鴨茅香柱菌形態學、生理學及系統發育研究

王正鳳，李秀璋，李春杰*

(1.草地農業系統國家重點實驗室,蘭州大學草地農業科技學院,甘肅 蘭州 730020；2.白銀市農業科學研究所,甘肅 白銀 730900)

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鴨茅香柱菌形態學、生理學及系統發育研究

王正鳳1,2，李秀璋1，李春杰1*

(1.草地農業系統國家重點實驗室,蘭州大學草地農業科技學院,甘肅 蘭州 730020；2.白銀市農業科學研究所,甘肅 白銀 730900)

本文對新疆鴨茅進行采樣調查，發現在鴨茅的分蘗上長有真菌子座，子座圓柱狀，成熟期為黃色，表面粗糙，子座長45～55 mm；在PDA培養基上25℃培養2周后，菌落直徑45～54 mm，菌落正面白色，棉質，質地緊密，中央隆起或稍有皺褶，背面白色至黃色；菌絲體細長，分枝，分隔，不易產生分生孢子。在受到脅迫時產生孢子，孢子梗長13～33 μm，基部寬2.7～4.1 μm，頂端變尖小于1 μm；分生孢子無色透明，橢圓形或腎形，單個頂生，(4.1±0.5) μm×(2.2±0.5) μm；為典型的Epichloё屬真菌。利用碳源能力由強到弱依次為：蔗糖>果糖>葡萄糖>淀粉。利用硝酸銨的能力最強，之后依次為蛋白胨和硝酸鉀，具有分解酪蛋白淀粉能力。選擇菌株Ed0907，利用rDNA-ITS序列分析構建了系統發育樹，結果表明分離菌株(Ed0907)與Epichloёtyphina聚為一枝，相似率為100%。根據以上結果，確定分離菌株為Epichloё真菌。

內生真菌；Epichloё-Dactylisglomerata共生體；培養特征；ITS序列

鴨茅(Dactylisglomerata)又名雞腳草、果園草，是禾本科疏叢型多年生優質牧草[1]，營養豐富，草質柔軟，適口性好，產草量高，耐旱、耐熱、耐瘠薄以及耐蔭能力均較強[2]，近年來，鴨茅在我國四川、重慶、山西、甘肅、黑龍江、青海、新疆、陜西、貴州、云南、湖北、吉林、江蘇等省廣泛栽培應用[3]。據報道，2004年在美國俄勒岡州生產的鴨茅種子幾乎均感染香柱菌，由此造成的損失約為820000美元；在法國，被香柱菌侵染的鴨茅在一年或兩年后將失去再生產能力；英國一年生的鴨茅發生香柱菌的幾率很低，但是二年生和五年生的鴨茅其侵染率分別達到33%和81%[4]。國內有關香柱菌侵染鴨茅的研究鮮見于報道。

香柱菌(Epichloё)是一類侵染禾本科植物的麥角菌科的內生真菌, 其主要分布于宿主禾草地上部分，往往與宿主形成較為穩定的互惠共生關系。攜帶這類真菌的大部分宿主禾草可產生大量的吲哚乙酸、麥角纈氨酸和波胺等次級代謝物，增加宿主分蘗數，促進禾草生長，提高宿主禾草抗病蟲、抗食草動物等[5-6]。在一些生長環境條件下，部分Epichloё屬真菌在宿主禾草分蘗上產生子座，阻礙該分蘗的抽穗和結實，嚴重影響種子發育[7]。

目前，已報道Epichloё屬真菌共有43種[15]，中國7種，我國內生真菌資源較為豐富，仍有許多未知內生真菌有待于進一步挖掘[15-16]。Li等[17]首次從分布于新疆的鴨茅葉鞘上發現了香柱菌形成的子座，并對其形態特征進行了初步報道。本文以這一內生真菌菌株為研究材料，對其形態學、生理學特征及系統發育學進行深入研究，為香柱菌與鴨茅的共生機制及其這一真菌資源的有效利用提供基礎。

