13C-呼氣診斷試劑甘氨酸[1-13C]的合成研究

邱　俊，李虎林， 姜永悅

(上海穩(wěn)定性同位素工程技術(shù)研究中心，上海化工研究院，上海　200062)

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13C-呼氣診斷試劑甘氨酸[1-13C]的合成研究

邱俊，李虎林， 姜永悅

(上海穩(wěn)定性同位素工程技術(shù)研究中心，上海化工研究院，上海200062)

該合成方法以乙酸[1-13C]為原料，經(jīng)過Hell-Volhard-Zelinski反應(yīng)和乙醇酯化得到2-溴乙酸乙酯[1-13C]，接著經(jīng)過Gabriel反應(yīng)得到N-乙酸乙酯鄰苯二甲酰亞胺[1-13C]，然后再與肼解和鹽酸水解得到13C-呼氣試驗(yàn)診斷試劑甘氨酸[1-13C]。同時還探索了關(guān)鍵中間體乙酸乙酯[1-13C]合成工藝，考察了溫度、紅磷用量和縛酸劑等主要因素，得到了最優(yōu)合成工藝，使得最終產(chǎn)物甘氨酸[1-13C]總收率為58.4%，化學(xué)純度高于98%以上，13C原子豐度高于98%。

13C-呼氣試驗(yàn)；甘氨酸[1-13C]；Hell-Volhard-Zelinski反應(yīng)；Gabriel 反應(yīng)；合成工藝

目前13C-呼氣試驗(yàn)已經(jīng)較廣泛地應(yīng)用于消化不良等疾病的胃動力測定、胃動力藥物的療效觀察、延緩胃排空藥物不良反應(yīng)的監(jiān)測，以及胃部手術(shù)后的胃動力恢復(fù)情況評價[1]。同時也逐漸地應(yīng)用于糖尿病胃輕癱患者胃動力檢測，合理地指導(dǎo)口服降糖藥物的用量。以及特護(hù)患者及嬰兒的胃動力檢測，指導(dǎo)口服營養(yǎng)或胃管營養(yǎng)，這樣可以減少特護(hù)時間，有效地避免膿毒敗血癥休克的發(fā)生[2]。

甘氨酸[1-13C]作為一種13C-呼氣試驗(yàn)診斷試劑，在胃內(nèi)不會分解吸收，以原型進(jìn)入十二指腸后迅速被吸收并經(jīng)肝臟代謝為13CO2排出，可作為檢測胃對食物排空的示蹤劑。因此，13C-甘氨酸呼氣試驗(yàn)?zāi)壳坝糜谝后w食物的胃排空速率的測定[3]。其優(yōu)勢在于穩(wěn)定同位素碳13標(biāo)記甘氨酸無放射性，可在短期內(nèi)進(jìn)行重復(fù)的檢測；此外還具有操作簡便，試驗(yàn)的靈敏度高、特異性好、重現(xiàn)性好等優(yōu)點(diǎn)。因此甘氨酸[1-13C]在臨床檢測液體食物胃排空速率的應(yīng)用中具有良好的發(fā)展前景[4-9]。

目前文獻(xiàn)報道合成甘氨酸[1-13C]的方法主要是利用13C-甲基鎂碳酸酯和硝基甲烷反應(yīng)得到2-硝基乙酸[1-13C]，再經(jīng)過鈀/碳加氫還原得到甘氨酸[1-13C]，三步反應(yīng)總收率為39.4%[10]。而本工作旨在開發(fā)另外一種簡單高效的甘氨酸[1-13C]合成方法，主要采用乙酸[1-13C]為原料，先進(jìn)行溴素溴化，然后與乙醇酯化，再與鄰苯二甲酰胺鉀鹽反應(yīng)得到N-乙酸乙酯鄰苯二甲酰亞胺[1-13C]，然后進(jìn)行肼解和鹽酸水解得到目標(biāo)產(chǎn)物甘氨酸[1-13C]，該方法與文獻(xiàn)報道方法相比，具有原材料便宜，操作簡單，成本低，收率更高等特點(diǎn)。

1　實(shí)　驗(yàn)

1.1儀器與試劑

ARX400核磁共振儀，美國Bruker公司；WRS-1B數(shù)字熔點(diǎn)儀，上海精密科學(xué)儀器有限公司；Waters液相色譜儀，美國Waters公司；MAT271氣體同位素質(zhì)譜計，美國Finnigan公司；RE-52B旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海亞榮生化儀器廠。

