中性蛋白酶在麥迪霉素溶媒萃取中的破乳作用

藍燦華　吳菲菲　鄭丹梅　黃琳（.福建師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，福州3507；2.福建師范大學(xué)工業(yè)微生物教育部工程研究中心，福州3507）

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中性蛋白酶在麥迪霉素溶媒萃取中的破乳作用

藍燦華1,2吳菲菲1鄭丹梅1黃琳1
（1.福建師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，福州350117；2.福建師范大學(xué)工業(yè)微生物教育部工程研究中心，福州350117）

研究一種利用AS1.398中性蛋白酶大幅度減輕麥迪霉素溶媒（醋酸丁酯，BA）萃取時乳化現(xiàn)象的方法，通過正交試驗確定綜合效果最佳的酶反應(yīng)條件：酶加量（En）0.10%，溫度37℃，pH 7.0，攪拌時間60m in。在該條件下，可以減輕84%的乳化。利用該法破乳，麥迪霉素的成品質(zhì)量和提取收率不受影響，而溶媒損耗卻降低28%，并且可以改善勞動條件，達到節(jié)能、環(huán)保的目的。

AS1.398中性蛋白酶麥迪霉素溶媒萃取破乳

溶媒萃取法因其具有快速、高效、簡便、經(jīng)濟等優(yōu)點而一直在抗生素提取領(lǐng)域占據(jù)著重要地位，廣泛應(yīng)用于青霉素、紅霉素和其他許多抗生素的提取。然而，形成穩(wěn)定的乳化液又是溶媒萃取過程中經(jīng)常遇到的問題，乳化會造成萃取之后有機相與水相分離困難，使產(chǎn)品和溶媒隨著水相的排除而受損失［1-2］，影響其收率，明顯增加成本，同時還會造成環(huán)境污染。

人們普遍認為，發(fā)酵液中含有大量的菌絲體、蛋白質(zhì)和肽類等大分子物質(zhì)，是引起溶媒萃取時嚴重乳化的主要原因［1，3］，這些蛋白質(zhì)分散成微粒，呈膠體狀態(tài)，用溶媒萃取時，能在溶媒相和水相界面上形成保護膜，使乳化液變穩(wěn)定。

工業(yè)上已有幾種方法用于解決乳化問題。最常用的方法是萃取前就加入破乳劑來減輕或避免乳化現(xiàn)象，另一種就是用高速離心機進行兩相分離。傳統(tǒng)使用的破乳劑主要有二種：一種是陽離子表面活性劑溴代十五烷基吡啶（PPB）和十二烷基三甲基溴化銨［3］；另一種是陰離子表面活性劑溴化十六烷基吡啶（CPB）或十二烷基硫酸鈉（SDS）。這些破乳劑根據(jù)發(fā)酵液的性質(zhì)不同，破乳效果也不盡相同，破乳劑的價格較昂貴，且本身有一定毒性，排放含有破乳劑的廢液會污染環(huán)境［4］。

近年來，一些抗生素生產(chǎn)企業(yè)正在尋找毒性低、價格較低廉的新型破乳劑，取得了一定的成效［5］。

還有一些抗生素生產(chǎn)企業(yè)與專業(yè)的萃取劑制造商合作，設(shè)計生產(chǎn)出專門用于某種抗生素提取的新型萃取劑，既避免使用破乳劑，又方便回收利用［6］。

高速離心萃取機的使用可謂“歷史悠久”，但有時并不能將油水兩相完全分開，耗能也十分巨大，而且操作人員的工作條件也相對較差。

針對發(fā)酵液中含有的蛋白質(zhì)等大分子物質(zhì)引起乳化的問題，越來越多的企業(yè)采用截留分子量為10 000的超濾膜濾除發(fā)酵液中的大分子蛋白質(zhì)，結(jié)果既克服了乳化現(xiàn)象，又提高了產(chǎn)品收率和質(zhì)量［2，4］。但是，超濾膜的一次性投資較大，運行一段時間后還會出現(xiàn)濃差極化和膜污染等問題。

