豬流行性腹瀉病毒疫苗株與野毒株RT-PCR檢測(cè)方法的建立與應(yīng)用

朱海俠　曾亮明　傅星源　張?zhí)N冰　陳雷　張淵魁（福州大北農(nóng)生物技術(shù)有限公司福州350014）

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豬流行性腹瀉病毒疫苗株與野毒株RT-PCR檢測(cè)方法的建立與應(yīng)用

朱海俠曾亮明傅星源張?zhí)N冰陳雷張淵魁*
（福州大北農(nóng)生物技術(shù)有限公司福州350014）

根據(jù)GenBank中豬流行性腹瀉（PED）疫苗株與野毒株ORF3的特點(diǎn)設(shè)計(jì)特異性引物，建立能夠快速區(qū)分PEDV疫苗株與野毒株的RT-PCR檢測(cè)方法。建立的RT-PCR檢測(cè)方法能夠?qū)EDV疫苗株與野毒株擴(kuò)增出特異性片段，其大小分別為278 bp和327 bp。該方法具有快速、特異、通用等特點(diǎn)，可用于實(shí)驗(yàn)室快速診斷、野毒株的區(qū)分，為該病的診斷及免疫防控提供參考依據(jù)。

豬流行性腹瀉疫苗株野毒株

豬流行性腹瀉（Porcine epidemic diarrhea，PED）是由豬流行性腹瀉病毒（PEDV）引起的一種急性、高度接觸性腸道傳染病［1］。該病主要以腹瀉、嘔吐、脫水以及哺乳仔豬的高致死率為特征，各年齡段、不同品種豬均可發(fā)病。該病于1971年首次在英國(guó)報(bào)道［2］，此后在世界范圍內(nèi)均有報(bào)道［3-4］。我國(guó)于1976年首次報(bào)道該病，并于1980年首次分離到PEDV［5］，隨后在世界各地呈現(xiàn)大面積流行［6-7］，給養(yǎng)豬業(yè)帶來(lái)巨大的經(jīng)濟(jì)損失。

本研究利用PEDV ORF3基因強(qiáng)弱毒株有49～51 bp缺失的特性設(shè)計(jì)特異性引物，通過(guò)一次試驗(yàn)即可解決是否有PEDV感染以及是疫苗毒感染還是野毒感染或共感染的情況，極大地降低檢測(cè)時(shí)間和檢測(cè)成本，此外也為該病的流行病學(xué)調(diào)查及免疫防控提供參考依據(jù)。

1　材料與方法

1.1病毒株P(guān)EDV野毒株由本實(shí)驗(yàn)室分離；PED活疫苗（毒株ZJ-08株）、豬瘟病毒（HCV）、豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）、豬傳染性胃腸炎病毒（TGEV）均由福州大北農(nóng)生物技術(shù)有限公司提供。

1.2主要試劑RNA viral Kit購(gòu)自O(shè)mega公司；AMV反轉(zhuǎn)錄酶、HPRI、Random primer、DL2000 DNA Marker和dNTPs（2.5mmol/L）均購(gòu)自寶生物工程（大連）有限公司；PCR Master Mix（2×）購(gòu)自天根生化科技有限公司。

1.3引物設(shè)計(jì)與合成參照GenBank中登錄的PEDV ORF3基因序列，利用Primer Permier 5.0和Oligo 7.0軟件設(shè)計(jì)特異性引物。引物序列為：F：GGCGCAATTATATTATGTTGG；R：CACGTATAGCTA GATACAAGTCA；引物均由Invitrogen公司合成。

1.4病毒RNA的提取和CDNA的合成按照RNA viral kit提取總RNA。按照AMV反轉(zhuǎn)錄酶使用說(shuō)明書進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄合成CDNA，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5PCR擴(kuò)增以提取的樣品CDNA為模板，用所設(shè)計(jì)的特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)體系50 uL，其中：2×Mix 25 uL、上下游引物（20 umol/mL）各1 uL、cDNA 1 uL，補(bǔ)充去離子水至終體積為50 uL。PCR反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性5min；94℃變性50 s，55℃退火35 s，72℃延伸25 s，30個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min。反應(yīng)結(jié)束后，擴(kuò)增產(chǎn)物用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