1　材料與方法

1.1材料

2009年在新疆阿勒泰地區采集葉鞘上長有真菌子座的鴨茅。將植物樣品從莖基部剪斷，取其地上部分，樣品于4℃低溫保存備用。

1.2香柱菌屬真菌的分離、培養和保存

將植物樣品組織切成小段(5 mm)，經NaClO(1%)消毒后置于PDA 培養基上，培養皿置于25℃培養箱中培養3～7 d。待組織切口處長出菌絲，及時轉接至新鮮PDA培養基上培養，重復純化4次以上，然后接到試管斜面放入4℃冰箱保存。

1.3香柱菌屬真菌分類學及生理學特征研究

香柱菌在PDA平板上25℃培養3周后，用滅菌的打孔器(孔徑6 mm)在培養基的周圍新鮮菌絲上打孔，將菌餅接入盛有PDA、不同的碳源(蔗糖、果糖、葡萄糖和淀粉)、氮源(硝酸鉀、硝酸銨和蛋白胨)、淀粉-牛奶平板培養基的培養皿(9 cm)上，每皿接一個菌餅(設置3個重復)，25℃培養3周。采用十字法測量菌落直徑大小，測定該菌對4種碳源、3種氮源的利用情況，分解酪蛋白和淀粉的能力。使用SPSS 17.0軟件對數據進行分析。

1.4目的DNA序列的測序和系統發育學分析

將rDNA-ITS序列PCR產物交由上海美吉生物醫藥科技有限公司進行測序，引物為ITS4 (5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′)和ITS5 (5′-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3′)。獲得序列后，在GenBank中 BLAST進行同源性搜索，從中調出與該序列相似性較高的核酸序列。使用Clustal X(1.83)軟件進行多重序列匹配排列和聚類分析，使用 Mega 6.0軟件，采用最大似然法(maximum likelihood)構建系統發育樹，并通過自舉分析(bootstrap)進行置信度檢測，自舉數據集為1000次。

2　結果與分析

2.1真菌在植物中的形態特征

鴨茅的部分分蘗上長有真菌的子座(圖1A， B, C)。子座包裹著葉鞘，阻礙了宿主植物花序的生長,子座為黃色，表面粗糙，子座長45～55 mm；莖髓部菌絲體細長，粗細均勻，略帶彎曲，很少分叉(圖1D)。所發現的鴨茅群落中，長有子座的植株較少。

2.2真菌的形態特征

從形成子座的鴨茅上分離的香柱菌屬真菌，在PDA培養基上25℃培養2周后，菌落直徑45～54 mm，正面白色，棉質，質地緊密，中央隆起或稍有皺褶，背面白色至黃色；菌絲體細長，分枝，分隔(圖2A, B, C)不易產生分生孢子。在受到脅迫時產生孢子，孢子梗長13～33 μm，基部寬2.7～4.1 μm，頂端變尖小于1 μm；分生孢子無色透明，舟形或腎形，單個頂生，(4.1±0.5) μm×(2.2±0.5) μm(圖2D)。

圖2　從鴨茅中得到的真菌菌落及培養特征Fig.2　Colony characteristics of fungal isolate from glomerata　A:菌落正面 Obverse of the colony; B:菌落背面 Reverse of the colony; C:菌絲體 Hyphae; D:分生孢子梗和分生孢子(標尺=5 μm) Conidiophores and conidia (Scale=5 μm).

