HPLC-MS/MS快速測定常見食品中羧甲基賴氨酸含量

劉慧琳，陳曉默，穆琳，王靜（北京食品營養與人類健康高精尖創新中心，北京市食品添加劑工程技術研究中心，北京工商大學，北京100048）

?

HPLC-MS/MS快速測定常見食品中羧甲基賴氨酸含量

劉慧琳，陳曉默，穆琳，王靜
（北京食品營養與人類健康高精尖創新中心，北京市食品添加劑工程技術研究中心，北京工商大學，北京100048）

采用高效液相色譜串聯質譜聯用技術（HPLC-MS/MS）測定了幾種高蛋白食品中羧甲基賴氨酸（CML）的含量，包括：液態牛奶，奶粉，餅干，面包和蛋白類發酵食品——醬油。對樣品進行還原、沉淀、水解以及除雜后上樣檢測，對固相萃取柱及洗脫液進行了優化，采用外標法定量，HPLC-MS/MS的分析時間為25 min。其中醬油和餅干中CML的含量最高達到（385.59±7.73）mg/kg蛋白和（491.75±3.13）mg/kg蛋白，奶粉中CML的含量是最低的（45.66±2.89）mg/kg蛋白。

羧甲基賴氨酸；高效液相色譜串聯質譜聯用技術；食品；含量測定

食品在加工和儲藏過程中，蛋白中的賴氨酸殘基與還原糖的羰基或者脂質氧化產物形成晚期糖基化終產物（AGEs）和晚期脂質氧化終產物（ALEs）［1-2］，包括羧甲基賴氨酸 ［Nε-（carboxymethyl）lysine，CML］，羧乙基賴氨酸，吡咯素，戊糖素等，其中研究最多的是CML。CML包括內源性和食源性兩大類，膳食攝取的食源性CML是人體中CML的重要來源，動物實驗和臨床試驗表明CML在人體內的積累和一些疾病如，腎病、阿茲海默癥、動脈粥樣硬化和人體的衰老密切相關［3-6］。因此人類日常膳食中CML的含量受到廣泛的關注，Assar等利用超高相液相色譜與質譜聯用技術（UPLC-MS）測定了西方常見的食品中CML的含量［7］，Hull等利用UPLC-MS/MS技術測定了257中常見食物中CML的含量［8］。CML的定量檢測對指導人們減少食源性CML的攝入，進而降低相關疾病的患病風險有重要的意義。

常見的CML檢測方法包括酶聯免疫法（ELISA）［12］、高效液相色譜熒光檢測法（HPLC-FLD）［13］，氣相色譜-質譜聯用法（GC-MS）［14］，和液相色譜法（HPLC）［15］，但是都存在不同程度的缺陷。ELISA法主要用于內源性CML的測定，由于食品體系的化學組分復雜，會產生干擾，因此不適合用于食源性CML的測定。而HPLCFLD、GC-MS、HPLC法都需要進行復雜的柱前衍生，操作繁瑣，靈敏度低，HPLC-MS法檢測樣品前處理過程簡單，不需要復雜的柱前衍生過程，而且保留時間穩定，重現性好。本文采用了HPLC-MS法檢測了國內幾種常見的高蛋白食品中CML的含量。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

硼氫化鈉（純度≥98%）：天津市福晨化學試劑廠；硼酸（純度≥99.5%）：北京益利精細化學品有限公司；十水合四硼酸鈉、三氯乙酸、37%鹽酸、氨水、甲醇（純度≥99.5%）：均購于國藥集團化學試劑有限公司；所有待檢測的食品樣品均購自北京某大型超市；甲醇、乙腈、三氟乙酸（HPLC級）：購于北京百靈威科技有限公司。

UGC-24M氮吹儀：北京優晟聯合科技有限公司；KQ-700GVDV超聲波清洗器：昆山市超聲波清洗器；AL204萬分之一電子天平：梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；Tilli-Q超純水儀：山東萊索科技有限公司；QSE-24D固相萃取裝置：上海鑫翁科學儀器有限公司；Cleanert PCX-SPE、Cleanert S C18-SPE（60 mg/3 mL）：均購于天津博納艾杰爾科技有限公司；MCX混合陽離子交換固相萃取小柱（60 mg/3 mL）：美國Waters公司；安捷倫1260 infinity液相色譜-質譜聯用：美國安捷倫公司。

