憂遁草活性物質超聲輔助提取工藝的優化

于群，段偉文，劉兵，段振華，，*，商飛飛（.海南大學食品學院，海南海口5708；.賀州學院食品研究院，廣西賀州54899）

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憂遁草活性物質超聲輔助提取工藝的優化

于群1，段偉文2，劉兵1，段振華1，2，*，商飛飛2
（1.海南大學食品學院，海南海口570228；2.賀州學院食品研究院，廣西賀州542899）

以多酚、黃酮、三萜和維生素C 4種活性物質為指標，研究超聲時間、超聲溫度、料液比和超聲功率對憂遁草中活性物質提取效果的影響，利用正交試驗優化超聲輔助提取憂遁草活性物質的最佳工藝條件。試驗結果表明料液比和超聲時間對多酚、黃酮和維生素C得率的影響較大；超聲功率和超聲時間對三萜得率影響較大。通過四因素三水平的正交試驗，確定了憂遁草中4種活性物質提取的最佳條件，得出超聲輔助提取的最優提取工藝是：超聲時間40 min，超聲溫度45℃，料液比1∶55（mg/mL），超聲功率156 W。在此條件下4種活性成分的得率分別為：多酚9.387 mg/g，黃酮28.785 mg/g，三萜23.665mg/g，維生素C0.216mg/g。

憂遁草；活性物質；超聲波；提取

憂遁草又名鱷嘴花、扭序花等，在海南省五指山等少數民族地區稱之為“接骨草”。憂遁草為爵床科鱷嘴花屬植物，生長在靠近赤道的低海拔疏林中或灌叢內潮濕砂質土壤里，是一種高大草本植物，它分布于東南亞地區以及我國海南、廣東、廣西和云南等地［1-2］。憂遁草一般以全株或葉片入藥，味甘、微苦，性涼，具有清熱利濕、利尿消腫、活血疏經、除濕、抗腫瘤等功效。在泰國民間，憂遁草已被作為一種廣泛運用的藥用植物，常被用于昆蟲或毒蛇咬傷［3］。據文獻記載，憂遁草的這些生理活性主要歸根于其中含有豐富的三萜類、黃酮糖苷、多酚類和維生素類等活性成分［4-5］。所以將這些活性成分充分高效地提取具有重要意義。超聲提取技術操作簡單、快捷，提取成本低，而且超聲波能顯著加速傳質過程，提高提取效率［6-8］。本文以多酚、黃酮、三萜和維生素C 4種活性物質為測定指標，利用超聲波輔助提取憂遁草中的活性物質，確定最佳工藝，為憂遁草的進一步開發利用提供參考。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

憂遁草粉末：海南五指山萬家寶科技有限公司提供。

沒食子酸標準品、蘆丁標準品、2，6-二氯靛酚、齊墩果酸和香草醛：上海源葉生物科技有限公司；福林酚標準品，北京索萊寶科技有限公司；抗壞血酸：西隴化工股份有限公司；其它試劑均為國產分析純。

1.2主要儀器與設備

KS-300E超聲波清洗機：寧波科生儀器廠；7200可見分光光度計：龍尼柯（上海）儀器有限公司；BS124S電子天平：Sartorius公司；HH-S26S電熱恒溫水浴鍋：金壇市大地自動化儀器廠；TDZ5-WS多管架自動平衡離心機：湖南湘儀實驗室儀器開發有限公司；EL204電子天平：梅特勒-托利多儀器有限公司等。

1.3方法

1.3.1多酚得率的測定方法

標準曲線的繪制：參照徐輝艷等［9］方法，稍作修改。以試劑空白參比，用最小二乘法做線性回歸，得多酚濃度（mg/mL）與吸光度A的回歸方程為A= 91.406C1+0.015 9，r2=0.995 8。

量取提取液0.5 mL，按照上述標準曲線步驟操作測定吸光度并由上述公式計算得到多酚的質量濃度。

多酚得率/（mg/g）=100C1×V1/m，式中：C1為多酚的質量濃度；V1為待測液體積；m為憂遁草質量。

1.3.2黃酮得率的測定方法

標準曲線的繪制：參照李鵬婧等［10］方法，稍作修改。以試劑空白參比，用最小二乘法做線性回歸，得黃酮濃度（mg/mL）與吸光度A的回歸方程為A=5.8766C2+ 0.015 9，r2=0.995 5。

量取提取液1 mL，按照上述標準曲線步驟操作測定吸光度并由上述公式計算得到黃酮的質量濃度。

黃酮得率/（mg/g）=100C2×V2/m，式中：C2為黃酮的質量濃度；V2為待測液體積；m為憂遁草質量。

1.3.3三萜得率的測定方法

標準曲線的繪制：參照黃生權等［11］方法，稍作修改。以試劑空白參比，用最小二乘法做線性回歸，得三萜濃度（mg/mL）與吸光度A的回歸方程為A= 42.899C3－0.016 2，r2=0.995 8。

