡方檢驗(yàn)(χ2測(cè)驗(yàn))，凡P<0.05的SSR標(biāo)記均列入偏分離標(biāo)記之內(nèi)。

1.7SSR分子遺傳連鎖圖譜構(gòu)建

將統(tǒng)計(jì)的SSR標(biāo)記數(shù)據(jù)中的“0”和“1”原始矩陣分別轉(zhuǎn)換成F2群體所要求的數(shù)據(jù)格式，應(yīng)用計(jì)算機(jī)作圖軟件Joinmap 4.0，構(gòu)建以SSR分子標(biāo)記為基礎(chǔ)的四倍體雜交冰草的分子遺傳連鎖圖譜。具體步驟：開(kāi)New project命令創(chuàng)建一個(gè)新的文件夾；選擇Options，設(shè)置參數(shù)即選擇作圖群體模式、群體數(shù)量和標(biāo)記位點(diǎn)數(shù)；導(dǎo)入數(shù)據(jù)，選擇LOD Groupings (tree) 窗口，用Calculate命令進(jìn)行標(biāo)記連鎖分組(LOD=3.0～10.0)，選用LOD≥3.0標(biāo)記連鎖組群，運(yùn)行Create Groups for Mapping命令得到用于作圖的連鎖群；選擇Calculate map命令構(gòu)建連鎖圖譜；用Map chart完成圖譜的繪制。

2　結(jié)果與分析

2.1各材料基因組DNA的純度檢測(cè)

用DNA試劑盒提取的四倍體雜交冰草F2群體347個(gè)單株及其親本的基因組DNA，其電泳條帶清晰穩(wěn)定、無(wú)降解、無(wú)蛋白和RNA污染(圖1)，表明各材料的DNA純度高，符合SSR分子標(biāo)記試驗(yàn)的要求。

圖1　F2群體部分單株基因組DNA電泳純度檢測(cè)Fig.1　Genomic DNA electrophoresis purity test of partial plants of the F2 population 　P1：蒙古冰草；P2：航道冰草；1-31：F2群體部分單株。M：Marker DL 2000.P1：A. mongolicum； P2：A. cristatum cv. Fariway；1-31：Partial plants of the F2 population.

2.2SSR引物篩選及多態(tài)性分析

用親本蒙古冰草和航道冰草及其四倍體雜種F2群體1個(gè)單株的基因組DNA為模板進(jìn)行適宜引物篩選，從256對(duì)SSR引物中選出條帶清晰、重復(fù)性和多態(tài)性好的SSR適宜引物30對(duì)(表1，圖2)。

利用這30對(duì)引物對(duì)F2作圖群體347個(gè)單株及親本的DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，共獲得224個(gè)位點(diǎn)，平均每對(duì)引物擴(kuò)增出7.47個(gè)位點(diǎn)，其中多態(tài)性標(biāo)記位點(diǎn)185個(gè)，平均多態(tài)性標(biāo)記位點(diǎn)百分率為82.6%，表明該四倍體雜交冰草F2群體的SSR多態(tài)性豐富(圖3，表1)。

2.3SSR作圖標(biāo)記的分離及遺傳連鎖圖譜特征分析

SSR標(biāo)記分離及連鎖圖譜的基本特征如表2和圖4所示。經(jīng)卡方檢驗(yàn)表明，當(dāng)P<0.05時(shí)，在已獲得的185個(gè)SSR多態(tài)性標(biāo)記位點(diǎn)中，有161個(gè)標(biāo)記符合孟德?tīng)柗蛛x比例，其占標(biāo)記總數(shù)的87.0%。另有24個(gè)SSR標(biāo)記產(chǎn)生偏分離，偏分離比例僅為13.0%，符合植物遺傳作圖時(shí)通常偏分離標(biāo)記比率<30%的要求[20]，這185個(gè)SSR分子標(biāo)記均可用于遺傳作圖。

利用Joinmap 4.0軟件對(duì)185個(gè)SSR標(biāo)記進(jìn)行連鎖分析，構(gòu)建出1張四倍體雜交冰草的SSR分子遺傳連鎖框架圖譜，該圖譜包含14個(gè)連鎖群、185個(gè)標(biāo)記，14個(gè)連鎖群的長(zhǎng)度范圍在123.0～202.6 cM之間，連鎖群LG12最短、LG4最長(zhǎng)，各連鎖群的平均長(zhǎng)度為167.32 cM，總長(zhǎng)度為2342.5 cM，標(biāo)記間的平均距離為12.66 cM。

表1　適宜SSR引物堿基序列及其多態(tài)性標(biāo)記位點(diǎn)Table 1　Nucleotide sequence of SSR primers and polymorphic markers loci

圖2　用F2的1個(gè)單株及雙親的DNA對(duì)部分SSR引物篩選結(jié)果Fig.2　SSR primer screening result with one plant in F2 population and parents　F2：F2 的1個(gè)單株；P1：蒙古冰草；P2：航道冰草。 F2：One plant of hybrid F2；P1：A. mongolicum；P2：A. cristatum cv. Fariway.

