丹酚酸B對糖尿病大鼠角膜的保護作用及其機制

吳升輝，王燕鳳，張曉琴，黃真真，林　毅，黃　焱，鄭衛東

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·實驗論著·

丹酚酸B對糖尿病大鼠角膜的保護作用及其機制

吳升輝，王燕鳳，張曉琴，黃真真，林毅，黃焱，鄭衛東

Foundation items:Provincial Natural Science Foundation of Fujian (No.2016J01155); College Students’ Innovative Experiment of Fujian Medical University (No.20141039207)

Department of Optometry, Medical Technology and Engineering Institute,Fujian Medical University, Fuzhou 350000, Fujian Province, China

Correspondence to:Yan Huang. Department of Optometry, Medical Technology and Engineering Institute, Fujian Medical University, Fuzhou 350000, Fujian Province, China. 13960888823@139.com

Abstract

?AIM: To explore the protective effects of Salvianolic acid B resistance to oxidative stress on cornea in diabetic rats.

?METHODS: Twenty-five Sprague-Dawley male rats were taken as experimental subjects. Random 5 of them were used as control group. The remaining 20 were induced to be diabetic mellitus by a single intraperitoneal injection of streptozotocin (STZ) and divided into 4 groups randomly: diabetes control group, 0.01% Salvianolic acid B treated group, 0.05% Salvianolic acid B treated group and 0.1% Salvianolic acid B treated group. In the Salvianolic acid B treated groups, the corresponding concentration of Salvianolic acid B eye drops were used 3 times a day until the animal was sacrificed, and then detected rats blood glucose and body weight, observed sensation and transparency of the cornea once a week. After the building completion, all rats in each group were sacrificed in 12ndwk, and then observed the corneal tissue structure change, and in rat serum and tissue of malondialdehyde (MDA) content and activity of superoxide dismutase (SOD).

?RESULTS: The blood glucose of all rats was in high level (>16.7mmol/L), early rise and later fall in weight. In the diabetic control group, the corneal sensation and transparency of the cornea were decreased. The content of MDA in the corneal tissue was significantly increased. The activity of SOD in the corneal tissue was significantly decreased (P<0.05). Through the course of disease, the above change was obvious day by day. Compared with the diabetic control group, the sensation and transparency of the cornea were improved significantly. The content of MDA in the corneal tissue was significantly decreased. The activity of SOD in the corneal tissue was significantly increased (P<0.01).

?CONCLUSION: Salvianolic acid B can reduce the corneal lesions of diabetic rats, the mechanism may be related to Salvianolic acid B, remove superoxide anion, protect cells from damage of resisting oxidative stress.

目的：探究丹酚酸B抗氧化應激對糖尿病大鼠角膜的保護作用。

方法：健康雄性SD大鼠25只，隨機選取5只作為正常對照組；其余20只采用一次性腹腔注射鏈脲佐菌素(STZ，60mg/kg)誘導糖尿病大鼠模型，建模成功(血糖>16.7mmol/L)后應用隨機數字表法分為糖尿病對照組、0.01%丹酚酸B凝膠治療組、0.05%丹酚酸B凝膠治療組、0.1%丹酚酸B凝膠治療組，丹酚酸B治療組和糖尿病對照組每天分別給予自制相應濃度的丹酚酸B凝膠及空白凝膠點眼，每次1滴，每日3次；檢測大鼠的血糖和體質量，觀察角膜知覺和透明度，每周1次；造模成功后的第12wk取材，觀察角膜組織結構改變，以及大鼠眼組織中丙二醛(MDA)含量及超氧化物歧化酶(SOD)活性情況。

結果：所有大鼠血糖處在高水平(>16.7mmol/L)，體質量早期上升后期有明顯下降。在糖尿病對照組，角膜的知覺和透明度降低，各丹酚酸B凝膠治療組與糖尿病對照組相比較，角膜知覺明顯改善，各丹酚酸B治療組角膜保持透明度與正常組無明顯差異，角膜組織中的MDA含量明顯減少，角膜組織中SOD的活性明顯增加(P<0.05)。

結論：丹酚酸B可以減緩糖尿病大鼠角膜病變，其機制可能與丹酚酸B能清除超氧陰離子的抗氧化應激作用有關。

丹酚酸B；糖尿病；角膜；氧化應激；超氧化物歧化酶；丙二醛

引用：吳升輝，王燕鳳，張曉琴，等.丹酚酸B對糖尿病大鼠角膜的保護作用及其機制.國際眼科雜志2016;16(9):1629-1631

0引言

糖尿病是一種全身性疾病，糖尿病在眼部并發癥的研究主要集中于糖尿病視網膜病變和糖尿病白內障方面，對糖尿病角膜病變的研究偏少[1]。據報道，47%～64%糖尿病患者可能會出現原發性角膜病變，其臨床特征主要表現為角膜敏感性下降、上皮愈合延遲、神經營養性角膜潰瘍等癥狀。病理主要表現在上皮基底膜、上皮修復速度、角膜內皮和神經方面的異常，但其發病機制目前尚不很明確。丹酚酸B為丹參的主要有效成分，能清除氧自由基、抑制脂質過氧化反應，其作用強于維生素C、維生素E、甘露醇，是目前已知的抗氧化作用最強的天然產物之一。本實驗通過丹酚酸B凝膠作用于糖尿病模型眼，旨在探究丹酚酸B對糖尿病大鼠角膜的保護作用，研究其在糖尿病角膜組織病變發病機制中抗氧化應激的作用。

