牛整合素β1亞基在COS-7細胞中的真核表達

李敏湘　漳州衛(wèi)生職業(yè)學院漳州363000

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牛整合素β1亞基在COS-7細胞中的真核表達

李敏湘漳州衛(wèi)生職業(yè)學院漳州363000

整合素是由18種α亞基和8種β亞基在細胞表面形成的異型二聚體。研究發(fā)現(xiàn)，整合素β1亞基是粘附分子家族主要成員，對多種細胞的存活、擴增、遷移有重要作用。本研究通過設計針對牛整合素β1亞基的特異性引物，將其克隆到真核表達載體pEYFP-C1上，構(gòu)建pEYFP-C1-β1重組表達質(zhì)粒，經(jīng)PCR和酶切鑒定符合試驗預期的陽性重組質(zhì)粒與脂質(zhì)體按照1：1.5比例共轉(zhuǎn)染COS-7細胞，48 h后可見陽性重組質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染COS-7細胞出現(xiàn)熒光信號。結(jié)果表明，本研究成功構(gòu)建出具有生物學活性的牛整合素β1亞基，為研究牛整合素β1亞基的生物學功能奠定基礎。

牛整合素β1亞基真核表達鑒定

整合素是細胞粘附分子家族中的一員，該家族的粘附分子主要介導細胞與細胞外基質(zhì)（如纖連蛋白、纖維蛋白原、膠原蛋白等）的粘附。研究發(fā)現(xiàn)，整合素家族受體不僅存在于人類，亦存在于其他脊椎動物中。整合素廣泛分布于各種組織，在纖維母細胞、上皮細胞、內(nèi)皮細胞、肝細胞、角質(zhì)細胞、白細胞及血小板均有表達［1-3］。

整合素是由18種α亞基和8種β亞基在細胞表面形成的異型二聚體，可以形成24種整合素。研究發(fā)現(xiàn)，按照β亞基的不同可將其分為8個亞組：β1～β8亞基。整合素β1與細胞增殖與分化、細胞間信號轉(zhuǎn)導、血管的發(fā)生以及腫瘤的發(fā)生等生物學功能相關［4-6］。本研究針對牛整合素β1基因序列設計特異性引物，并在上下游引入Xho I和BamH I酶切位點，將其克隆到真核表達載體pEYFP-C1構(gòu)建真核表達重組質(zhì)粒，與脂質(zhì)體共轉(zhuǎn)染COS-7細胞，發(fā)現(xiàn)其有較好的生物學活性，可為進一步研究牛整合素β1基因的生物學功能奠定基礎。

1　材料與方法

1.1試劑和載體Trizol購自Invitrogen公司；PCR擴增酶、T4 DNA Ligase購自Takara公司；細胞培養(yǎng)嵌套（cell culture inserts），0.4μm孔徑，購自Nunc公司；DNA瓊脂糖膠回收試劑盒購自天根生物公司；質(zhì)粒提取試劑盒購自博大泰克生物公司；真核表達載體pEYFP-C1購自優(yōu)寶生物公司。

1.2pEYFP-C1-β1的擴增

1.2.1引物設計參照牛整合素β1基因（GenBank登錄號AF468058）［7］序列設計特異性引物，并在上下游引物5'-端分別引入Xho I和BamH I酶切位點，預期擴增片段為2 400 bp左右。具體引物序列如下：β1-F：5'-CTTCTCGAGATGAATTTGCAACTGATA-3'；β1-R：5'-TTAGGATCCTTTTCCCTCATATTTC -3'。所有引物均由上海生工生物工程有限公司合成。

1.2.2核酸提取和cDNA的制備收集牛氣管組織，按照常規(guī)方法研磨后，4 000 r/min離心15 min。按照Trizol試劑盒說明書提取RNA。將提取的組織RNA按照反轉(zhuǎn)錄體系說明書反轉(zhuǎn)錄成cDNA，簡要步驟為在無菌EP管中加入：總RNA 5μL、Oligo（dT）18 3μL、DEPC水3μL，輕輕混勻，70℃、5min后置于冰上冷卻2min。在上述體系中再加入5×逆轉(zhuǎn)錄酶緩沖液4μL、10 mM dNTP混合物2μL、RNA酶抑制劑0.5μL（20 U）、DEPC水4μL，將反應體系輕輕混勻，37℃水浴5 min，然后加入1μL（200 U）逆轉(zhuǎn)錄酶，42℃水浴60min。70℃熱激10min，冰上冷卻后于-20℃保存，即為本研究PCR擴增的模板cDNA。

1.2.3PCR擴增按照說明書PCR擴增體系配置反應液，將反應體系輕輕混勻進行PCR反應。反應程序：95℃、5 min；95℃、55 s；50℃、45 s；72℃、150 s，35個循環(huán)后72℃延伸10min，經(jīng)常規(guī)瓊脂糖（1.0%）電泳檢測PCR擴增產(chǎn)物。