圖3　引物D965(A)和F3974(B)對(duì)F2分離群體部分單株及其親本DNA的擴(kuò)增結(jié)果Fig.3　DNA amplified results of partial plants of F2 segregating population in hybrid wheatgrass and their parents using the primer D965(A)and F3974(B)　P1：蒙古冰草；P2：航道冰草；1-55：F2群體部分單株。M：Marker DL 1000.P1：A. mongolicum；P2：A. cristatum cv. Fariway；1-55：F2 partial plants.

連鎖群Linkagegroups連鎖群長(zhǎng)度Maplength(cM)連鎖標(biāo)記數(shù)No.oflinkedmarkers偏分離標(biāo)記數(shù)(P<0.05)No.ofbiasedmarkers偏分離標(biāo)記比率Ratioofdistortedmarkers(%)標(biāo)記間平均距離Averagedistance(cM)LG1174.95120.034.98LG2175.410220.017.54LG3180.850036.16LG4202.629413.86.99LG5195.31827.111.49LG6147.541611.83.60LG7150.512216.712.54LG8141.430047.13LG9151.230050.40LG10178.014321.412.71LG11161.32328.77.01LG12123.07114.317.57LG13178.41010.117.84LG14182.250036.44合計(jì)Total2342.51852413.012.66

圖4　四倍體雜交冰草SSR分子遺傳連鎖框架圖譜Fig.4　SSR genetic linkage map of tetraploid hybrid wheatgrass

3　討論

高密度的分子遺傳連鎖圖譜是深入開(kāi)展植物重要性狀QTL定位及分子標(biāo)記輔助育種等研究的基礎(chǔ)[21-22]。與小麥、玉米、水稻(Oryzasativa)等農(nóng)作物構(gòu)建的遺傳連鎖圖相比，目前國(guó)內(nèi)外已構(gòu)建的牧草遺傳連鎖圖譜的圖幅均偏小，且標(biāo)記間空隙較大，使得遺傳圖譜在牧草分子標(biāo)記輔助育種及重要性狀QTL定位等研究方面較薄弱。本課題組曾利用蒙古冰草×航道冰草雜種F2分離群體構(gòu)建了含7個(gè)連鎖群、175個(gè)分子標(biāo)記(AFLP標(biāo)記152個(gè)、RAPD標(biāo)記23個(gè))的二倍體雜交冰草分子遺傳圖譜，其全長(zhǎng)為416 cM，平均標(biāo)記間密度為2.47 cM[15]；本試驗(yàn)構(gòu)建了含14個(gè)連鎖群、185個(gè)SSR標(biāo)記的四倍體雜交冰草分子遺傳連鎖圖譜，其全長(zhǎng)為2342.5 cM，遠(yuǎn)超過(guò)二倍體雜交冰草圖譜的長(zhǎng)度，表明四倍體的基因組明顯大于二倍體；但標(biāo)記間的密度(12.66 cM)小于二倍體，而且在各連鎖群上標(biāo)記的分布密度不均勻，如連鎖群LG6上的標(biāo)記數(shù)較多，密集了40個(gè)SSR標(biāo)記，而連鎖群LG8和LG9上SSR標(biāo)記數(shù)均只有3個(gè)，這說(shuō)明該圖譜是一張SSR框架圖譜，還有待于進(jìn)一步擴(kuò)大SSR標(biāo)記數(shù)量或與其他分子標(biāo)記如AFLP及SRAP等進(jìn)行整合，來(lái)增加圖譜中的分子標(biāo)記數(shù)目、加大圖譜密度，目前課題組正在開(kāi)展四倍體雜交冰草遺傳連鎖圖譜的加密研究。

