分光光度法測定毛酸漿果中總黃酮含量的研究

李世燕，閆公昕，朱丹，牛廣財，*，魏文毅（.黑龍江八一農墾大學食品學院，黑龍江大慶6339；.黑龍江八一農墾大學生命科學技術學院，黑龍江大慶6339）

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分光光度法測定毛酸漿果中總黃酮含量的研究

李世燕1，閆公昕1，朱丹2，牛廣財1，*，魏文毅1
（1.黑龍江八一農墾大學食品學院，黑龍江大慶163319；2.黑龍江八一農墾大學生命科學技術學院，黑龍江大慶163319）

探討建立分光光度法測定毛酸漿中的總黃酮含量的方法，通過考察顯色劑用量以及加入顯色劑后放置時間對毛酸漿總黃酮測定的影響，采用單因素和正交試驗優化硝酸鋁-亞硝酸鈉比色法測定毛酸漿果中總黃酮的含量。結果表明，毛酸漿中總黃酮含量測定的最佳的條件為：5%NaNO2溶液0.8 mL，混勻放置2 min后，加10%Al（NO3）3溶液0.8 mL，混勻，繼續加4%NaOH溶液6 mL，定容混勻后立即在335 nm下測其吸光度。在此條件下，蘆丁標準溶液在0～0.002 4 mg/mL范圍內與吸光度值間的回歸方程y=289.02x+0.008，R2=0.999 5。該測定方法的平均加標回收率為100.83%，穩定性、精密度以及回收率的相對標準偏差（RSD）分別為0.34%，0.29%和2.91%。該方法簡便、快速、準確，可以用于毛酸漿果汁中總黃酮含量的測定。

毛酸漿果；總黃酮；分光光度法

毛酸漿（Physalis pubescens L.）別名洋菇娘、黃菇娘等，酸漿屬，一年生草本植物，在我國主要產地為內蒙古呼倫貝爾盟和黑龍江省［1］。毛酸漿果實是一種食用與藥用為一體的新型特色營養型水果，其果實中含有生物堿類、脂類、黃酮類等營養保健成分［2］，以及維生素、礦物元素、有機酸和18種氨基酸，其中以天冬氨酸和亮氨酸含量最高［3-5］。毛酸漿因其富含豐富功能成分，賦予人們保健作用的魅力，如解除疲勞、消除肌肉疼痛、降低血壓、預防動脈硬化和心血管病的發生和保護皮膚等保健作用［6-7］。

現代藥理研究發現黃酮類化合物具有光譜的藥理作用，大量研究已表明，黃酮類化合物的多種生物活性，在抗氧化、抗癌、抑制脂肪酶等方面有顯著效果，其應用范圍越來越廣而成為天然產物研究的熱點［8］。因此毛酸漿中的黃酮含量可作為評價毛酸漿營養保健價值的一個重要指標。目前對檢測黃酮類方法的報道很多，雖然元曉梅等作了總結報道［9］，但在毛酸漿的相關研究中鮮見有關總黃酮含量測定方面的相關研究。本研究對硝酸鋁-亞硝酸鈉比色法進行優化后測定毛酸漿果中的總黃酮含量，旨在建立快速、簡便、準確的毛酸漿果總黃酮含量測定方法，為其進一步開發利用以及黃酮的質量控制提供參考。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

蘆丁標準品：sigma公司出品；毛酸漿：購于黑龍江省大慶市農貿市場；亞硝酸鈉（分析純）：天津市河東區紅巖試劑廠；九水合硝酸鋁（分析純）：國藥集團化學試劑有限公司；氫氧化鈉、甲醇（分析純）：天津市大茂化學試劑廠；水為去離子水。

1.2儀器與設備

UV-1100型紫外可見分光光度計：上海美譜達儀器；Exploter分析天平：奧豪斯儀器上海有限公司制造。

1.3方法

1.3.1原理

毛酸漿中含有黃酮類化合物，黃酮類化合物母核上某些位置（如3或5位）上的羥基能與金屬離子形成絡合物，此外在B環上有任何相鄰的雙羥基時，也會產生絡合作用，這些絡合物在吸收光譜上會發生明顯的變化［10］，而且其質量濃度與吸光度符合朗伯-比爾定律，顏色的深淺與黃酮類化合物的量又呈一定的比例關系的特性，所以直接于最大吸收波長處測定其吸光度值A，然后通過蘆丁標準曲線對照，就可以確定總黃酮含量［11］。本實驗就是采用這種原理作為毛酸漿中總黃酮定量測定的依據。