乙酸[1-13C]：美國CIL公司，13C豐度98.5%；鄰苯二甲酰胺鉀鹽：自制；溴素、紅磷、水合肼：國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；其他試劑和溶劑均為市售AR級。

1.2合成路線

圖1　甘氨酸[1-13C]合成路線

1.3合成方法

1.3.1溴代乙酸乙酯[1-13C]的合成[11]

在100 mL三口燒瓶上，安裝球形冷凝管和溴化氫氣體吸收裝置(NaOH水溶液)，在反應(yīng)瓶中加入乙酸[1-13C] (3.05 g 50 mmol)、紅磷(0.81 g，25 mmol)，磁力攪拌下油浴升溫至118 ℃，待穩(wěn)定后緩慢滴加溴素(5.25 mL，100 mmol)，滴完后保溫反應(yīng)，待紅棕色褪去，顏色變成淡黃色后移去油浴，冷卻至室溫，加入50 mL乙酸乙酯，在5 ℃以下攪拌，分批緩慢加入三聚磷酸鈉(9.2 g，25 mmol)，加入完畢，在常溫攪拌15 min，再將無水乙醇(3.45 g，75 mmol)置于恒壓滴液漏斗中緩慢滴加，控制反應(yīng)溫度為室溫，反應(yīng)時間5 h，反應(yīng)完成后過濾，濾液用飽和Na2CO3溶液洗滌至中性，二氯甲烷萃取水溶液。合并有機(jī)相用無水Na2SO4干燥過夜，過濾，濃縮蒸掉有機(jī)溶劑，得到亮黃色油狀液體溴代乙酸乙酯[1-13C]，產(chǎn)率為88.3%。1H-NMR (400 MHz, CDCl3, ppm): δ 4.24(q,J=7.6 Hz, 2H,-O-CH2), 3.82(s, 2H, Br-CH2-), 1.31(t,J=7.2 Hz, 3H,-CH3); IR值 (KBr, cm-1): 2963, 2861, 1741, 1465, 1170, 721。

1.3.2N-乙酸乙酯鄰苯二甲酰亞胺[1-13C]的合成

在100 mL三口瓶中，加入4.18 g(25 mmol)溴代乙酸乙酯[1-13C]和25 mL DMF，然后再加入鄰苯二甲酰亞胺鉀鹽4.55 g (25 mmol)，室溫下攪拌12 h，反應(yīng)液倒入500 mL冰水中，有固體析出，過濾，濾餅用水洗(3×20 mL)，固體在60 ℃真空干燥箱中烘6 h，得到5.17 g N-乙酸乙酯鄰苯二甲酰亞胺[1-13C]白色固體產(chǎn)品，反應(yīng)產(chǎn)率為84.1%。m.p.110～111 ℃；1H-NMR (400 MHz, CDCl3, ppm)) δ: 7.82～7.90 (m, 2 H), 7.72～7.77 (m, 2 H), 4.56 (s, 2H-N-CH2-C=O), 4.23 (q,J=7.2 Hz, 2H,-O-CH2), 1.30(t,J=7.2 Hz, 3H,-CH3); IR值 (KBr, cm-1): 3011, 2832, 1737, 1480, 1405, 1329, 1216, 705。

1.3.3甘氨酸[1-13C]的合成[12]

在100 mL三口瓶中，加入3.51 g (15 mmol) N-乙酸乙酯鄰苯二甲酰亞胺[1-13C]、60 mL甲醇和30 mmol 85%的水合肼，反應(yīng)加熱回流，攪拌2 h，反應(yīng)液冷卻至室溫，反應(yīng)中有固體析出，過濾，濾餅用甲醇洗(3×20 mL)，濾液蒸干得淡黃色固體，再加入50 mL鹽酸(6 N)，反應(yīng)加熱回流，攪拌2 h后，冷卻到0 ℃，過濾除去析出物，減壓蒸去鹽酸水溶液，以2 mol/L NaOH水溶液中和至中性，在0 ℃放置過夜，析出的白色結(jié)晶固體，過濾，固體在60 ℃真空干燥箱中烘6 h，得甘氨酸[1-13C]純品78.6%，液相色譜分析純度：98.7%，同位素質(zhì)譜分析13C原子豐度為98.1%。m.p. 232～234 ℃;1H-NMR (400 MHz, D2O, ppm) δ: 3.76 (s, 2 H, N-CH2-);13C-NMR (100 MHz, D2O, ppm) δ: 173.3(-CO-), 43.4(N-CH2-); IR值 (KBr, cm-1): 3106, 2605, 2172, 1597, 1395, 1333, 929, 685; M/z: 77.3 (M+H)+。