1.2試驗方法

1.2.1游離態CML檢測樣品前處理

取一定量等同于2 mg蛋白當量的樣品，固態樣品加入75%的甲醇（500 μL），液態樣品加入無水甲醇至甲醇最終的濃度為75%，10 000 r/min離心10 min后沉淀雜質，然后過PCX固相萃取柱除雜，加5 mL甲醇（含5%氨水）洗脫，氮氣吹干后用2 mL的超純水復溶，過0.45 μm水相膜，等待上樣。

1.2.2結合態CML檢測樣品前處理

參照Assar的前處理方法［7］，并做適當的修改。取一定量等同于2 mg蛋白當量的樣品，加入硼酸鈉緩沖液（0.5 mol/L，pH 9.2），使其最終濃度為0.2 mol/L，混勻后加入硼氫化鈉還原（2 mol/L，用0.1 mol/L NaOH配制），使其濃度為0.1 mol/L，樣品在4℃下還原10 h。得到的溶液加入60%的三氯乙酸使得三氯乙酸的最終濃度為20%，10 000 r/min離心10 min以沉淀蛋白質，獲得的蛋白用丙酮洗滌2次，沉淀后的蛋白加入1 mL，6 mol/L的HCl在110℃下水解24 h，然后氮氣吹干，過PCX固相萃取柱除雜，洗脫液吹干后用2 mL的超純水復溶，過0.45 μm的水系膜，等待上樣。

1.2.3HPLC-MS檢測條件

1.2.3.1液相條件

液相模塊為安捷倫1260 Infinity二元液相色譜系統；色譜柱為InertsilODS-SP色譜柱（4.6 mm×150 mm，5μm，Shimadzu），進樣量10μL，流動相速率0.2mL/min；柱溫30℃；運行時間25 min；流動相A為含有0.1%三氟甲酸的高純水，流動相B為乙腈，進行梯度洗脫，洗脫參數如表1所示。

表1　梯度洗脫參數Table 1　Parameters for procedure of gradient elution

1.2.3.2質譜條件

質譜模塊為三重四級桿質譜儀；儀器模式為電噴霧電離正離子模式（ESI+）；監測模式：多反應監控模式（MRM）；離子源溫度：300℃；霧化氣壓力：0.1 MPa；毛細管電壓：4 kV；MS1四級桿溫度：100℃；MS2四級桿溫度：100℃；MRM模式離子條件：m/z 205.0→m/z 84.0。

2　結果與討論

2.1固相萃取柱的選擇

比較了C18SPE小柱、PCX和MCX陽離子交換柱3種固相萃取柱對標準樣品的保留時間和洗脫效果，如表2所示（其中標品中CML的含量為1 042 μg/L± 15.74 μg/L）。

表2　固相萃取柱的優化Table 2　Optimization of solid phase extraction cartridges

由表2可知，其中C18小柱不能完全保留住CML，在上樣流出液中檢測出CML，而經過PCX和MCX陽離子交換柱凈化后，保留效果好，最后基本被完全洗脫下來，回收率達到99%以上。因此本試驗選擇PCX陽離子交換柱。

2.2固相萃取柱洗脫液的優化

比較了不同濃度的氨水甲醇洗脫液，包括甲醇（不含氨水）、甲醇（5%氨水）、甲醇（10%氨水）、甲醇（15%氨水）結果如表3所示。

表3結果表明，含5%氨水的甲醇的洗脫效果最好，因此本試驗使用的洗脫液為含有5%氨水的甲醇。

2.3流動相的選擇

分別用甲醇-水和乙腈-水作為流動相，結果發現甲醇-水作為流動相時會出現拖尾現象，如圖1所示，以乙腈-水作為流動相時峰型不佳，通過改變pH，提高離子化效率，改善峰型，試驗表明當向超純水中加入0.1%三氟甲酸時，CML的出峰時間和峰型較佳如圖2所示。