1.3.2蘆丁標準品溶液的制備

精確稱取120℃干燥至恒重的蘆丁標準品10 mg置于100 mL的容量瓶中，加適量甲醇溶解后，以甲醇定容至刻度線，充分搖勻，配成0.1 mg/mL的蘆丁標準溶液，備用。

1.3.3樣品溶液的制備

取100 g毛酸漿果破碎榨汁，將破碎后的毛酸漿原漿離心（4 000 r/min，15 min），得到澄清的毛酸漿果汁樣品，備用。

1.3.4最大吸收波長的選擇

準確稱取蘆丁對照品標準溶液和樣品溶液各1.0 mL置于25 mL容量瓶中，加入5%NaNO2溶液1.0 mL，混勻，放置6 min，然后加入10%Al（NO3）3溶液1.0 mL，混勻，放置6 min，再加入4%NaOH溶液10 mL，用去離子水定容至刻度，混勻，放置15 min［12］，同時制備空白試液。顯色完畢后在紫外分光光度計上300 nm～500 nm進行全波長掃描，確定反應體系的最大吸收波長。

1.3.5顯色劑用量對總黃酮含量測定的影響

1.3.5.15%NaNO2溶液用量對總黃酮測定的影響

取7份0.1 mL的毛酸漿樣品溶液于25mL的容量瓶中，分別加入濃度為5%的NaNO2溶液各0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4 mL，然后加入10%Al（NO3）3溶液1.0 mL，混勻，放置6 min，再加入4%NaOH溶液10 mL，用去離子水定容至刻度，混勻，放置15 min。以濃度為5%的NaNO2溶液用量為橫坐標，吸光度值A為縱坐標繪圖，研究濃度為5%的NaNO2溶液用量對樣品總黃酮測定的影響。

1.3.5.210%的Al（NO3）3溶液用量對總黃酮測定的影響

取7份0.1 mL的毛酸漿樣品溶液于25 mL的容量瓶中，加入5%NaNO2溶液1.0 mL，混勻，放置6 min，然后分別加入濃度為10%的Al（NO3）3溶液0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4 mL，再加入4%NaOH溶液10 mL，用去離子水定容至刻度，混勻，放置15 min。以10%的Al（NO3）3溶液用量為橫坐標，吸光度值A為縱坐標繪圖，研究濃度為10%的Al（NO3）3溶液用量對樣品總黃酮測定的影響。

1.3.5.34%的NaOH溶液用量對總黃酮測定的影響

取7份0.1 mL的毛酸漿樣品溶液于25 mL的容量瓶中，加入5%NaNO2溶液1.0 mL，混勻，放置6 min，然后加入10%Al（NO3）3溶液1.0 mL，混勻，放置6 min，分別加入濃度為4%的NaOH溶液各2、3、4、5、6、7、8 mL，定容混勻，放置6 min。以濃度為4%的NaOH溶液用量為橫坐標，吸光度值A為縱坐標繪圖，研究濃度為4%的NaOH溶液用量對樣品總黃酮測定的影響。

1.3.6加入顯色劑后放置時間對總黃酮含量測定的影響

1.3.6.1加入5%的NaNO2溶液后放置時間對總黃酮測定的影響

取6份0.1 mL的毛酸漿樣品溶液于25 mL的容量瓶中，加5%NaNO2溶液1.0 mL，搖勻，分別放置0、2、4、6、8、10 min，加10%Al（NO3）3溶液1.0 mL，搖勻，放置6 min，加4%NaOH溶液7 mL，定容搖勻，放置15 min。以加入5%NaNO2溶液后放置時間為橫坐標，吸光度值A為縱坐標繪圖，研究加入5%NaNO2溶液后放置時間對樣品總黃酮測定的影響。

1.3.6.2加入10%的Al（NO3）3溶液后放置時間對總黃酮測定的影響

取6份0.1 mL的毛酸漿樣品溶液于25 mL的容量瓶中，加5%NaNO2溶液1.0 mL，搖勻，放置4 min，加10%Al（NO3）3溶液1.0 mL，搖勻，分別放置0、2、4、6、8、10 min，加4%NaOH溶液7 mL，定容搖勻，放置15 min。以加入5%NaNO2溶液后放置時間為橫坐標，吸光度值A為縱坐標繪圖，研究加入10%的Al（NO3）3溶液后放置時間對樣品總黃酮測定的影響。

