高效液相色譜法測定熟肉制品中5種合成色素

高慧，汪洋，王敏（淄博市疾病預防控制中心，山東淄博255026）

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高效液相色譜法測定熟肉制品中5種合成色素

高慧，汪洋*，王敏
（淄博市疾病預防控制中心，山東淄博255026）

建立熟肉制品中5種合成色素的高效液相色譜法測定方法。熟肉制品經過脫脂后提取色素，選擇樣品中5種色素的最大吸收波長用高效液相色譜儀分析測定。在0.10μg/mL～50.0μg/mL線性范圍內，所得5種合成色素的回歸方程均呈較好的線性關系（r＞0.999）。該方法的檢出限為0.035μg/mL～0.040μg/mL，相對標準偏差在0.79%～1.30%之間。對樣品進行加標回收試驗，絕對回收率在91.5%～101.0%之間。本方法簡便、快速、準確，適用于熟肉制品中合成色素的測定。

熟肉制品；色素；脫脂；最大吸收波長；高效液相色譜法

色素作為食品添加劑，可分為天然色素和人工合成色素兩大類［1］，天然色素來源自然、安全性較高。人工合成色素即用人工化學合成方法所制得的有機色素。色素本身無營養價值，但由于其色澤鮮艷，著色力強，色調多樣，成本低廉，能夠增加食物感官美和提高人們的食欲，在食品行業被廣泛應用。研究表明，過量攝入人工合成色素對人體有致突變、致瀉性和致癌性。目前國標GB/T 5009.35-2003《食品中合成著色劑的測定》［2］中針對熟肉制品人工合成色素的檢測方法的專屬性不強，熟肉制品中脂肪、蛋白質含量高，樣品難以提取，回收率低。本文在原有標準的基礎上改進了熟肉制品中合成色素的前處理方法和檢測條件，獲得滿意效果。

1　材料與方法

1.1儀器

e2695高效液相色譜儀：Waters；超純水機：美國millipore，Milli-Q Advantage A10；SHB-Ⅲ循環水式真空泵：鞏義市予華儀器有限責任公司；C-50抽濾器：北京眾意中和生物技術有限公司；G3垂融漏斗：江蘇省寶應縣正茂玻璃廠；針式過濾頭：上海興亞凈化材料廠，0.45 μm；高速離心機：Thermo，Sorvall ST 16R；SZ-1型快速混勻器：江蘇金壇市金城國勝實驗儀器廠；WHY-2型恒溫水浴振蕩儀：金壇市精達儀器制造有限公司；HWS 26型電熱恒溫水浴鍋：上海一恒科技有限公司。

1.2試劑

色譜純甲醇（美國迪馬公司）；超純水（電導率＜0.10 S/m，25℃）。

檸檬黃標準溶液GBW（E）100001a、日落黃標準溶液GBW（E）100003a、莧菜紅標準溶液GBW（E）100002a、胭脂紅標準溶液GBW（E）100004a，以上4種標準溶液濃度均為0.500 mg/mL，定值單位為中國計量科學研究院，誘惑紅標準溶液GBW（E）100164，濃度值為1.00 mg/mL，定值單位北京海岸鴻蒙標準物質技術有限公司。

乙酸銨溶液（優級純，天津市巴斯夫化工有限公司，0.02 mol/L）；海砂（化學純，國藥集團化學試劑有限公司，先用10%體積濃度鹽酸溶液浸泡煮沸15 min，冷卻，用水洗至中性，再用50 g/L氫氧化鈉溶液煮沸15 min，冷卻，用水洗至中性，于105℃干燥，貯于具塞瓶中。）；石油醚（分析純，天津市化學試劑一廠，30℃～60℃）；無水乙醇-氨水-水混合溶液（均為優級純，國藥集團化學試劑有限公司）；10%體積濃度硫酸溶液（優級純，國藥集團化學試劑有限公司）；鎢酸鈉溶液（分析純，天津市天津市化學試劑一廠，100 g/L）；聚酰胺粉（江蘇無錫化學試劑有限公司，200目）；甲醇-甲酸溶液（均為優級純，國藥集團化學試劑有限公司）；乙酸（分析純，國藥集團化學試劑有限公司）；檸檬酸溶液（分析純，上海試劑一廠，20%）。

1.3預處理

準確稱取粉碎試樣5 g于研缽中，加海砂少許研磨混勻，吹風使試樣干燥。加入石油醚，渦旋，離心，棄去石油醚。殘渣重復上述去脂過程3次，除去脂肪，吹干。脫脂后的試樣轉移至50 mL離心管中，加入30 mL無水乙醇-氨水-水（7∶2∶1，體積比），振蕩，離心，將上層液體倒入100 mL的錐形瓶中，再向離心管中加入10 mL無水乙醇-氨水-水（7∶2∶1，體積比），重復上述操作，反復多次至提取液無色為止。合并提取液于70℃水浴上濃縮至10 mL以下，依次加入硫酸溶液1.0 mL和100 g/L鎢酸鈉溶液1.0 mL，混勻，繼續70℃水浴加熱5 min，沉淀蛋白質。取下錐形瓶，冷卻至室溫，用濾紙過濾，少量水洗滌濾紙，濾液收集與100 mL燒杯中。