表3　固相萃取洗脫液的優化Table 3　Optimization of solid phase extraction eluents

圖1　甲醇-水作為流動相時的譜圖Fig.1　Chromatogram for methanol-water as eluent

圖2　乙腈-水（含0.1%三氟甲酸）作為流動相時的譜圖Fig.2　Chromatogram for acetonitrile-water as eluent

2.4CML標準曲線的繪制

稱取2 mg的CML用pH 7.0的磷酸緩沖溶液配制成1 000 μg/L的溶液，分別取2、1、0.5 mL的1 000 μg/L的溶液于容量瓶中，加入超純水定容至10 mL，搖勻得到200、100、50 μg/L的CML的標準溶液，再分別從上述3種溶液中吸取1 mL的CML標準溶液溶液于10 mL容量瓶中配制成20、10、5 μg/L的CML的標準溶液，用HPLC-MS法測定6種不同濃度CML的峰面積，如表4所示，得到的標準曲線如圖3所示。

表4　峰面積積分值Table 4　Peak area integral value

由圖3可知，CML在5 μg/L～200 μg/L濃度范圍內，峰面積與進樣量呈良好的線性關系。經統計學計算的回歸方程為Y=22.40x+38.24，R2=0.999。該方法的檢測限是5 ng/L，定量限是16.67 ng/L。

圖3　CML標準曲線圖Fig.3　The standard curve of CML

2.5常見高蛋白食品中CML的含量

蛋白質和碳水化合物是AGEs形成的前體物質，本文選取了國內常見的幾種高蛋白食品作為研究對象，測定其中的CML的含量，結果見表5所示。

表5　幾種高蛋白食品中CML的含量Table 5　The content of CML in several high protein foods

從表5可以看出，醬油和餅干中的CML的含量較高，Chao等［2］也發現經過醬油調味的肉制品的CML的含量要明顯高于未經處理的肉制品，醬油中游離態CML含量很高，因為醬油是豆類發酵產品，在各種微生物的作用下大豆蛋白水解為多種游離的氨基酸。對于餅干類食品，由于餅干中蛋白質、糖類和油脂含量較高，再加上高溫烘焙處理，所以餅干中CML的含量也較高。Assar等［7］利用UPLC-MS法測定了全脂和脫脂牛奶中CML的含量，結果表明全脂牛奶中CML的含量比脫脂的牛奶中CML的含量高（全脂牛奶的CML的含量為16.2 mg/kg蛋白，脫脂牛奶為10.4 mg/kg蛋白）。本試驗中脫脂牛奶比全脂牛奶中CML的含量高，原因可能因為脫脂牛奶中碳水化合物的含量較高所導致的。奶粉中的CML要比液態牛奶中CML的含量高，可能是由于奶粉的真空干燥過程產生了較多的CML，結果與Fenaille等的結果相同，Fenaille等用GC-MS的方法測定了液態牛奶和粉末狀牛奶中CML的含量，結果表明，粉末狀牛奶的含量為212.4 mg/kg蛋白高于液態牛奶62.9 mg/kg蛋白［12］。Assar等［7］用U PLC-MS方法分別測定了面包皮和面包心的CML的含量，結果表明由于面包皮的高溫烘烤導致皮的CML的含量比面包心的高，考慮到食用的習慣，本研究將面包冷凍干燥后混勻測定整體的CML的含量，結果表明全麥面包中的CML的含量比白面包的量低，是因為全麥面包中還原糖的含量較低所導致。

3　結論

本研究對實際樣品中CML測定時前處理進行了優化，包括固相萃取柱的選擇，固相萃取柱洗脫液的優化，以及流動相條件的優化，在實際樣品檢測中選用了PCX陽離子交換小柱，選用含5%氨水的甲醇為洗脫液，利用HPLC-MS法測定CML的含量，流動相A為含0.1%三氟甲酸，流動相B為乙腈，采用梯度洗脫的方法，出峰時間穩定在7.0 min左右，重現性好，適用于食品真實體系中的CML的含量，操作簡單，快速，為進一步檢測多種國內食品中的CML的含量提供技術依據，為后續食源性CML的抑制研究奠定基礎。

［1］Ahmed N，Mirshekar-Syahkal B，Kennish L，et al.Assay of advanced glycation endproducts in selected beverages and food by liquid chromatography with tandem mass spectrometric detection［J］. Molecular nutrition&food research，2005，49（7）:691-699

［2］Chao P，Hsu C，Yin M.Analysis of glycative products in sauces and sauce-treated foods［J］.Food Chemistry，2009，113（1）:262-266