1.3.6.3加入4%的NaOH溶液后放置時間對總黃酮測定的影響

取8份0.1 mL的毛酸漿果汁樣品溶液于25 mL容量瓶中，加5%NaNO2溶液1.0 mL，搖勻，放置4 min，加10%Al（NO3）3溶液1.0 mL，搖勻，放置2 min，加4%NaOH溶液7 mL，定容搖勻，分別放置0、2、4、6、8、10、12、14 min。以加入5%的NaNO2溶液放置時間為橫坐標，吸光度值A為縱坐標繪圖，研究加入5% NaNO2溶液后放置時間對樣品總黃酮測定的影響。

1.3.7毛酸漿果總黃酮測定的正交試驗

根據單因素試驗的結果，以10%Al（NO3）3的用量（A），4%NaOH的用量（B），加入5%NaNO2后放置時間（C），加入10%Al（NO3）3后放置時間（D）作為影響因素，以吸光度為測定指標，設計四因素三水平L9（34）正交試驗，因素水平表見表1。

表1　正交試驗因素水平表Table 1　Factors and levels of the orthogonal experiment

1.3.8標準曲線及其回歸方程的建立

精密移取蘆丁標準品0.0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mL分別置于25 mL容量瓶中，按正交試驗得出的最優方法顯色，以不加蘆丁標準液的溶液為空白參比。用紫外-可見分光光度計在355 nm下測定吸光度。每個濃度平行測定3次，取平均值。以蘆丁濃度為橫坐標，吸光度為縱坐標繪制標準曲線。

1.3.9穩定性試驗

取0.1 mL的毛酸漿樣品溶液置于25 mL的容量瓶中，按正交試驗得出的最優方法顯色，分別按0、2、4、6、8、10、12 min時間間隔放置后測定吸光度值A，并用回歸方程計算總黃酮含量。

1.3.10精密度試驗

取5份0.1 mL的毛酸漿樣品溶液于25 mL的容量瓶中，按正交試驗得出的最優方法顯色后測定吸光度，并用回歸方程計算總黃酮含量。

1.3.11加樣回收率試驗

取6份0.1 mL的毛酸漿樣品溶液置于25 mL容量瓶中，每2份1組，共3組。分別精密加對照品母液1.0，2.0，3.0 mL，用30%乙醇稀釋到10 mL，按正交試驗得出的最優方法顯色后測定吸光度。

2　結果與分析

2.1檢測波長的確定

蘆丁標準品（b）和樣品（a）的紫外可見光譜圖見圖1。

圖1　蘆丁標準品（b）和樣品（a）的紫外可見光譜圖Fig.1　Scanning spectra of standard rutin solution（b）and Physalis Pubescens L.sample（a）

由圖1可知，蘆丁及毛酸漿樣品溶液均在355 nm處有最大吸收峰值，故選擇355 nm作為檢測波長。

2.2顯色劑用量對總黃酮含量測定的影響

2.2.15%NaNO2溶液用量對總黃酮測定的影響

硝酸鋁-亞硝酸鈉顯色法中NaNO2的主要作用是還原黃酮，黃酮分子中的酚羥基在NaNO2作用下產生鄰二醌結構，5%NaNO2溶液用量對總黃酮測定的影響結果見圖2。

圖2　5%NaNO2溶液用量對總黃酮測定的影響Fig.2　Effect of 5%NaNO2amount on the total flavonoids

由圖2可以看出，隨著5%NaNO2溶液用量的增加，吸光度值不斷上升，原因可能是NaNO2在還原黃酮的同時也將毛酸漿果汁中的非黃酮類物質還原，該物質在355 nm左右下也有吸收。結合文獻，選擇5% NaNO2溶液添加量為1.0 mL［11］。

2.2.210%Al（NO3）3溶液用量對總黃酮測定的影響10%Al（NO3）3溶液用量對總黃酮測定的影響結果見圖3。

圖3　10%A（lNO3）3溶液用量對總黃酮測定的影響Fig.3　Effect of 10%A（lNO3）3amount on the total flavonoids