1.4色素提取

用檸檬酸溶液將依法制成的樣品溶液調pH值到6，加熱至60℃，加入適量的聚酰胺粉調成粥狀，以G3垂融漏斗抽濾，用60℃pH=4的水洗滌3次～5次，然后用甲醇-甲酸溶液（6∶4，體積比）洗滌3次～5次，再用水洗至中性，用無水乙醇-氨水-水（7∶2∶1，體積比）解吸3次～5次，每次5 mL，收集解吸液，加乙酸中和，蒸發至近干，加超純水溶解，定容至5mL。經0.45μm濾膜過濾，供HPLC測定。

1.5高效液相色譜法的測定

1.5.1標準系列的配制

準確吸取檸檬黃、日落黃、莧菜紅、胭脂紅標準溶液各1.0、3.0、10.0、30.0、100.0、500.0 μL；誘惑紅標準溶液各0.50、1.50、5.0、15.0、50.0、250.0 μL置于5 mL容量瓶中，用超純水稀釋到刻度，得到0.10、0.30、1.0、3.0、10.0、50.0 μg/mL的標準系列。

1.5.2色譜條件

色譜柱：Waters Symmetry C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；進樣量：20 μL；柱溫：30℃；檢測波長：檸檬黃428nm、日落黃483nm、誘惑紅507nm、胭脂紅509nm、莧菜紅521 nm；流動相及梯度（A：色譜純甲醇；B：0.02 mol/L乙酸銨溶液）。梯度如表1。

表1　流動相梯度Table 1　The gradients of mobile phase

2　結果與討論

2.1樣品前處理方法

2.1.1樣品提取條件的優化

首先用石油醚對樣品進行脫脂，減少了脂肪對溶出色素的影響，結果提高了樣品的回收率和重現性。利用無水乙醇-氨水-水溶液作為提取溶劑，能夠提高色素的溶出度，同時減少蛋白溶出的影響［3］。

2.1.2聚酰胺粉的使用量

聚酰胺是具有酸堿二極性的化合物，在酸性條件下與水溶性酸性染料結合，而與天然色素、淀粉等物質分離。聚酰胺粉的使用量根據樣品中色素的含量而改變［4］。一般樣品用1 g的聚酰胺粉調成糊狀即可，色素含量高的樣品，可以減少樣品量或者增加聚酰胺粉的使用量。

2.1.3無水乙醇-氨水-水的用量

預處理中首次加入30 mL無水乙醇-氨水-水體積比為7∶2∶1提取，色素含量小于等于0.15 g/kg的樣品再次各加入10 mL無水乙醇-氨水-水體積比為7∶2∶1提取3次即可，色素含量大于0.15 g/kg的樣品需重復提取4次。

2.2檢測波長的選擇

2.2.1色素的化學性質

檸檬黃、日落黃、莧菜紅、胭脂紅、誘惑紅均為水溶性酸性染料，結構中含有不同數量的苯磺酸基，在紫外區有較強的吸收特征［5］。本試驗采用二極管陣列檢測器，在200 nm～700 nm之間對5種合成色素進行光譜掃描。結果發現，5種物質的最大吸收波長λmax如下：檸檬黃428 nm、日落黃483 nm、莧菜紅521 nm、胭脂紅509 nm、誘惑紅507 nm。

2.2.2波長λ254下各色素的響應值

GB/T 5009.35-2003采用的是λ254時進行色素檢測，因此取10.0 μg/mL的5種色素的混標20 μL，在λ254下按照色譜條件進行檢測，各色素的響應值色譜圖見圖1。

圖1　5種色素標準色譜圖Fig.1　Chromatogram of 5 kinds of pigment standard

5種色素的檢測限為檸檬黃0.050 μg/mL、日落黃0.050 μg/mL、莧菜紅0.040 μg/mL、胭脂紅0.040 μg/mL、誘惑紅0.055 μg/mL。

2.2.3最大吸收波長λmax下各色素的響應值

用PDA檢測器對5種合成色素進行檢測時，可以同時5個波長進行檢測，即同一時間測定5個波長的響應值。取10.0 μg/mL的5種色素的混標20 μL，按照色譜條件進行檢測，各色素的響應值色譜圖見圖2～圖6。

圖2　檸檬黃標準的色譜圖Fig.2　Chromatogram of Tartrazine standard

圖3　胭脂紅標準的色譜圖Fig.3　Chromatogram of Ponceau 4R standard

圖4　日落黃標準的色譜圖Fig.4　Chromatogram of Sunset yellow standard

圖5　莧菜紅標準的色譜圖Fig.5　Chromatogram of Amranth standard

圖6　誘惑紅標準的色譜圖Fig.6　Chromatogram of Allura red standard

5種色素在最大吸收波長下的檢出限為檸檬黃0.035 μg/mL、日落黃0.035 μg/mL、莧菜紅0.040 μg/mL、胭脂紅0.040 μg/mL、誘惑紅0.035 μg/mL。可見選擇最大吸收波長時，5種色素的靈敏度顯著提高，響應值增加了1到1.6倍，峰形更加尖銳，降低了方法的檢出限。