2　結(jié)果與討論

2.1反應(yīng)溫度對溴代乙酸乙酯[1-13C]產(chǎn)率的影響

首先利用乙酸[1-13C]與溴素通過Hell-Volhard-Zelinski反應(yīng)得到活性高的溴代乙酰溴[1-13C]中間體，然后中間體再與乙醇酯化得到溴代乙酸乙酯[1-13C]，第二步反應(yīng)常溫下反應(yīng)速率快，不易有副產(chǎn)物生成，在這里不做溫度考察。因此主要考察第一步反應(yīng)溫度對溴代乙酰溴[1-13C]產(chǎn)率的影響，產(chǎn)物溴代乙酸乙酯[1-13C]反應(yīng)收率利用HPLC峰面積計算。

選取溴化反應(yīng)溫度為80 ℃、90 ℃、100 ℃、110 ℃、118 ℃(乙酸沸點(diǎn))。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表1所示。

表1　溫度對溴化反應(yīng)的影響aTable 1　The effects of temperature on brominationa

a乙酸(50 mmol)、紅磷(25 mmol)、溴素(100 mmol)、無水乙醇(75 mmol)、三乙胺(25 mmol)。

從表1數(shù)據(jù)可以看出，在100～118 ℃范圍內(nèi)，溫度的升高，溴代乙酸乙酯產(chǎn)率迅速提高。當(dāng)溫度達(dá)到118 ℃時，乙酸回流狀態(tài)下，產(chǎn)率達(dá)到最高。因此118 ℃乙酸回流為最優(yōu)反應(yīng)溫度條件。

2.2紅磷用量對溴代乙酸乙酯產(chǎn)率的影響

眾所周知，Hell-Volhard-Zelinski反應(yīng)最為常用的催化劑為三溴化磷，然而三溴化磷的蒸氣與液體都具有強(qiáng)烈刺激性和腐蝕性，不易稱取和操作。故參考文獻(xiàn)報道方法[11]，選用性質(zhì)穩(wěn)定且相對便宜的紅磷與溴素代替三溴化磷。實(shí)驗(yàn)證明，磷與溴素代替三溴化磷催化反應(yīng)的效果相似。因此考察紅磷的投入量對反應(yīng)收率的影響，按照乙酸(3.0 g, 50 mmol)，當(dāng)量取紅磷的投入量為0.2 equiv(0.32 g)、0.3 equiv(0.48 g)、0.4 equiv(0.65 g)、0.5 equiv(0.80 g)、0.6 equiv(0.96 g)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表2所示。

表2　紅磷用量對溴化反應(yīng)的影響aTable 2　The effects of phosphorus dosage on brominationa

a乙酸(50 mmol)、溴素(100 mmol)、無水乙醇(75 mmol)、三乙胺 (25 mmol)，118 ℃反應(yīng)。

從表2中可以看出，紅磷用量摩爾比從0.2 equiv逐步增加到0.5 equiv時，產(chǎn)率隨之增加，當(dāng)摩爾比為0.5 equiv時，產(chǎn)率達(dá)到最高82.6%。同時當(dāng)紅磷用量超過0.5 equiv時，對產(chǎn)品收率影響不明顯。因此選擇催化劑紅磷用量摩爾比為0.5 equiv (0.8 g)。

2.3縛酸劑對溴代乙酸乙酯產(chǎn)率的影響

在溴代乙酰溴中間體與乙醇進(jìn)行酯化反應(yīng)中，需要加入堿作為縛酸劑中和反應(yīng)中生成的溴化氫氣體，使得酯化反應(yīng)更完全。本論文將考察各種縛酸劑對酯化反應(yīng)收率的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表3所示。