去除發(fā)酵液中的蛋白質(zhì)等大分子物質(zhì)的另一條思路就是利用蛋白酶將蛋白質(zhì)大分子水解成氨基酸或肽類。國外有人用無花果朊酯酶、菠蘿朊酶及木瓜酶來破除青霉素、鏈霉素、紅霉素和四環(huán)素等提取過程中的乳化現(xiàn)象，而國內(nèi)在這方面的研究鮮有報道，本文即選用AS1.398中性蛋白酶對麥迪霉素提取時的嚴重乳化現(xiàn)象進行破乳試驗。

1　材料與方法

1.1材料AS1.398中性蛋白酶（5萬單位/g，山東龍元生物工程有限公司生產(chǎn)）；醋酸丁酯（工業(yè)級）；草酸（工業(yè)級）；燒堿（工業(yè)級和化學(xué)純）；磷酸二氫鈉（化學(xué)純）；活性碳（藥用級）；麥迪霉素發(fā)酵液，由本實驗室培養(yǎng)所得。

1.2方法

1.2.1加酶試驗麥迪霉素放罐發(fā)酵液中加入草酸攪拌、酸化至適當(dāng)pH后，用尼龍布袋懸吊過濾，濾液裝入1 000 mL燒杯中，用燒堿調(diào)至一定pH，置于水浴鍋中，維持恒定溫度，加入一定量的AS1.398中性蛋白酶，電動攪拌一段時間后，立即轉(zhuǎn)入分液漏斗中，加一定量醋酸丁酯，用燒堿調(diào)pH至8.8～9.0，充分振搖，靜置約15 h（過夜），分層，分去下層水相，溶媒層倒入量筒計量澄清醋酸丁酯的體積和總體積，然后將此溶媒層進行真空抽濾，得到的醋酸丁酯提取液用磷酸二氫鈉-草酸緩沖液抽提，抽提液（水相）經(jīng)活性碳脫色、過濾后，濾液用氫氧化鈉（C.P）調(diào)pH至7.0，結(jié)晶得到麥迪霉素濕粉，烘干后得成品。

1.2.2對照試驗放罐發(fā)酵液加草酸酸化、過濾后，所得濾液不加入AS1.398中性蛋白酶，直接用醋酸丁酯抽提，其余步驟同1.2.1。

1.2.3麥迪霉素發(fā)酵濾液和成品效價的測定采用生物檢定法。

表1　因素水平表

表2　酶反應(yīng)條件的正交試驗

2　結(jié)果與分析

2.1酶反應(yīng)條件的正交試驗采用正交試驗，考察發(fā)酵濾液中加入AS1.398中性蛋白酶水解蛋白質(zhì)時，影響酶反應(yīng)的酶加量（En）、溫度、pH和攪拌時間四個主要因素。表1為因素水平表。

正交試驗結(jié)果表明（見表2）：S3＞S2＞S1＞S4，可以看出，在試驗所考察的范圍內(nèi)，pH和溫度對AS1.398中性蛋白酶的作用影響較大，其次是酶加量和攪拌時間。同時表明：破乳效果最好的酶反應(yīng)條件為：A2B1C3D3，即酶加量0.15%，溫度37℃，pH7.0，攪拌時間90 min。

2.2最佳酶反應(yīng)條件的調(diào)整

2.2.1酶加量的調(diào)整從表2可以看出，M11與M3l相差0.16，而M2l與M11只相差0.08，說明當(dāng)酶加量（En）從0.05%提高到0.10%時，萃取時的乳化程度減輕較明顯，而酶加量再由0.10%繼續(xù)增加到0.15%時，乳化程度減輕不那么明顯。為了盡量降低成本，提高經(jīng)濟效益，使酶反應(yīng)的條件更適合于工業(yè)化生產(chǎn)，將上述酶反應(yīng)條件中的酶加量（En）調(diào)整為0.10%。

2.2.2酶反應(yīng)時間的調(diào)整酶反應(yīng)時，攪拌時間較長會使麥迪霉素發(fā)酵濾液中的單位損失增加。攪拌時間在30～60min，麥迪霉素單位損失不多（小于3.5%）；攪拌時間達到90min時，單位損失在50～80 U/mL（約4.5%～6.4%），見表3。為了縮短工業(yè)生產(chǎn)中的操作時間，盡量減少麥迪霉素單位損失，保證提取收率，將相對次要的攪拌時間調(diào)整為60min。