1.6引物特異性試驗(yàn)分別以豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）、豬瘟病毒（HCV）、豬傳染性胃腸炎病毒（TGEV）為模板進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，以驗(yàn)證該方法的特異性。

1.7檢測(cè)方法的應(yīng)用用建立的RT-PCR檢測(cè)方法對(duì)送檢的臨床樣品進(jìn)行檢測(cè)，并設(shè)立陰性對(duì)照。

2　結(jié)果與分析

2.1PEDV疫苗株與野毒株的擴(kuò)增該方法能夠?qū)σ呙缰陻U(kuò)增出一條大小為278 bp的目的片段，對(duì)野毒株擴(kuò)增出一條大小為327 bp的目的片段，其大小與預(yù)期目的片段一致，差異明顯（見(jiàn)圖1）。將目的條帶進(jìn)行純化、克隆、測(cè)序，經(jīng)Blast比對(duì)分析，與GenBank中的PEDV ORF3序列相似度高達(dá)99%以上。

2.2特異性試驗(yàn)分別對(duì)豬源性病毒：豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）、豬瘟病毒（HCV）、豬傳染性胃腸炎病毒（TGEV）進(jìn)行RNA提取與CDNA合成，以這3種CDNA為模板進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增結(jié)果顯示（見(jiàn)圖2），該方法具有良好的特異性，不會(huì)在實(shí)際應(yīng)用中引起非特異性擴(kuò)增。

2.3RT-PCR鑒定方法的應(yīng)用采用建立的RTPCR檢測(cè)方法對(duì)2016年1月份以來(lái)送檢的37份疑似PEDV感染豬糞樣、嘔吐物及腸道內(nèi)容物CDNA進(jìn)行擴(kuò)增，經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，37份樣品中有30份能檢測(cè)到PEDV，其中野毒感染13份，疫苗毒與野毒共感染的為17份，提示疫苗接種已難以控制該病的流行。

3　結(jié)論

目前已有多種PEDV檢測(cè)方法建立的報(bào)道。李長(zhǎng)龍等［8］建立了能夠區(qū)分豬流行性腹瀉疫苗毒與野毒的RT-PCR檢測(cè)方法，可用于PEDV診斷及流行病學(xué)調(diào)查；劉琦等［9］建立巢式PCR法；修金生等［10］根據(jù)野毒株和弱毒疫苗株在高度保守ORF3基因核苷酸序列的差異，建立了能夠區(qū)分疫苗毒與野毒的SYBR Green I檢測(cè)方法。

本文成功建立了鑒別診斷PEDV疫苗株與野毒的RT-PCR檢測(cè)方法，該方法具有操作簡(jiǎn)單、用時(shí)少、花費(fèi)低等特點(diǎn)。利用該方法對(duì)豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）、豬瘟病毒（HCV）、豬傳染性胃腸炎病毒（TGEV）等豬源性病毒的檢測(cè)結(jié)果均為陰性，說(shuō)明該方法具有很好的特異性。目前PED的流行趨勢(shì)較為嚴(yán)峻［11］。Gao等［12］報(bào)道了變異PEDV在我國(guó)發(fā)病豬場(chǎng)中占主導(dǎo)地位。臨床檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，大部分發(fā)病豬只中存在疫苗株與野毒共感染的特點(diǎn)，提示目前流行的仔豬流行性腹瀉很有可能是由豬流行性腹瀉病毒變異株引起的，僅采用經(jīng)典株疫苗進(jìn)行免疫，已經(jīng)難以達(dá)到有效的防控目的，應(yīng)根據(jù)檢測(cè)數(shù)據(jù)及臨床使用結(jié)果給予合理的免疫接種。

［1］施標(biāo),董世娟,朱于敏,等.中國(guó)豬流行性腹瀉病毒分子流行病學(xué)研究進(jìn)展［J］.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué),2013,46（20）：4362-4369.