量取提取液0.5 mL，按照上述標準曲線步驟操作測定吸光度并由上述公式計算得到三萜的質量濃度。

三萜得率/（mg/g）=100C3×V3/m，式中：C3為三萜的質量濃度；V3為待測液體積；m為憂遁草質量。

1.3.4維生素C含量的測定方法

參照趙曉梅等［12］方法，稍作修改，對憂遁草中的維生素C含量進行測定。先對2，6-二氯靛酚進行標定，標定所得滴定度T（mg/mL）的計算公式為：T=CV/（V1-V0），式中：C為標準抗壞血酸濃度；V為吸取的標準抗壞血酸溶液體積；V0為空白溶液滴定所消耗的2，6-二氯靛酚溶液體積；V1為滴定所消耗的2，6-二氯靛酚溶液體積。

然后根據公式計算維生素C（mg/100 mg）的提取率：維生素C/（mg/100 mg）=5（V2-V0）T/M，式中：V0為空白溶液滴定所消耗的2，6-二氯靛酚溶液體積；V2為提取液滴定時所消耗的2，6-二氯靛酚溶液體積；T為滴定度；M為測定時吸取的提取液相當于憂遁草原料的質量。

1.3.5提取試驗設計

單因素試驗：根據預試驗結果，選取超聲時間（10、20、30、40、50 min）、料液比［1∶20、1∶30、1∶40、1∶50、1∶60（mg/mL）］、超聲溫度（30、40、50、60、70℃）和超聲功率（72、108、144、180、216 W）4個因素進行單因素試驗，在控制其他因素不變的情況下，考察各個單因素對憂遁草多酚、多糖、黃酮和維生素C得率的影響。

正交試驗：在單因素試驗結果的基礎上以超聲時間、料液比、超聲溫度和超聲功率為考察因素，設計四因素三水平的正交試驗，對超聲波輔助提取憂遁草活性物質的工藝進行優化。

2　結果與分析

2.1單因素試驗結果與分析

2.1.1超聲時間對活性成分得率影響的結果與分析

準確稱取1.00 g憂遁草粉末，設定超聲溫度為50℃，超聲功率為144 W，探索超聲時間對憂遁草各活性成分得率的影響。結果如圖1所示。

圖1　超聲時間對得率的影響Fig.1　Effect of ultrasound treatment time on yield

由圖1可以看出，隨著超聲時間的增加各成分得率都呈現增大的趨勢，當超聲時間增加到30 min時，隨著超聲時間的增加，維生素C和三萜含量呈明顯下降趨勢，其他成分變化較平緩。這可能是因為超聲時間的延長使已溶出的維生素C被氧化而造成損失；而且超聲波獨具的物理性質能夠促使植物細胞組織破壁或變形，短時間內即可獲得最佳得率，但隨著時間過長，強烈的空化作用將使分子結構發生改變且超聲波處理過程不斷產熱，對三萜造成一定損失［13］；除此之外，時間過長，一些黃酮和多酚因不穩定而易被氧化，時間過短，部分黃酮和多酚溶解不充分［14］。因此，從節約能源和活性物質得率降低的角度考慮，選定30 min為較適超聲時間。

2.1.2料液比對活性成分得率影響的結果與分析

設定超聲時間30 min，超聲溫度為50℃，超聲功率比為144 W，探索料液比對憂遁草各活性成分得率的影響。結果如圖2所示。

圖2　料液比對得率的影響Fig.2　Effect of material/liquid radio on yield

由圖2可以看出，隨著料液比的增加，多酚、黃酮、維生素C和三萜的得率呈現增大趨勢，其中，維生素C、三萜和多酚在料液比為1∶50（mg/mL）時出現最大值，黃酮、三萜和多酚的含量隨著料液比的增加而趨于平穩，這可能是因為溶劑量過大時，超聲波輻射被溶劑分子吸收較多，溶劑分子分散了超聲波對有效成分的作用，作用于物料相對較少，活性物質提取不完全，因而會影響黃酮、三萜和多酚的析出［15］。綜上考慮，選擇1∶50（mg/mL）為較適料液比。

2.1.3超聲溫度對活性成分得率影響的結果與分析

準確稱取1.00 g憂遁草粉末，設定超聲時間為30 min，超聲功率為144 W，探索超聲溫度對憂遁草各活性成分得率的影響。結果如圖3所示。

圖3　超聲溫度對得率的影響Fig.3　Effect of ultrasound temperature on yield

由圖3可以看出，隨著溫度的升高，4種活性物質的得率都表現出先增大后減小的趨勢，其中黃酮和維生素C在整個過程中變化趨勢較明顯，多酚和三萜變化趨勢較平緩。隨著提取溫度的上升，活性分子的運動速度加快，而且熱量對細胞壁有破壞作用，使其容易從細胞中提取出來，當提取溫度達到50℃時，繼續增加溫度，提取率有所下降，這可能是因為溫度過高，活性物質易被氧化，導致得率降低［16］。此外，多酚在較高溫度和超聲波的作用下還可能發生變質［17］，所以，選擇50℃為較佳提取溫度。