表3　縛酸劑對酯化反應(yīng)的影響aTable 3　The effects of acid-accepters on brominationa

a乙酸(50 mmol)、紅磷(25 mmol)、溴素(100 mmol)，無水乙醇(75 mmol)、縛酸劑(25 mmol)，118 ℃反應(yīng)。

從表3中可以看出，縛酸劑對酯化反應(yīng)的影響比較大，不加縛酸劑反應(yīng)產(chǎn)率相對較低，加入有機(jī)堿三乙胺和吡啶作為縛酸劑，雖然能得到較好的收率，但是存在后處理分離困難等缺點(diǎn)。當(dāng)加入無機(jī)堿碳酸鈉作為縛酸劑，產(chǎn)率反而相對較低，而利用三聚磷酸鈉作為縛酸劑，產(chǎn)率則達(dá)到最高產(chǎn)率88.3%。根據(jù)機(jī)理上分析1 mol三聚磷酸鈉吸附2 mol溴化氫，產(chǎn)物仍顯堿性，反應(yīng)依然能在堿性環(huán)境下進(jìn)行，因此產(chǎn)率最高。因此選擇無機(jī)堿三聚磷酸鈉作為縛酸劑

2.4溴代乙酸乙酯[1-13C]最優(yōu)合成工藝

綜上所述，由乙酸[1-13C]為起始原料合成溴乙酸乙酯[1-13C]的優(yōu)化條件為：乙酸[1-13C] (3.05 g, 50 mmol)，紅磷(0.80 g, 0.5 equiv)，反應(yīng)溫度為118 ℃，溴素(5.25 mL, 100 mmol)，三聚磷酸鈉(9.2 g, 25 mmol)為縛酸劑，無水乙醇(3.45 g, 75 mmol)，常溫反應(yīng)5 h，結(jié)束反應(yīng)。在此最優(yōu)條件下進(jìn)行5次平行驗(yàn)證，考察反應(yīng)重現(xiàn)性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表4所示。

從表4可以看出，同樣條件下的5次平行試驗(yàn)結(jié)果波動較小，目標(biāo)產(chǎn)品溴乙酸乙酯[1-13C]的產(chǎn)率比較穩(wěn)定。該優(yōu)化反應(yīng)條件其重現(xiàn)性和可靠性均較高。

3　結(jié)　論

(1)以乙酸[1-13C]為原料，先后經(jīng)過Hell-Volhard-Zelinski反應(yīng)、Gabriel反應(yīng)和肼解等三步反應(yīng)制備得到目標(biāo)產(chǎn)物甘氨酸[1-13C]，總收率為58.4%。

(2) 探索了關(guān)鍵中間體溴乙酸乙酯[1-13C]合成工藝，考察了溫度、紅磷用量和縛酸劑等主要因素，得到了最優(yōu)合成工藝條件，5次平行試驗(yàn)結(jié)果顯示該優(yōu)化工藝具有重現(xiàn)性和穩(wěn)定性。

(3) 甘氨酸[1-13C]經(jīng)過熔點(diǎn)、LC、MS和IR檢測，確認(rèn)產(chǎn)品化學(xué)結(jié)構(gòu)，化學(xué)純度高于98%，13C原子豐度高于98%，13C同位素稀釋效應(yīng)小于0.5%。

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A Synthetic Method of the Diagnostic Reagent of13C-Glycine Breath Test

QIU Jun, LI Hu-lin, JIANG Yong-yue

(Shanghai Engineering Research Center of Stable Isotope, Shanghai Research Instituteofchemicalindustry,Shanghai200062,China)

The acetic acid [1-13C] was used as raw material to generate ethyl bromoacetate [1-13C] by Hell-Volhard-Zelinski reaction and esterification reaction. Subsequently, N-phthaloyl glycine ethyl ester[1-13C] was obtained from ethyl bromoacetate[1-13C] by Gabriel reaction, then reacted with hydrazine hydrate to produce the diagnostic reagent glycine[1-13C]. The influences of parameters, such as temperature, the mole ratio red phosphorus to acetic acid [1-13C], acid-accepters on the yield of products, were investigated, and the optimized conditions were obtained. The yield of glycine[1-13C] was above 58.4%, the purity≥98%, the abundance of 13C≥98%.

13C-breath test; glycine[1-13C]; Hell-Volhard-Zelinski reaction; Gabriel reaction; synthesis technology

邱俊(1984-)，男，博士，工程師，主要從事同位素標(biāo)記藥物研發(fā)。

O628.2+1

A

1001-9677(2016)013-0084-03