1.3pEYFP-C1-β1重組表達質(zhì)粒的構(gòu)建將真核表達載體質(zhì)粒pEYFP-C1和含有整合素β1基因的PCR產(chǎn)物經(jīng)Xho I和BamH I進行雙酶切，37℃反應4 h。將酶切產(chǎn)物電泳后膠回收特異性目的片段。使用T4 DNA連接酶進行連接，16℃連接過夜，轉(zhuǎn)化感受態(tài)細胞后涂布平板，按照常規(guī)方法挑取單菌落，經(jīng)PCR鑒定、酶切鑒定和序列測定篩選陽性質(zhì)粒pEYFP-C1-β1。

1.4轉(zhuǎn)染試驗將獲得的陽性重組質(zhì)粒pEYFPC1-β1使用無血清、無抗生素DMEM培養(yǎng)基稀釋后，加入1μL脂質(zhì)體，混合后室溫孵育30 min，共轉(zhuǎn)染小心加入處于對數(shù)生長期的COS-7細胞，轉(zhuǎn)染6 h后，將細胞上清換成含血清的DMEM培養(yǎng)基。轉(zhuǎn)染48 h后觀察熒光強度，確定細胞轉(zhuǎn)染效率。

2　結(jié)果

2.1牛整合素β1基因的PCR擴增利用本研究設計的特異性引物對制備的cDNA進行PCR擴增，獲得預期大小的目的片段，大小約為2 400 bp，見圖1。

2.2pEYFP-C1-β1重組表達質(zhì)粒的鑒定利用獲得的陽性重組質(zhì)粒pEYFP-C1-β1，經(jīng)PCR鑒定、Xho I和BamH I雙酶切鑒定，獲得的陽性重組質(zhì)粒pEYFP-C1-β1符合試驗預期。基因測序結(jié)果顯示，重組質(zhì)粒插入序列完全正確（見圖2-圖3）。

2.3pEYFP-C1-β1重組表達質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染效果鑒定pEYFP-C1-β1重組表達質(zhì)粒和脂質(zhì)體（Lipofectamine 2000）共轉(zhuǎn)染后的COS-7細胞，經(jīng)過48 h后可見明顯熒光強度，表明獲得的pEYFP-C1-β1重組表達質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染COS-7細胞后可獲得有效表達。

3　討論

人類整合素β1根據(jù)胞漿內(nèi)結(jié)構(gòu)域分為5個亞型：β1A、β1B、β1C-1、β1C-2和β1D。研究發(fā)現(xiàn)，β1A可在除骨組織和心肌組織外的所有組織表達，而β1D則僅在骨組織和心肌組織表達。研究還發(fā)現(xiàn)，角質(zhì)細胞和生殖細胞遷移高度依賴整合素β1，但肌細胞、神經(jīng)細胞和淋巴細胞在缺乏整合素β1也可正常遷移。此外，研究發(fā)現(xiàn)整合素β1調(diào)控不同的信號通路和基因表達，體內(nèi)缺失整合素β1可降低ErK、FAK的活性和Fgfr-3的表達活性［8-9］。前期的研究發(fā)現(xiàn)，牛口蹄疫病毒有4種整合素受體，更深入的研究并不多［10］。

本研究通過擴增獲得牛整合素β1基因并將其克隆到真核表達載體pEYFP-C1，獲得陽性重組真核表達質(zhì)粒pEYFP-C1-β1。利用PCR鑒定、雙酶切鑒定符合試驗預期的pEYFP-C1-β1重組真核表達質(zhì)粒和脂質(zhì)體共轉(zhuǎn)染對數(shù)生長期COS-7細胞，結(jié)果可見有明顯的熒光信號，表明本研究成功構(gòu)建牛整合素β1基因的真核表達載體，且在COS-7細胞中驗證具有良好的生物學活性，為進一步開發(fā)針對牛整合素β1基因的生物學功能研究以及該基因在牛疫病中的生物學功能奠定研究基礎。

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Eukaryote expression of the bovine integrinβ1 gene in COS-7 cells

LiMinxiang
（Zhangzhou Health Vocational College，Zhangzhou 363000）

The integrin is formed by 18 kinds of alpha subunit and 8 kinds of beta subunit on the cell surface.Integrin betaβ1 gene is a majormember of the adhesion molecule family，and plays an important role in cells amplification，m igration and survival.In this study，specific primers targeting at the bovine integrinβ1 gene were used to amplify the gene and then cloned the eukaryote expression vector pEYFP-C1 to construct for recombinant plasmids pEYFP-C1-β1，which was identified by PCR methods and enzyme digestion.Then the positive plasmids and liposome were co-transfection into COS-7 cells，after 48 h excellent fluorescent signals can be observed at COS-7 cells.All the results demonstrated that eukaryote expression of the bovine integrinβ1 gene in COS-7 cells were successed with good biological activity，which lays good foundation for the research of bovine integrinβ1 gene biological activity.

Bovine integrinβ1 gene Eukaryote expression Identified

A

1003-4331（2016）03-0007-03

李敏湘（1983-），助教，碩士，主要從事微生物與生化藥學研究。E-mail：mxli0922@163.com。