2.3線性范圍和檢出限

分別取5種色素的混標標準系列20 μL，按照色譜條件進行檢測，可測得5種色素6個濃度響應值峰面積，以濃度為橫坐標，相應的峰面積為縱坐標，繪制標準曲線，方法的線性范圍、線性回歸方程、相關系數和檢出限見表2。

表2　5種色素的線性范圍、回歸方程、相關系數及檢出限Table 2　Linearity range，calibration curve，correlation and detection limit of five pigment

從表2可以看出，5種合成色素的線性關系良好。以3倍基線噪音確定檢出限濃度。

2.4方法準確度、精密度和回收率測定

在臘腸、火腿腸、紅腸樣品中分別加入標準曲線范圍內高、中、低3個濃度的色素標液，每一個濃度平行制作6份，連續6 d，按照1.3、1.4樣品處理進行試驗，考察方法的日內、日間精密度及絕對回收率。試驗結果列于表3～表5中。

表3　臘腸樣品加標試驗數據Table 3　Experimental data of spiked Sausage samples

表4　火腿腸樣品加標試驗數據Table 4　Experimental data of spiked ham sausage samples

以上試驗結果RSD值均＜1.5%，精密度和絕對回收率結果令人滿意。

2.5樣品分析結果

分別取臘腸、火腿腸、紅腸各10份樣品進行檸檬黃、日落黃、莧菜紅、胭脂紅、誘惑紅5種色素測定。稱取5 g樣品按照1.3進行樣品預處理，再按照1.4進行色素提取，進樣20 μL于高效液相色譜儀中進行分析。試驗結果如下：臘腸中胭脂紅檢出率為20%，誘惑紅檢出率為10%，其他3種色素未檢出，均未超過國家標準，合格率100%；火腿腸中誘惑紅檢出率為40%，1份超過國家標準，超標率10%，其他4種色素未檢出；紅腸中胭脂紅檢出率10%，誘惑紅檢出率為60%，均未超過國家標準，合格率100%。

表5　紅腸樣品加標試驗數據Table 5　Experimental data of spiked red-sausage samples

3　小結

試驗結果表明，通過優化試驗條件，樣品經過石油醚脫脂后、利用無水乙醇-氨水-水溶液作為色素溶出劑，溶出后過濾、提取色素，選擇熟肉制品中5種色素的最大吸收波長用高效液相色譜儀分析測定，分辨率高，靈敏度高，檢出限低，測定快速、簡便，可作為檢測熟肉制品中合成色素的一種準確、可行的分析方法。

［1］宋丹萍，張宏，李琪.國內外食用色素標準的比較及檢測方法的研究進展［J］.食品科學，2014，35（3）:295-300

［2］中華人民共和國衛生部，中國國家標準化管理委員會.GB/T 5009.35-2003食品中著色劑的測定方法［S］.北京:中國標準出版社，2004

［3］王紅梅，郭偉，王繼鵬，等.高效液相色譜法測定肉制品中食用合成色素的含量［J］.食品研究與開發，2007，28（6）:106-108

［4］王紅青，潘向榮，姜荷，等.糖果中6種合成色素液相色譜檢測方法的改進［J］.中國衛生檢驗雜志，2010，20（2）:297-298，389

［5］管敏婭，張立義.食品中5種合成食用色素高效液相色譜檢測方法的探討［J］.中國衛生檢驗雜志，2008，18（6）:1105-1106，1111

Improvement of 5 Synthetic Pigment with HPLC Method for the Determination of Cooked Meat Products

GAO Hui，WANG Yang*，WANG Min
（Zibo Center for Disease Control and Prevention，Zibo 255026，Shandong，China）

To establish a HPLC method for the determination of 5 kinds of synthetic pigment in cooked meat products，the selection of the maximum absorption wavelength of 5 synthetic pigment in the samples was determined by high performance liquid chromatography analysis，after the degreasing of the cooked meat products and the pigment extraction.The obtained regression equations of 5 kinds of synthetic pigment showed a good linear relationship（r＞0.999）in 0.10 μg/mL-50.0 μg/mL linear range，with the detection limit of 0.035 μg/mL-0.040 μg/mL，and the relative standard deviation was between 0.79%to 1.30%.The samples were spiked with recovery experiment，and the absolute recoveries were in the range of 91.5%-101.0%.The method is simple，rapid，accurate，which is suitable for determination of the synthetic pigment in cooked meat products.

cooked meat products；pigment；degreasing；maximum absorption wavelength；HPLC

10.3969/j.issn.1005-6521.2016.13.033

高慧（1979—），女（漢），主管技師，學士，研究方向：食品理化檢測。

汪洋，男，主管技師，碩士，研究方向：食品理化和環境檢測。

2015-04-14