遺傳圖譜精確度的高低很大程度取決于構(gòu)建群體的大小，理論上作圖群體越大，作圖精度就越高，但若作圖群體過(guò)大，就會(huì)使實(shí)驗(yàn)工作量和費(fèi)用相應(yīng)增加，故選擇合適的群體數(shù)目很重要[23-24]。從作圖效率看，作圖群體的大小主要決定于3個(gè)方面：一是參照隨機(jī)分離的結(jié)果計(jì)算出最大圖距，二是兩個(gè)標(biāo)記間能夠測(cè)算出重組的最小圖距，三是所選用作圖群體的類型。為了能夠提高作圖精度，在構(gòu)建植物分子標(biāo)記連鎖圖時(shí)需考慮作圖群體的類型，一般認(rèn)為作圖所需的群體大小的順序?yàn)镕2>Rl>BC和DH[25]。目前在牧草上遺傳圖譜構(gòu)建所用的作圖群體在100～200個(gè)之間，本試驗(yàn)選用四倍體雜交冰草F2分離群體的347個(gè)單株進(jìn)行遺傳作圖研究，主要考慮多年生牧草的多倍性，其數(shù)量性狀分離復(fù)雜且表型受環(huán)境影響較大，因此控制試驗(yàn)誤差顯得尤為重要。

4　結(jié)論

試驗(yàn)篩選出條帶清晰、重復(fù)性和多態(tài)性好的SSR適宜引物30對(duì)。對(duì)四倍體雜交冰草F2群體347個(gè)單株及親本的基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增得到185個(gè)SSR標(biāo)記。構(gòu)建了1張四倍體雜交冰草SSR分子遺傳連鎖框架圖譜，其14個(gè)連鎖群的長(zhǎng)度變幅123.0～202.6 cM，覆蓋基因組總長(zhǎng)度2342.5 cM，標(biāo)記間的平均距離12.66 cM。

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*Construction of a genetic linkage map for tetraploid hybrid wheatgrass using a SSR molecular marker

JIANG Zhi-Yan1,2，YU Xiao-Xia1，YU Zhuo1*，ZHANG Zhi-Cheng1，SHI Yue1，JIANG Chao1

1.AgronomyCollege，InnerMongoliaAgriculturalUniversity，Huhhot010019，China；2.SchoolofMathematics,PhysicsandBiologicalEngineering，InnerMongoliaUniversityofScience&Technology，Baotou014010，China

To establish a genetic linkage map in tetraploid hybrid wheatgrass genetic mapping was conducted using a simple sequence repeats (SSR) molecular marker technique with ‘Joinmap’ 4.0 software. 347 individuals from the F2segregating population and their parents were utilized, this helped lay the foundation for further study of marker-assisted breeding, and quantitative trait locus (QTL) location of important traits in wheatgrass, such as disease resistance and yield. Thirty optimal primers with clear, stable and high polymorphic bands were screened from 256 tested SSR primers. A total of 224 SSR loci were obtained from polymerase chain reaction (PCR) amplification with an average of 7.47 loci per primer, of which 185 were polymorphic loci, accounting for 82.6% of all loci. Segregation distortion analysis showed that a total of 24 loci were distorted, accounted for 13.0% of all (185) polymorphic loci, which met the requirement of <30% segregation distortion for plant genetic mapping. These polymorphic loci would be useful for genetic mapping. In this study, a molecular genetic linkage map of tetraploid hybrid wheatgrass was constructed which contained 185 loci and 14 linkage groups with length ranging from 123.0 to 202.6 cM. The longest and the shortest linkage group were LG4 and LG12, respectively. The average length of each linkage group was 167.32 cM, total length of the genome was 2342.5 cM and the average marker distance was 12.66 cM.

hybrid wheatgrass; tetraploid; SSR marker; genetic linkage map

10.11686/cyxb2015410

http://cyxb.lzu.edu.cn

2015-09-06；改回日期：2015-10-21

國(guó)家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目(31172254)資助。作者簡(jiǎn)介：姜志艷(1976-)，女，內(nèi)蒙古包頭人，講師，博士。E-mail: L2359916@sina.com

Corresponding author. E-mail：yuzhuo58@sina.com

姜志艷，于肖夏，于卓，張志成，石悅，姜超. 利用SSR分子標(biāo)記構(gòu)建四倍體雜交冰草的遺傳連鎖圖譜. 草業(yè)學(xué)報(bào), 2016, 25(6): 94-101.

JIANG Zhi-Yan，YU Xiao-Xia，YU Zhuo，ZHANG Zhi-Cheng，SHI Yue，JIANG Chao. Construction of a genetic linkage map for tetraploid hybrid wheatgrass using a SSR molecular marker. Acta Prataculturae Sinica, 2016, 25(6): 94-101.