表3　攪拌時間對麥迪霉素單位的影響

注：溫度為37℃，pH 7.0。

2.2.3最佳酶反應(yīng)條件的驗證為了確認最佳酶反應(yīng)條件的有效性和可靠性，利用調(diào)整后的最佳酶反應(yīng)條件進行驗證試驗。結(jié)果證明，經(jīng)過調(diào)整后的最佳酶反應(yīng)條件，能保證穩(wěn)定地減輕麥迪霉素發(fā)酵濾液溶媒萃取時的絕大部分乳化現(xiàn)象，見表4。

表4　酶反應(yīng)條件的驗證試驗

2.2.4酶反應(yīng)對成品質(zhì)量、收率及成本的影響利用最佳酶反應(yīng)條件，比較加酶和不加酶兩種情況下麥迪霉素的提取收率、成品質(zhì)量和醋酸丁酯單耗。由表5可以看出，采用AS1.398中性蛋白酶后，提取收率和成品質(zhì)量基本不受影響，而醋酸丁醋單耗卻比不加酶時降低28%。

AS1.398中性蛋白酶的價格為15.5元/kg，按表5中的試驗數(shù)據(jù)計算，每批試驗的酶加量為2 g（2 L濾液），增加成本0.031元。每批活性產(chǎn)量平均為l.238 g，則單位活性成本增加0.0250元/g。

而使用中性蛋白酶后，需要通過真空抽濾或離心機離心破乳的乳化層的量很少，操作時間大大縮短，醋酸丁酯單耗下降8.8mL/g，即每克成品醋酸丁酯用量下降7.766 g。其價格按5.10元/kg計，則單位成本降低0.0396元/g。所以，使用中性蛋白酶后，原材料成本實際降低0.0146元/g，折合每千克成品降低14.6元。

表5　加酶與不加酶的對照試驗

綜上所述，既能保證破乳效果，又能保證成品質(zhì)量、收率不受影響，而原材料成本卻降低的最佳酶反應(yīng)條件為：酶加量（En）0.10%，溫度37℃，pH7.0，攪拌時間60 min。

3　討論

1）在麥迪霉素發(fā)酵濾液中加入AS1.398中性蛋白酶保溫水解一段時間，可大大減輕醋酸丁酯在萃取時的乳化現(xiàn)象，成品質(zhì)量和收率不受影響。

2）由于乳化程度大幅度減輕，萃取所得溶媒相的絕大部分為澄清溶媒，可不經(jīng)過離心機離心（小試驗則不需要抽濾）而直接分離出來，剩下的乳化液量少，需用離心機離心破乳的時間短，可降低溶媒損耗，同時還大幅度節(jié)省了離心機破乳時的電力消耗，并且降低了操作人員的勞動強度，改善了環(huán)境。

3）互不相容的有機溶媒與水在一定強度的攪拌、振蕩或混合操作下均能產(chǎn)生乳化現(xiàn)象，但是，只要沒有乳化液穩(wěn)定劑的存在，乳化液就不會穩(wěn)定，靜置一段時間就會重新分離成界面清晰的油、水兩相。在抗生素發(fā)酵培養(yǎng)過程中，由于培養(yǎng)基中所含大量蛋白質(zhì)未被微生物徹底代謝利用，微生物在培養(yǎng)過程中還會合成各種蛋白質(zhì)類代謝產(chǎn)物，在溶媒萃取之前若未被去除，就將成為乳化液的穩(wěn)定劑。

乳化液的穩(wěn)定性與穩(wěn)定劑的分子大小有關(guān)。Sandra Lennie等曾報道，出芽短柄霉（Aureobasidium pullulans）發(fā)酵液經(jīng)過離心去除菌絲后的澄清濾液用醋酸丁酯等三種溶媒萃取時形成穩(wěn)定的乳化液。當(dāng)發(fā)酵液用截留分子量為10 000的超濾膜過濾后，超濾液的乳化穩(wěn)定性僅比蒸餾水稍微強一些。由此推斷，使乳化液穩(wěn)定化的是發(fā)酵液中的大分子，而這些大分子可能就是蛋白質(zhì)［1］。