內生真菌Endophyte分生孢子梗Phialide長Length(μm)基部寬Base(μm)分生孢子大小Conididiumsize(μm)分生孢子形狀Conidiashape數據來源OriginEpichloёamarillans23.4±6.51.7±0.2(4.5±0.7)×(1.9±0.2)透明Transparent,半月形Half-moonshaped,腎形Kidney-shaped[29]Epichloёbaconii24.8±3.72.2±0.3(4.4±0.6)×(1.7±0.3)透明Transparent,半月形Half-moonshaped,腎形Kidney-shaped[28]Epichloёbrachyelytri16±32.0～2.8(4.1±0.6)×(2.8±0.3)透明Transparent,橢圓形Oval,舟形Funagata[7]Epichloёbromicola8～231.2～2.9(3.8±0.4)×(2.0±0.3)舟形Funagata,橢圓形Oval,無隔膜Undivided[22]Epichloёclarkii33.8±0.62.0±0.2(4.4±0.4)×(1.9±0.1)透明Transparent,半月形Half-moonshaped,腎形Kidney-shaped[28]Epichloёelymi17±32(4.4±0.4)×(2.2±0.2)透明Transparent,橢圓形Oval,舟形Funagata[7]Epichloёfestucae12～250.5～2.0(4.7±0.6)×(2.2±0.3)透明Transparent,半月形Half-moonshaped,腎形Kidney-shaped[23]Epichloёglyceriae31±52.5(3.8～6.2)×(2.2～2.8)透明Transparent,橢圓形Oval,舟形Funagata[7]Epichloёsylvatica15～331.0～1.7(5.0±1.1)×(2.0±0.5)舟形Funagata,橢圓形Oval,無隔膜Undivided[22]Epichloёtyphina22.5±5.92.2±0.5(4.9±0.4)×(2.5±0.4)透明Transparent,半月形Half-moonshaped,腎形Kidney-shaped[28]Epichloёyangzii16.5～25.82.2～2.9(4.7～5.2)×(2.0～2.9)透明Transparent,無隔膜Undivided,舟形Funagata,橢圓形Oval[26]Thisstudy13～332.7～4.1(4.1±0.5)×(2.2±0.5)透明Transparent,橢圓形Oval,腎形Kidney-shapedThisstudy

本文分離的菌株與已經報道的Epichloё屬菌株的形態特征比較結果顯示，從鴨茅子座分離的真菌是典型的Epichloё屬真菌，但此菌株在形態上與已報到的菌株有一定的差異。分離的菌株可以從不同的特征方面與已報到的11個香柱菌加以區別(表1)：該菌的分生孢子梗和分生孢子與Epichloёclarkii、Epichloёsylvatica、Epichloёglyceriae這三種相近，與其他種類相差較大。此外，不同Epichloё屬菌株分生孢子的形狀各異，主要為透明橢圓形、舟形、腎形、半月形，本文分離的菌株分生孢子形狀為透明橢圓形和腎形。

2.3真菌的生理學特征

從表2可以看出，本文所分離的Epichloё真菌對碳源利用能力由強到弱依次為：蔗糖>果糖>葡萄糖>淀粉。5種Epichloё內生真菌對蔗糖的利用能力最強，本文所分離的Epichloё真菌和Epichloёtyphina香柱菌對果糖的利用能力大于葡萄糖，其他3種香柱菌利用葡萄糖的能力大于果糖。無論何種碳源，本文所分離得到的香柱菌利用碳源能力均高于其他種類。由此可以看出，不同種類的香柱菌對碳素營養的利用能力各不相同。對于分解淀粉和酪蛋白的能力也存在差異，本文從鴨茅子座分離的Epichloё真菌與其他3種香柱菌(Epichloёbaconii、Epichloёclarkii、Epichloёtyphina)分解酪蛋白和淀粉能力(酪蛋白>淀粉)相似。這反映了它們在生理適應與宿主是緊密相關的。

表2　部分香柱菌屬真菌培養特征比較Table 2　Cultural characters of Epichloё sp.

由表3可知，不同Epichloё真菌對氮源的利用也存在一定的差異性，醉馬草、高羊茅、羊茅內生真菌利用蛋白胨的能力最強，其次為硝酸鉀，利用硝酸銨的能力很小，甚至于不能利用，而從鴨茅子座分離的Epichloё真菌恰恰相反，其利用硝酸銨的能力最強，依次為蛋白胨和硝酸鉀。

表3　部分內生真菌利用氮源特征比較Table 3　Morphological characters of Epichloё sp. growth on different nitrogen sources