由圖3可知，隨著10%Al（NO3）3溶液用量的增加，在0.6 mL～1.0 mL范圍內，吸光度值較大，并在1.0 mL左右取得最大值，說明10%Al（NO3）3溶液添加量在1.0 mL時可以與毛酸漿果汁中還原的黃酮類物質完全絡合。繼續增加10%Al（NO3）3溶液的添加量，黃酮類分子中的酚羥基與Al3+形成的絡合物分解，吸光度值下降。基于該實驗結果，選擇10%Al（NO3）3溶液用量在1.0 mL左右研究其對毛酸漿果汁總黃酮測定的影響，效果較好。

2.2.34%NaOH溶液用量對總黃酮測定的影響

NaOH的主要作用是使黃酮類化合物開環，生成2’-羥基查爾酮而顯色，4%NaOH溶液用量對總黃酮測定的影響結果見圖4。

圖4　4%NaOH溶液用量對總黃酮測定的影響Fig.4　Effect of 4%NaOH amount on the total flavonoids

由圖4可知，隨著4%NaOH溶液用量的增加，吸光度值逐漸增大。當4%NaOH溶液用量為7 mL時吸光度值最大。說明4%NaOH添加量為7 mL左右時可以較好地顯色，所以，選擇4%NaOH溶液用量6 mL～8 mL進行后續研究。

2.3不同顯色劑放置時間對對總黃酮測定的影響

2.3.1加入NaNO2溶液后不同放置時間對試驗結果的影響

加入NaNO2溶液后不同放置時間對總黃酮測定的影響見圖5。

圖5　加入5%NaNO2溶液后放置時間對總黃酮測定的影響Fig.5　Effect of reaction time on the total flavonoids after adding 5%NaNO2

由圖5可知，加入5%NaNO2溶液后放置0 min～10 min，樣品吸光度的變化趨勢明顯。放置時間為4 min時，吸光度值最大，說明在毛酸漿樣品的總黃酮含量測定中，NaNO2還原的各種物質的穩定性不同，隨著放置時間的進一步增加，吸光度值下降。所以，選擇加入5%NaNO2溶液后放置時間為2 min～6 min進行后續研究。

2.3.2加入Al（NO3）3溶液后不同放置時間對試驗結果的影響

加入Al（NO3）3溶液后不同放置時間對總黃酮測定的影響見圖6。

圖6　加入10%的Al（NO3）3溶液后放置時間對總黃酮測定的影響Fig.6　Effect of reaction time on the total flavonoids after adding 10%Al（NO3）3

圖6可知，加入10%Al（NO3）3溶液后的時間間隔對試驗影響較大，在0～4 min內樣品吸光度較高，可能是Al3+與黃酮類化合物形成絡合物時間較短。4 min～10 min時樣品吸光度逐漸降低，可能是該絡合物不穩定。由結果中可以看出2 min時樣品吸光度最高，故選擇加入10%Al（NO3）3溶液后放置時間為0 min～4 min研究其對毛酸漿果中總黃酮測定的影響。

2.3.3加入NaOH溶液后不同放置時間對實驗結果的影響

加入NaOH溶液后不同放置時間對總黃酮測定的影響見圖7。

圖7　加入4%的NaOH溶液后放置時間對總黃酮測定的影響Fig.7　Effect of reaction time on the total flavonoids after adding 4%NaOH

由圖7可知，加入4%NaOH溶液后，樣品吸光度比較穩定。可能是黃酮類化合物顯色比較穩定，但是整個變化趨勢是呈下降趨勢。因此，在加入4%NaOH溶液后，盡快測定，以縮短此步驟的時間。

2.4正交試驗結果

通過對10%的Al（NO3）3的用量、4%NaOH的用量、加入5%NaNO2后放置時間、加入10%Al（NO3）3后放置時間的L9（34）正交處理，得到9種組合方案，毛酸漿總黃酮測定的正交試驗優化結果見表2。

由表2極差結果分析可知，對總黃酮含量測定的影響由大到小依次是：10%Al（NO3）3放置時間＞4%NaOH溶液添加量＞5%NaNO3溶液放置時間＞10% Al（NO3）3溶液添加量。由k值確定毛酸漿果汁中總黃酮含量測定的最佳實驗條件為A1B1C1D1，即10% Al（NO3）3溶液添加量為0.8 mL，4%NaOH溶液添加量為6 mL，5%NaNO3溶液放置時間為2 min，10% Al（NO3）3溶液放置時間為0 min。

表2　正交試驗L9（34）結果及分析Table 2　Results and analysis of the orthogonal experiment L9（34）

