響應面優化-微波輔助提取吳茱萸多糖工藝

魏增云，張海容，陳金娥（.山西省忻州職業技術學院，山西忻州034000；.山西省忻州師范學院生化分析技術研究所，山西忻州034000）

?

響應面優化-微波輔助提取吳茱萸多糖工藝

魏增云1，張海容2，陳金娥2
（1.山西省忻州職業技術學院，山西忻州034000；2.山西省忻州師范學院生化分析技術研究所，山西忻州034000）

利用微波輔助技術進行吳茱萸多糖提取，通過單因素試驗確定因素與水平。在其基礎上，依據響應面分析法研究了微波功率、提取時間、提取次數和液料比對吳茱萸多糖提取率的影響，確定微波提取吳茱萸多糖的最佳工藝參數為：微波功率390W、提取時間為101s、提取次數2次、料液比為103∶1（mL/g）。經驗證試驗測定多糖提取率為21.01%，與預測的最大響應值（吳茱萸多糖提取率為21.90%）的相對偏差為4.06%。

微波輔助提取；響應面法；吳茱萸多糖

吳茱萸（Tetradium ruticarpum）為蕓香科植物，落葉灌木或小型喬木。中藥材吳茱萸為吳茱萸將近成熟的果實曬干，具有健脾和胃、散寒止痛、疏肝下氣、燥濕止瀉之功效［1］，還用于咽喉腫痛、口舌生瘡［2］、高血壓、心血管等病癥的治療［3-5］，《神農本草經》中記載為中藥中品。吳茱萸有兩千年的人工種植栽培歷史，分布于我國中部、南部多省份，如四川、貴州、廣西、湖南等［6］。吳茱萸富含生物堿、揮發油、吳茱萸烯、多糖等多種有效成分。

多糖是一種結構復雜的糖類，有均一性和不均一性兩種。近年來，植物多糖受到了醫藥領域的廣泛重視［7-8］，具有抗氧化性、抑制腫瘤、抗輻射及免疫功能［9-10］。微波提取技術優點突出，易實施、易操作、節時節能無污染，微波作用幾分鐘的提取效果與傳統方式提取幾個小時的效果等同［11］。近年來微波提取發展迅速，已廣泛應用于食品、化工和中藥提取等領域。該研究采用微波輔助對吳茱萸多糖進行提取并對影響吳茱萸多糖含量的幾個重要因素進行了響應面分析，并優化了其工藝條件，以期為工業化提取吳茱萸多糖提供理論依據。

1　材料與方法

1.1試驗材料

吳茱萸購自忻州當地藥店，55℃恒溫干燥3 h，粉碎后過40目篩待用。

D（+）-無水葡萄糖（分析純）、濃硫酸（分析純）：天津耀華化學試劑有限責任公司；苯酚（分析純）：中國醫藥公司天津公司。

SP-723紫外可見光風光光度計：上海光譜；微電腦微波化學反應器LWMC-201：南京陵江科技開發有限責任公司；SHZ-D（Ⅲ）循環水式真空泵：鞏義市予華責任公司；AB204-N型電子天平：梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司。

1.2試驗方法

1.2.1葡萄糖標準曲線的繪制

用移液管準確量取0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4 mL的100 μg/mL的葡萄糖工作液于7支10 mL比色管中，補水到2 mL，加5%的苯酚溶液各1 mL，搖勻，迅速再加98%的濃硫酸各5 mL，標定至10 mL，沸水浴中煮沸15 min，冷水中冷卻。在最大吸收波長490 nm處，以試劑空白作參比，測定吸光值，并以吸光值為縱坐標，濃度c（μg/mL）為橫坐標繪出標準曲線，標準曲線和擬合方程如圖1所示。

多糖提取液的濃度（μg/mL）

圖1　葡糖糖工作曲線Fig.1　Work curve of glucose

1.2.2吳茱萸多糖的提取和測定

準確稱取0.2 g吳茱萸粉末，利用二次水作為提取試劑，設定微波提取功率、提取時間、提取次數和液料比進行微波處理，抽濾得到的多糖濾液，定容到25 mL比色管。進行梯度稀釋后，準確吸取1 mL多糖提取液，加入1 mL 5%的苯酚，搖勻后迅速加入5 mL濃硫酸，標定至10 mL，沸水浴中煮沸15 min，冷水中冷卻后，在490 nm處測定其吸光值，計算多糖提取率。