2.4分離菌株的分類學鑒定

將測序結果在NCBI/GenBank 數據庫中進行Blast比對，結果表明菌株(Ed0907)與Epichloёtyphina(LN714543)聚為一枝，相似率為100%，這表明這兩個真菌親緣關系十分接近(圖3)。綜合外部形態、菌落、顯微形態特征與ITS基因序列分析結果，將菌株Ed0907初步鑒定為子囊菌門Ascomycota、肉座菌目Hypocreales、麥角菌科Clavicipitaceae、香柱菌屬的Epichloёtyphina。

圖3　根據rDNA-ITS序列進行構建的鴨茅香柱菌最大簡約系統發育樹Fig.3　The maximum parsimony tree based on rDNA-ITS sequences of Epichloё endophyte with Dactylis glomerata　分支上的數字代表該分支的自展支持率(bootstrap值，1000次重復，顯示>50%)。The number on each branch denotes bootstrap value (>50%, 1000 replication).

3　討論

鴨茅近年來在我國被廣泛栽培應用，張盼盼等[18]對新疆昭蘇種馬場阿克達拉草原和昭蘇小洪納海禁牧草場的鴨茅帶菌率進行了檢測，結果發現這兩個地方的鴨茅種子糊粉層和種皮帶菌率檢測結果也各不相同，分別為48.40%，42.90%和83.90%，70.00%，同一種屬的不同地理位置檢測到的感染率不同。

但有關新疆分布的鴨茅屬植物Epichloё屬的真菌形態、生理及系統發育學方面沒有報道。本研究首次從我國新疆分布的鴨茅中發現并分離得到了Epichloё屬真菌[17]，內生真菌在鴨茅植株上形成的子座、體內形態及分離的植株形態學特征均呈現典型的Epichloё屬真菌特征，與其他各地鴨茅屬植物中分離的菌株形態特征類似。本研究發現的鴨茅香柱菌的子座長達45～55 mm。調查發現，香柱菌子座長約5～10 cm，未成熟時呈淺綠色，成熟時的子囊孢子呈橘黃色[19-21]。Alderman等[22]調查發現鴨茅Epichloёtyphina子座長為150～200 mm。

本文從鴨茅分離的真菌菌株(Ed0907)分生孢子梗長為13～33 μm；分生孢子大小(4.1±0.5) μm×(2.2±0.5)μm(表1)，已報到的Epichloё屬真菌的分生孢子梗長度為15～76 μm；分生孢子大小為(5.0±1.1) μm±(1.7±0.25) μm，本文所分離地菌株與Epichloё屬真菌的變幅近似。由此可見，宿主植物的分類地位及分布地區在Epichloё屬真菌的鑒定中起著很重要的作用，來自不同宿主植物的菌株往往自成一種[23]。例如，來自歐洲和北美洲的Agrostis屬植物中的Epichloё屬真菌在形態上及遺傳上存在明顯不同，因此分別被鑒定為E.baconii和E.amarillans。E.typhina是目前發現的該屬內分布最廣[24]，宿主植物種類最多的一個種[17]，但與本試驗所得菌株相比，在形態和生理學上也存在差異(表2，表3)，呈現出了內生真菌形態的多樣性[25]。

本研究所得的菌株(Ed0907)對碳源利用范圍比較廣，己糖、二糖、多糖都可以利用，而利用蔗糖的能力比較強(表2)；對于氮源來說，利用硝酸銨的能力最強，之后依次為蛋白胨和硝酸鉀(表3)，與Kulkarni和Nielsen[27]將31種碳源對E.coenophiala(N.coenophialum)的利用能力篩選和Li等[26]對羊茅香柱菌研究結果基本一致。