4）AS1.398中性蛋白酶是一種枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）產(chǎn)生的蛋白酶，能在中性pH條件下作用于蛋白質(zhì)的肽鍵，將蛋白質(zhì)水解成多肽和氨基酸［7-9］。這種酶對于被作用的肽健的兩端沒有嚴格的要求，只要求組成肽鍵的氨基端有一個疏水基團。因此，能水解具有這種結(jié)構(gòu)的所有蛋白質(zhì)。而對于不含這種肽鍵結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)就不能起水解作用。根據(jù)抗生素發(fā)酵所使用的氮源的不同，以及微生物對這些氮源的分解代謝和合成情況的差異，放罐發(fā)酵液中殘留的蛋白質(zhì)種類和數(shù)量也不相同，AS1.398中性蛋白酶的水解效果就不同。另外，這種酶對于非蛋白質(zhì)因素所引起的乳化現(xiàn)象不能起破乳作用，所以，在應(yīng)用時，尚有少量乳化層。

［1］Sandra Lennie,Peter JHalling,George Bell.Causes of Emulsion Formation during Solvent Extraction of Fermentation Broths and its Reduction by Surfactants［J］.Biotechnology and Bioengineering,1990,35：948-950.

［2］馮建立,許振良,王學(xué)軍,等.超濾去除紅霉素發(fā)酵液乳化現(xiàn)象的研究［J］.中國抗生素雜志,2007,32（3）：150-153.

［3］楊智發(fā),于淑秋,陳家鏞,等.從發(fā)酵液中萃取青霉素時用陰、陽離子表面活性劑作破乳劑的研究I：陽離子表面活性劑［J］.化工冶金,1992,13（4）：302-307.

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［5］李伯良,孫建敏,戴焰明.新型高效破乳劑在紅霉素萃取中的應(yīng)用研究［J］.醫(yī)藥工程設(shè)計雜志,2005,26（1）：10-12.

［6］胡麥霞,文美樂,鄭飛,等.新型萃取劑在紅霉素提煉中應(yīng)用研究［J］.醫(yī)藥工程設(shè)計雜志,2005,26（4）：7-8.

［7］許波,黃遵錫,陳金全,等.枯草芽孢桿菌AS1.398中性蛋白酶基因的克隆及其在畢赤酵母中的高效表達［J］.云南師范大學(xué)學(xué)報：自然科學(xué)版,2005,25（3）：51-56.

［8］M cConn JD,Tsuru D,Yasunobu D T.Bacillus subtilis neutral proteinaseⅠ：A zinc enzyme of highspecific activity［J］.J Biol Chem,1964,239：3706-3715.

［9］馮培剛,張莉莉,王恬.枯草桿菌1398中性蛋白酶一些性質(zhì)的研究［C］//劉建新.中國畜牧獸醫(yī)學(xué)會動物營養(yǎng)學(xué)分會第十次學(xué)術(shù)研討會論文集（杭州）.北京：中國農(nóng)業(yè)科學(xué)技術(shù)出版社,2008.

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Em ulsion breaking during solvent extraction process ofm edicam ycin using a neutral protease

Lan Canhua1，2Wu Feifei1Zheng Danmei1Huang Lin1
（1.College of Life Sciences，F(xiàn)ujian Normal University，F(xiàn)uzhou 350117；2.Engineering Research Center of IndustrialMicrobiology，Ministry of Education，F(xiàn)ujian Normal University，F(xiàn)uzhou 350117）

A method for greatly reducing butyl acetate（BA）emulsification in the solvent extraction process of medicamycin using AS1.398 neutral proteasewas developed.The optimum enzymatic reaction conditionswere obtained by employing an orthogonal experiment：enzyme dosage（En）0.1%，temperature 37℃，pH7.0，reaction time 60 min.With the optimum conditions，BA emulsification was reduced by 84%.The product quality and yield ofmedicamycin were not affected by this demulsification method，and the solvent loss was reduced by 28%.Furthermore，theworking conditions of solventextraction was improved，and a purpose of energy saving and environmental protection was achieved.

AS1.398 neutral protease medicamycin solventextraction demulsification

A

1003-4331（2016）03-0020-04

福建師范大學(xué)卓越人才培養(yǎng)計劃（zy201403007）項目資助。