2.1.4超聲功率對活性成分得率影響的結果與分析

準確稱取1.00 g憂遁草粉末，設定超聲時間為30 min，超聲溫度為50℃，探索超聲功率對憂遁草各活性成分得率的影響。結果如圖4所示。

圖4　超聲功率對得率的影響Fig.4　Effect of ultrasound power on yield

由圖4可以看出，隨著超聲功率的增加，4種活性物質的得率呈現增大的趨勢，當超聲功率達到144 W時，四種活性物質的功率達到最大值，但隨著超聲功率的繼續增加，活性物質得率下降。這主要是由于超聲功率的增加，溶劑分子擴散速度加快，有利于活性物質的浸出；但隨著功率的進一步增加，過高的超聲功率產生瞬時高溫會使許多活性成分遭到破壞，雜質溶出較多，因此它們得率會降低［18］。綜上考慮，選擇144 W為最佳提取功率。

2.2正交試驗結果與分析

根據單因素試驗結果，選取超聲時間、超聲溫度、料液比和超聲功率為考察因素，設計四因素三水平的正交試驗，因素水平設計表見表1。

表1　正交試驗因素水平表Table 1　Factors and their levels in orthogonal array design

試驗結果分析如表2所示。

由表2可以看出，多酚得率影響因素的主次順序為C＞A＞D＞B，A2B1C3D3為最優組合；黃酮得率影響因素的主次順序為A＞C＞D＞B，A3B2C3D2為最優組合；三萜得率影響因素的主次順序為D＞A＞C＞B，A2B1C2D3為最優組合；維生素C得率影響因素的主次順序為A＞C＞D＞B，A1B3C2D3為最優組合。考慮到料液比對多酚的影響最顯著，所以選擇多酚的最佳料液比1∶55（mg/mL）為最優料液比；超聲時間對黃酮的影響最顯著，所以選擇黃酮的最佳超聲時間40 min為最優超聲時間；而超聲功率對三萜的影響最顯著，所以選擇三萜的最佳超聲功率156 W為最優超聲功率；超聲溫度對4種活性物質的影響并不顯著，為保證其最大活性，選擇45℃為最優超聲溫度。綜上所述，確定最優組合為A3B1C3D3，即提取時間40 min，超聲溫度45℃，料液比1∶55（mg/mL），超聲功率156 W。

表2　正交試驗結果Table 2　Results of orthogonal test

根據篩選到的最優組合進行3次平行驗證試驗，試驗結果平均值為：多酚得率9.476 mg/g，黃酮得率28.695 mg/g，三萜得率23.719 mg/g，維生素C得率0.216 mg/g均高于或接近正交試驗結果。

3　結論

利用超聲波技術輔助提取憂遁草內4種活性物質（多酚、黃酮、三萜、維生素C）。并考察4個因素（超聲時間、超聲溫度、料液比和超聲功率）對4種活性物質得率的影響。

多酚得率的影響大小因素次序為料液比＞提取時間＞超聲功率＞超聲溫度，黃酮得率的影響大小因素次序為提取時間＞料液比＞超聲功率＞超聲溫度，三萜得率的影響大小因素次序為超聲功率＞提取時間＞料液比＞超聲溫度，維生素C得率的影響大小因素次序為提取時間＞料液比＞超聲功率＞超聲溫度。

超聲波輔助提取的最佳條件為：提取時間40 min，超聲溫度45℃，料液比1∶55（mg/mL），超聲功率156 W。

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Optimization of Ultrasonic-assisted Extraction Process for Active Substance from Clinacanthus nutans

YU Qun1，DUAN Wei-wen2，LIU Bing1，DUAN Zhen-hua1，2，*，SHANG Fei-fei2
（1.College of Food Science，Hainan University，Haikou 570228，Hainan，China；2.Institue of Food Research，Hezhou University，Hezhou 542899，Guangxi，China）

With polyphenols，flavonoids，triterpenoid and vitaminC as detection index，the effect of ultrasonic temperature，time，power and solid-liquid ratio on extraction efficiency was studied.Optimum extraction process was determined by orthogonal test.The solid-liquid ratio and ultrasonic time had great effect on extraction efficiency of polyphenols，flavonoids and vitaminC.The ultrasonic power and ultrasonic time had a greater effect on triterpenoid than the temperature and solid-liquid ratio.The best condition of active substance of Clinacanthus nutans was determined by four-factor and three-level orthogonal test.The optimal extraction process conditions were determined as follows：ultrasonic temperature，45℃；ultrasonic power，156W；and solid-liquid ratio，1∶55（mg/mL）for an extraction duration of 40 minutes.Under these conditions the extraction yield of each component were：polyphenols 9.387 mg/g，flavonoids 28.785 mg/g，triterpenoid 23.665 mg/g，vitaminC 0.216 mg/g.

Cinacanthus nutans；active substance；ultrasonic；extraction

10.3969/j.issn.1005-6521.2016.13.013

于群（1993—），女（漢），碩士研究生，研究方向：食品工程。

段振華（1965—），男（漢），教授，博士，研究方向：水產品食品科學技術。

2015-11-27