從鴨茅中分離到的Epichloё菌株(Ed0907)分解酪蛋白的能力強于分解淀粉的能力，White等[28-30]對E.baconii、E.clarkii、E.typhina三種菌分解淀粉以及酪素結果表明，E.baconii分解酪素能力顯著強于E.clarkii、E.typhina種，而分解淀粉的能力較低。E.mollis(N.typhinum)可形成子座的菌系從植物獲取果糖和葡萄糖的能力顯著強于那些不形成子座的菌系(P<0.05)。Li等[26]對羊茅香柱菌研究結果表明，乳糖的促進作用顯著高于其他碳源；蛋白胨可顯著促進甘肅內生真菌、高羊茅內生真菌和羊茅香柱菌3種內生真菌的生長。White等[30]對E.baconii、E.clarkii、E.typhina三種菌分解淀粉以及酪蛋白結果表明，E.baconii分解酪素能力顯著強于E.clarkii、E.typhina種，而分解淀粉的能力較低。本試驗結果表明，菌株(Ed0907)分解酪蛋白的能力低于前3種，而其分解酪素的能力強于分解淀粉的能力。

本研究從采自我國新疆鴨茅中分離得到的一株內生真菌(Ed0907)，采用形態學與分子生物學方法對其鑒定。菌株形態學特征包括生長速度、菌落特征、分生孢子特征等呈現香柱菌屬(Epichloё)真菌特征，基于獲得的ITS基因序列測定結果在NCBI上的同源性比對，同時結合基于ITS序列構建的系統發育樹結果得出，該菌株與香柱菌(Epichloёtyphina)高度聚類，相似性達100%。因此根據菌株形態學特征、系統發育學分析，將菌株Ed0907鑒定為香柱菌屬的Epichloёtyphina。

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*Morphological, physiological and phylogenetic characteristics ofEpichloё endophyte associated withDactylisglomerata

WANG Zheng-Feng1,2, LI Xiu-Zhang1, LI Chun-Jie1*

1.StateKeyLaboratoryofGrasslandandAgro-ecosystems,CollegeofPastoralAgricultureScienceandTechnology,LanzhouUniversity,Lanzhou730020,China; 2.AgricultureScienceInstituteofBaiyin,Baiyin730900,China

Surveys conducted in Xinjiang revealed aDactylisglomeratapopulation infected byEpichloё endophyte. The conidial stroma on the grass tillers were waxy, yellow and 45-55 mm in length. The endophyte was isolated and incubated on PDA (potato dextrose agar) medium for two weeks at 25℃. The diameter of colonies ranged from 45-54 mm. They were compact, centrally raised with a white cottony mass of aerial hyphae and white to yellow on the underside. Hyphae were long with septum and conidia very sparse unless the colony was stressed. Conidiophores were hyaline, smooth, 13-33 μm long, 2.7-4.1 μm at base and less than 1.0 μm at the tip. Conidia were hyaline, oval to reniform and size ranged; (4.1±0.5) μm×(2.2±0.5) μm. These dimensions are typical ofEpichloё endophytes. The preference of these isolatedEpichloё endophytes for carbon source was sucrose>fructose>glucose>starch and for nitrogen sources, ammonium nitrate>peptone>potassium nitrate. These isolations exhibited differences in the hydrolysis of casein and starch. ITS sequence of isolation-Ed0907 was analysis and the phylogenetic tree constructed; it showed that the tested isolation clustered withEpichloё typhina with 100% similarity rate. Based on these morphological, physiological and phylogenetic characteristics, the endophyte isolated fromD.glomeratawas identified asEpichloё spp.

endophyte;Epichloё-Dactylisglomeratasymbionts; culture character; ITS sequence

10.11686/cyxb2015419

http://cyxb.lzu.edu.cn

2015-09-07；改回日期：2015-11-02

國家973計劃課題(2014CB138702)和國家自然科學基金項目(31372366)資助。

王正鳳(1983-)，女，甘肅靖遠人，農藝師，碩士。E-mail:wangzhengfeng222@163.com

Corresponding author. E-mail: chunjie@lzu.edu.cn

王正鳳，李秀璋，李春杰. 鴨茅香柱菌形態學、生理學及系統發育研究. 草業學報, 2016, 25(6): 118-125.

WANG Zheng-Feng, LI Xiu-Zhang, LI Chun-Jie. Morphological, physiological and phylogenetic characteristics ofEpichloё endophyte associated withDactylisglomerata. Acta Prataculturae Sinica, 2016, 25(6): 118-125.