［2］Penanert M B,de Bouck P.A new coronavirus-like particle associated w ith diarrhea in sw ine［J］.Archives of Virology, 1978,58（3）：243-247.

［3］Debouck P,Pensaert M.Experimental infection of pigs w ith a new porcine enteric coronavirus,CV777［J］.American journalof veterinary research,1980,41（2）：219-223.

［4］Takahashi K,Okada K,Ohshima K.An outbreak of sw ine diarrhea of a new-type associated w ith coronavirus-like particles in Japan［J］.Nippon juigaku zasshi the Japanese Journal of Veterinary Science,1983,45（6）：829-832.

［5］Xuan H,Xing D,Wang D,et al.Study on the culture of porcine epidem ic diarrhea virus adapted to fetal porcine primary cell monolayer［J］.Veterinary Science in China, 1984,4（3）：202-208.

［6］Chen Q,Li G,Stasko J,et al.Isolation and characterization of porcine epidem ic diarrhea viruses associated w ith the 2013 disease outbreak among sw ine in the United States［J］.JournalofClinicalM icrobiology,2014,52（1）：234-243.

［7］倪艷秀,林繼煌,何孔旺,等.豬流行性腹瀉研究概況［J］.畜牧與獸醫(yī),2001,33（1）：38-40.

［8］李長(zhǎng)龍,陳建飛,張?chǎng)?等.豬流行性腹瀉病毒野毒株/疫苗株RT-PCR鑒別診斷方法的建立［J］.中國(guó)獸醫(yī)雜志, 2014,50（6）：6-8.

［9］劉琦,馮曉聲,周如月,等.鑒別豬流行性腹瀉疫苗毒株與野毒株巢式PCR檢測(cè)方法的建立及初步應(yīng)用［J］.廣東畜牧獸醫(yī)科技,2015,40（2）：36-38.

［10］修金生,陳小權(quán),王斌,等.基于SYBR I實(shí)時(shí)熒光定量PCR對(duì)豬流行性腹瀉病毒野毒和疫苗弱毒鑒別診斷方法的建立［J］.中國(guó)動(dòng)物傳染病學(xué)報(bào),2012,20（5）：16-21.

［11］王福軍,林晴,許先明,等.近期暴發(fā)仔豬流行性腹瀉的探討［J］.福建畜牧獸醫(yī),2013,35（1）：38-40.

［12］Gao Y,Kou Q,Ge X,et al.Phylogenetic analysisof porcine epidem ic diarrhea virus field strains prevailing recently in China［J］.Archivesof Virology,2013,158（3）：711-715.

Establishm ent and app lication of RT-PCR assay for detection of PEDV vaccine and w ild strains

Zhu Haixia Zeng Liangming Fu Xingyuan Zhang Yunbing Chen Lei Zhang Yuankui*
（Fuzhou DaBeiNong Bio.Tech.Co.，F(xiàn)uzhou 350014）

Based on the characteristics of porcine epidemic diarrhea（PED）gene in ORF3 between vaccine and wild strains，one pair of primers was designed and a rapid diagnostic method of RT-PCR was established.The established method had a rapid and general features and itonly amplified target band from PEDV.A total of 278 bp bandswere amplified from vaccine strains and 327 bp bands were amplified from wild strains.A highly special RT-PCR method was established and it can directly differentiate PEDV vaccine strains and wild strains，which can be provide reference for diagnosis and the immune prevention.

Porcine epidem ic diarrhea（PED）Vaccine strain W ild strain

A

1003-4331（2016）03-0014-03

福州大北農(nóng)生物技術(shù)有限公司畜禽常見(jiàn)病免疫防控技術(shù)研究專項(xiàng)基金資助。

朱海俠（1986-），女，助理獸醫(yī)師，碩士研究生。

張淵魁，男，高級(jí)獸醫(yī)師。

E-mail：zhang.yuankui@qq.com。