1.2.3多糖提取單因素試驗

微波功率對多糖提取率的影響：準確稱取吳茱萸粉0.2 g，在液料比為60∶1（mL/g）條件下，采用不同微波功率（130、260、390、520、680 W）處理90 s，提取兩次，考察不同微波功率對多糖提取率的影響；微波輻射時間對多糖提取率影響：準確稱取吳茱萸粉0.2 g，在已優化條件微波功率390 W，液料比60∶1（mL/g）條件下，不同微波輻射時間（30、60、90、120、150 s）提取兩次，考察不同微波輻射時間對多糖提取率的影響；液料比對多糖提取率影響：準確稱取吳茱萸粉0.2 g，在已優化條件微波功率390 W、微波輻射時間120 s條件下，不同液料比（30∶1、60∶1、90∶1、120∶1、150∶1，mL/g）提取兩次，考察不同液料比對多糖提取率的影響；提取次數對多糖提取率影響：準確稱取吳茱萸粉0.2 g，在已優化條件微波功率390 W、微波輻射時間120 s、液料比60∶1（mL/g）條件下，考察不同提取次數（1、2、3、4、5）對多糖提取率的影響。

1.2.4響應面優化設計試驗

結合單因素實驗結果，選取微波時間（X1）、液料比（X2）、微波功率（X3）3個考察因素，應用DesignExpert 7 Docoument軟件設計中心組合試驗和響應面分析法，根據表1設定的試驗因素和水平，以吳茱萸多糖提取率為響應值，進行三因素三水平的響應面分析試驗，并利用響應面法對吳茱萸多糖微波提取條件進行優化。

表1　微波輔助提取吳茱萸多糖試驗因素、水平及編碼Table 1　Codes and levels of factors of microwave assisted extraction of Evodia polysaccharide

2　結果與討論分析

2.1單因素試驗結果分析

2.1.1微波功率對多糖提取率的影響

不同微波功率對吳茱萸多糖提取效果的影響見圖2。

圖2　不同微波功率對吳茱萸多糖提取效果的影響Fig.2　Effect of different microwave power on extraction rate of evodia polysaccharide

由圖2可知，隨著微波功率升高，多糖提取率逐漸升高，當微波功率達到260 W～650 W時提取率不再升高。考慮到微波功率與其它條件交互影響時可留有更加優化的空間，選擇390 W為最適宜微波功率條件。

2.1.2微波輻射時間對吳茱萸多糖提取率的影響

不同微波時間對吳茱萸多糖提取效果的影響見圖3。

圖3　不同微波時間對吳茱萸多糖提取效果的影響Fig.3　Effect of different microwave time on extraction rate of evodia polysaccharide

由圖3可知，隨著微波輻射時間的增加，多糖提取率明顯升高，120 s時達到最高。繼續延長時間提取率并無明顯變化。因此，選擇微波輻射時間120 s為最佳微波輻射時間條件。

2.1.3料液比對吳茱萸多糖提取率的影響

不同液料比對吳茱萸多糖提取效果的影響見圖4。

圖4　不同液料比對吳茱萸多糖提取效果的影響Fig.4　Effect of the liquid-solid ratio on extraction rate of evodia polysaccharide

由圖4可知，隨著料液比的增大多糖提取率也逐漸增大，當料液比增大到1∶60（g/mL）時，之后繼續增大再無明顯變化。因此確定最佳料液比條件為1∶60（g/mL）。

2.1.4提取次數對吳茱萸多糖提取率的影響

不同提取次數對吳茱萸多糖提取效果的影響見圖5。

由圖5可知，隨著提取次數的增加，多糖得率依次升高，但2次后雖有升高但并不明顯。考慮到工藝成本等因素選擇提取2次為最佳提取次數條件。

2.2響應面法對微波提取吳茱萸多糖提取條件的優化

2.2.1模型建立與顯著性檢驗

圖5　不同提取次數對吳茱萸多糖提取效果的影響Fig.5　Effect of different extraction times on eth extraction rate of evodia polyaccharide