［3］楊德慶，王艷萍，李霞，等.食物中的晚期糖基化終產物對5/6腎切除大鼠腎臟損害的作用的研究［J］.新疆醫學，2008，38（8）:44-48

［4］Horie K，Miyata T，Yasuda T，et al.Immunohistochemical localization of advanced glycation end products，pentosidine，and carboxymethyllysine in lipofuscin pigments of Alzheimer's disease and aged neurons［J］.Biochemical and biophysical research communications，1997，236（2）:327-332

［5］許頂立，劉艷玲，孟素榮，等.冠心病患者血清晚期糖基化終產物Nε-羧甲基賴氨酸含量的變化［J］.中華老年心腦血管病雜志，2000，2（3）:161-163

［6］Singh R，Barden A，Mori T，et al.Advanced glycation end-products: a review［J］.Diabetologia，2001，44（2）:129-146

［7］Assar S H，Moloney C，Lima M，et al.Determination of N ε-（carboxymethyl）lysine in food systems by ultra performance liquid chromatography-mass spectrometry［J］.Amino acids，2009，36（2）: 317-326

［8］Hull G L J，Woodside J V，Ames J M，et al.Nε-（carboxymethyl）lysine content of foods commonly consumed in a Western style diet［J］. Food Chemistry，2012，131（1）:170-174

［9］Wolff S P，Dean R T.Glucose autoxidation and protein modification. The potential role of‘autoxidative glycosylation’in diabetes［J］.Biochemical Journal，1987，245（1）:243-250

［10］Glomb M A，Monnier V M.Mechanism of protein modification by glyoxal and glycolaldehyde，reactive intermediates of the Maillard reaction［J］.Journal of Biological Chemistry，1995，270（17）:10017-10026

［11］Ahmed M U，Thorpe S R，Baynes J W.Identification of N epsiloncarboxymethyllysine as a degradation product of fructoselysine in glycated protein［J］.Journal of Biological Chemistry，1986，261（11）: 4889-4894

［12］Birlouez-Aragon I，Pischetsrieder M，Leclere J，et al.Assessment of protein glycation markers in infant formulas［J］.Food Chemistry，2004，87（2）:253-259

［13］Drusch S，Faist V，Erbersdobler H F.Determination of Nε-（carboxymethyl）lysine in milk products by a modified reversed-phase HPLC method［J］.Food Chemistry，1999，65（4）:547-553

［14］Charissou A，Ait-Ameur L，Birlouez-Aragon I.Evaluation of a gas chromatography/mass spectrometry method for the quantification of carboxymethyllysine in food samples［J］.Journal of Chromatography A，2007，1140（1）:189-194

［15］Hartkopf J，Erbersdobler H F.［Experiments with sausage meat on the formation of N epsilon-carboxymethyllysine.］［J］.Zeitschrift fur Lebensmittel-Untersuchung und-Forschung，1995，201（1）:27-29

［16］Fenaille F，Parisod V，Visani P，et al.Modifications of milk constituents during processing:A preliminary benchmarking study［J］. International Dairy Journal，2006，16（7）:728-739

Detection of Nε-（carboxymethyl）lysine in Foods by High Performance Liquid Chromatography-Mass Spectrometry

LIU Hui-lin，CHEN Xiao-mo，MU Lin，WANG Jing
（Beijing Advanced Innovation Center for Food Nutrition and Human Health，Beijing Engineering and Technology Research Center of Food Additives，Beijing Technology&Business University（BTBU），Beijing 100048，China）

High performance liquid chromatography-mass spectrometry（HPLC-MS/MS）was used to detect Nε-（carboxymethyl）lysine（CML）in several foods which contain high protein content，including liquid milk，powdered milk，biscuit，bread and soybean sauce.Samples were analyzed before pre-processing with sodium borohydride reduction，protein isolation，hydrolysis，and removing impurity.The optimization of different solid phase extraction cartridges and eluents in this study，and the analysis time of HPLC-MS/MS was 25 min.The CMLlevel in foods were as follows，soybean sauce and biscuit had the highest content，up to（385.59±7.73）mg/kg pro and（491.75±3.13）mg/kg pro，powdered milk had the least content，up to（45.66±2.89）mg/kg pro.

Nε-（carboxymethyl）lysine；high performance liquid chromatography-mass spectrometry；food；determination of content

10.3969/j.issn.1005-6521.2016.13.024

國家自然科學基金（31501559；31571940）

劉慧琳（1987—），女（漢），講師，博士，研究方向：食品安全檢測。

2016-03-27