2.5蘆丁標準曲線

根據不同濃度的蘆丁在最佳條件下測定355 nm處的吸光度值，繪制標準曲線見圖8。

圖8　硝酸鋁法測定的蘆丁標準曲線Fig.8　Standard curve of standard rutin solution by Al（NO）33colorimetry

得出線性回歸方程為y=289.02x+0.008，R2=0.9995，蘆丁標準溶液在0.0000～0.0024 mg/mL范圍內與吸光度值間有良好的線性關系。

2.6穩定性試驗結果

穩定性考察結果見表3。

分析結果可知，樣品溶液的RSD值為0.34%，結果表明該樣品在12 min內進行測定穩定性良好。

表3　穩定性試驗結果Table 3　Result of stability test

2.7精密度試驗結果

精密度考察結果見表4。

表4　精密度試驗結果Table 4　Result of precision test

分析結果可知，樣品溶液吸光度值的RSD=0.29%，說明精密度良好。

2.8加樣回收率試驗結果

加樣回收率考察結果結果見表5。

表5　加樣回收率試驗結果Table 5　The result of recovery test

結果表明，6次測定的平均加樣回收率為100.83%，RSD=2.91%，說明該測定方法具有良好的回收率。

3　結論

本研究通過正交試驗得出硝酸鋁-亞硝酸鈉比色法測定毛酸漿果中的總黃酮時，10%Al（NO3）3溶液的添加量、4%NaOH溶液的添加量、加入5%NaNO2溶液后的放置時間、加入10%Al（NO3）3溶液后的放置時間對總黃酮的測定影響明顯。得出毛酸漿果中總黃酮測定的的最佳實驗條件為：添加5%NaNO2溶液1.0 mL，搖勻放置2 min，加10%Al（NO3）3溶液0.8 mL后搖勻，立即加4%NaOH溶液6 mL搖勻顯色后立即測定。

此方法測定毛酸漿果中總黃酮時，標準品和樣品的光譜最大吸收波長重疊都很好，以該方法得到的線性方程為y=289.02x+0.008，R2=0.999 5，具有良好的線性關系。該方法測得的毛酸漿果中總黃酮含量為0.573 mg/g。此方法測定具有良好的穩定性和精密度，平均回收率為100.83%，相對標準偏差為2.91%，本方法測定毛酸漿果中的總黃酮含量，結果準確，重現性良好，操作簡單，可作為毛酸漿果總黃酮含量測定的方法。

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Study on Quantitative Determination of Total Flavonoids in Physalis Pubescens L.by Spectrophotometry

LI Shi-yan1，YAN Gong-xin1，ZHU Dan2，NIU Guang-cai1，*，WEI Wen-yi1
（1.College of Food Science，Heilongjiang Bayi Agricultural University，Daqing 163319，Heilongjiang，China；2.College of Life Science and Technology，Heilongjiang Bayi Agricultural University，Daqing 163319，Heilongjiang，China）

Spectrophotometric determination of total flavonoids from Physalis Pubescens L.was studied.Al（NO）3Spectrophotometry was optimized through the single-factor experiment and orthogonal experiment and the effect of the amount of chromogenic agent，reaction time were analyzed.The optimum experiment condition used to determinate the total flavonoids in Physalis Pubescens L.was obtained as follows：add 0.8 mL NaNO2（5%），two minutes later，add 0.8 mL Al（NO3）3（10%），then add 6 mL NaOH（4%），mixing them immediatelyevery time，andtheabsorbancewasdetectedunder335nm.Underthismethod，thecorrelationequationwasy=289.02x+ 0.008，R2=0.999 5，it showed a very good linear relationship within the range of 0.000 0-0.002 4 mg/mL.And the stability，precision and average recovery rate was 0.34%，0.29%and 2.91%by RSD（relative standard deviation）respectively and average recovery rate was 100.83%.This method is convenient，fast and accurate to determine the total flavonoids in Physalis Pubescens L..

Physalis Pubescens L.；total flavonoids；spectrophotometry

10.3969/j.issn.1005-6521.2016.13.031

黑龍江八一農墾大學研究生創新科研項目（YJSCX2015-Y49）

李世燕（1989—），女（漢），碩士研究生，研究方向：果蔬精深加工。

牛廣財（1971—），男（漢），教授，博士，從事食品加工與貯藏方面的研究。

2015-05-17