以X1、X2、X3為自變量，以吳茱萸多糖吸光值為響應值、采用Design-Exper軟件中的Box-Behnken設計方法［12-14］對試驗結果進行擬合。析因試驗1～12號，中心試驗13號～17號。析因點和零點為17個試驗點，析因點為自變量取值構成的三維頂點；零點為中心點。試驗驗設計與結果見表2。

表2　微波輔助提取吳茱萸多糖試驗設計與結果Table 2　Microwave-assisted extraction evodia polysaccharide experimental design and results

為了表明各因素對響應值Y的影響關系，采用DesignExpert 7 Docoument軟件對表2的數據進行多元回歸分析，建立回歸模型，求的到如下回歸方程。

Y=0.56+0.044X1+0.038X2+0.036X3+0.043X12-0.024X22-0.036X32+0.005X1X2+0.003X1X3+0.031X2X3

回歸方程系數顯著性檢驗（表3）可以看出，X1X2、X1X3、X22的P值大于0.05，為不顯著項，其余各項均顯著。為了進一步確證最佳點的取值，對回歸方程取一階偏導等于零數并整理得：0.044+0.005 X2+0.003 X3+0.086 X1=0

0.038+0.005 X1+0.031 X3-0.048 X2=0

0.036+0.003 X1+0.031 X2-0.072 X3=0

求解方程得到：X1=-0.633，X2=1.429，X3=1.089

即：提取時間、液料比、微波功率分別為101 S、102.87∶1（mL/g）、401.57W，實際生產情況下，提取時間、液料比、微波功率可分別修正為101 S、103∶1（mL/g）、390 W為最佳生產工藝參數。為了進一步驗證吳茱萸多糖最優的微波輔助提取工藝，采用上述條件進行了3次重復試驗，結果吳茱萸多糖提取液的吸光值均達到了0.570±0.003（即提取率為21.01%）與0.592理論值（即提取率為21.90%）基本一致，與預測的最大響應值的相對偏差為4.06%。

表3　回歸方程系數顯著性檢驗表Table 3　Significance test for regression coefficient

回歸模型的方差分析（表4）可以看出，該模型的確定系數R2=0.936 7，說明該模型能夠解釋93.67%的變化，方程模型顯著性P=0.004 1，表明該回歸方程的擬合度良好。可以很好解釋模型的變化，試驗誤差小，自變量與響應值線性關系顯著，可以用于吳茱萸多糖微波提取實驗的理論預測。

表4　回歸模型方差分析表Table 4　Analysis of variance for regression equation

2.2.2吳茱萸多糖提取率的響應面分析與優化

根據回歸分析結果作出響應曲面如圖6～圖8。

圖6　微波功率和時間對提取液中吳茱萸多糖吸光值影響的響應曲面和等高線Fig.6　Response surface and contour line for the effect of microwave power and time on absorption of evodia polysaccharide

圖7　微波提取時間和液料比對提取液中吳茱萸多糖吸光值影響的響應曲面和等高線Fig.7　Response surface and contour line for the effect of extraction time and the ratio of liquid to solid on absorption of evodia polysaccharide

圖8　微波功率和液料比對提取液中吳茱萸多糖吸光值影響的響應曲面和等高線Fig.8　Response surface and contour line for the effect of power and the ratio of liquid to solid on absorption of evodia polysaccharide

從圖6～圖8可以看出，多糖提取率存在極大值，即響應面的最高點由DesignExpert 7 Docoument軟件分析可得最大響應值為0.592（即提取率為21.90%），提取時間、液料比、微波功率分別為101 s、102.87∶1（mL/g）、401.57 W，為了驗證響應面的可行性，采用所得到的優化條件進行吳茱萸多糖提取的驗證試驗，結果表明提取時間、液料比、微波功率分別修正為101 s、103∶1（mL/g）、390 W時，多糖提取率為21.01%，與預測的最大響應值的相對偏差為4.06%。

3　結論

通過DesignExpert 7 Docoument軟件設計的響應面分析法，能夠可靠地進行優化試驗以及數據處理，試驗應用這一方法對吳茱萸多糖提取的工藝條件進行了優化。

在單因素的基礎上應用DesignExpert 7 Docoument軟件設計三因素三水平的試驗，確定出了吳茱萸多糖提取的優化工藝條件為：提取時間101 s、提取次數2次、液料比102.87∶1（mL/g）、微波功率401.57 W。多糖提取率高達21.90%，修正條件后，驗證試驗提取率相對偏差并不大，試驗研究的最優的工藝參數可靠，指導實踐生產可行。

［1］姜南輝，徐曉東.關于當歸、吳茱萸藥對提取及含量測定的研究［J］.遼寧中醫雜志，2014，41（11）:2429-2432

［2］黃慧蓮，劉賢旺，羅光明，等.吳茱萸研究進展［J］.現代中藥研究與實踐，2003，17（3）:62-64

［3］WEI J，CHING L C，ZHAO J F，et al.Essential role of transient receptor potential vanilloid type 1 in evodiamine-mediated protection against atherosclerosis［J］.Acta Physiol（Oxf），2013，207（2）:299-307

［4］嚴春臨，張季，吳雪智，等.吳茱萸次堿對腦缺血再灌注小鼠學習記憶障礙的改善作用研究［J］.中國藥理學與毒理學雜志，2012，26（3）:418

［5］高永雙，何娜，吳芹，等.吳茱萸提取物抑制野百合堿所致右心室肥厚的作用［J］.時珍國醫國藥，2010，21（1）:144-145

［6］郭婷.湘產吳茱萸藥材質量研究及HPLC指紋圖譜分析［D］.長沙:湖南中醫藥大學，2014:1-2

［7］楊洪財，張月明，鄒紅云.植物多糖藥效研究進展［J］.地方病通報，2004，19（2）:88-90

［8］張海容，郭祀遠.中藥多糖研究的哲學思考［J］.忻州師范學院學報，2011，27（5）:12-15

［9］王獻友，陳培云，吳廣臣，等.黑木耳多糖提取及其藥理活性的研究進展［J］.南方農業學報，2012，43（5）:683-687

［10］王迎進，張書書，蘆婧，等.微波輔助提取壺瓶棗多糖及抗氧化性［J］.光譜實驗室，2012，29（1）:364-366

［11］謝明勇，陳奕.微波輔助萃取技術研究進展［J］.食品與生物技術學報，2006，25（1）:105-114

［12］張月娟，張琨，萬一.響應面法優化重組hCu，Zn-SOD改構體發酵培養基［J］.生物技術，2011，21（3）:69-73

［13］鄒建國，徐小龍，劉燕燕.響應面法優化超聲輔助提取馬錢子中的生物堿的工藝研究［J］.食品科學，2009，30（16）:111-114

［14］張馳.六西格瑪試驗設計［M］.廣州:廣東經濟出版社，2003:289-307

Optimization of Microwave-Assisted Extraction of Polysaccharides from Evodia with Response Surface Methodology

WEI Zeng-yun1，ZHANG Hai-rong2，CHEN Jin-e2
（1.College of Xinzhou Occupation Technology，Xinzhou 034000，Shanxi，China；2.Institute of Biochemical Analysis，Xinzhou Teachers'College，Xinzhou 034000，Shanxi，China）

The extraction of polysaccharide of evodia with microwave-assisted method，the factors and levels were determined through single factor experiment.The effects of microwave power，extraction time，extraction times and material-liquid ratio on extraction rates of ERP were studied based on of single factor experiment with response surface methodology.The optimum conditions for the extraction polysaccharides of evodia were as follows：390 W of microwave power，101 s of extraction time，twice for extraction times and the material-liquid ratio of 103∶1（mL/g）.Under this condition，the model predictive and experimental value of evodia polysaccharides yield were 21.90%and 21.01%，respectively.The relative standard deviation was 4.06%.

microwave-assisted extraction；the response surface method；polysaccharide of evodia

10.3969/j.issn.1005-6521.2016.13.010

山西省高等學校科技創新項目資助（20141120）；忻州師范學院物理化學重點學科資助項目（XK201402）

魏增云（1975—），男（漢），副教授，碩士，主要從事植物成分分離分析方向研究。

2015-07-24