1材料和方法

1.1材料健康無眼疾的6周齡雄性大鼠25只，體質量200～250g，福建醫科大學動物實驗中心提供。數碼裂隙燈顯微鏡，721光柵分光光度計(福建醫科大學實驗室提供)。血糖儀(美國羅氏公司)；STZ(鏈脲佐菌素，美國Sigma公司)；丹酚酸B(南京澤朗公司)；BCA蛋白濃度測定試劑盒(北京鼎國昌盛公司)；丙二醛(MDA)及超氧化物歧化酶(SOD)測定試劑盒(南京建成公司)。

1.2方法

1.2.1動物分組所有大鼠眼部裂隙燈和檢眼鏡檢查屈光間質清晰，眼底無病變。適應性喂養7d后，隨機選取5只大鼠為正常對照組，剩余20只大鼠用于構建糖尿病模型，造模成功后隨機分為4組：糖尿病對照組(DM1)、0.01%丹酚酸B治療組(DM2)、0.05%丹酚酸B治療組(DM3)、0.1%丹酚酸B治療組(DM4)，每組各5只。丹酚酸B治療組和糖尿病對照組每天分別給予自制相應濃度的丹酚酸B凝膠及空白凝膠點眼，每日3次，每次1滴，每天同一時間給藥。

1.2.2丹酚酸B眼用凝膠的配制[2]眼用凝膠可促進藥物的吸收，延長藥物作用時間。配置檸檬酸鈉緩沖液使凝膠pH值與淚膜相似，取丹酚酸B和透明質酸鈉粉末分別配置：空白凝膠、0.01%丹酚酸B凝膠、0.05%丹酚酸B凝膠、0.1%丹酚酸B凝膠各10mL，每3d配一次防止緩沖系統變質，遮光、分裝、密閉、4℃冰箱中保存備用。

1.2.3 SD大鼠糖尿病模型的制作[3]SD大鼠普通飼養2wk后，再將大鼠禁食，自由飲水24h后，以0.1mmol/L，pH=4.4的枸椽酸緩沖液配制成20g/L STZ(美國Sigma公司)溶液，以55mg/kg的劑量腹腔注射鏈脲佐菌素(STZ)。72h后采尾靜脈血測血糖，若血糖>16.7mmol/L，多飲、多食、多尿為成功模型，可納入實驗。

1.2.4各組大鼠血糖及體質量測定、角膜功能學檢查利用羅氏血糖儀檢測大鼠的血糖，普通電子秤測量體質量，肉眼觀察角膜透明度。檢查角膜知覺[4]：將一塊消毒棉球搓成尖形條，用其尖端從眼的側面或下方輕觸角膜表面(所有大鼠均刺激相同部位)，如立即發生反射性瞬目運動，則為知覺正常；如反射遲鈍，即為知覺減退；如無任何反應，則為知覺反應消失。以上各項指標，每周測量1次。用裂隙燈檢查(每4wk)對照組和實驗組大鼠角膜的病變情況。

1.2.5各組大鼠角膜組織形態學檢查[5]造模成功后的第12wk利用脊髓脫臼法處死所有大鼠，隨機取一只眼球將其石蠟包埋、切片。將切片組織行蘇木精-伊紅染色，普通顯微鏡觀察。

1.2.6各組大鼠角膜MDA和SOD活性檢測[5]將另一只眼球角膜用預冷的生理鹽水洗去角膜表面的血跡，濾紙拭干，用電子分析天平稱重后，迅速用眼科小剪將角膜組織剪碎，放入1.5mL的離心管內，加入19倍體積的勻漿介質(0.01mol/L Tris，0.001mol/L EDTA-Na2，0.01mol/L蔗糖， 8g/L NaCl，pH7.4)，離心管放在冰盒內，用玻璃勻漿器轉動研磨數十次制備5%角膜組織勻漿，以3 000r/min(r=15cm)離心10min，取上清液，分別采用MDA和SOD檢測試劑盒測定MDA含量及SOD活性，用比色法測定各指標含量，蛋白質含量測定參照考馬斯亮藍法。

2結果

2.1各組大鼠血糖及體質量結果注射STZ前大鼠血糖水平均正常，糖尿病對照組和丹酚酸B各治療組在注射STZ后1wk至處死前血糖明顯升高(均>16.7mmol/L)，并保持相對穩定；各丹酚酸B治療組與糖尿病對照組相比，血糖無統計學差異(P<0.05)。正常對照組大鼠體質量隨飼養時間增長而增長。與正常對照組相比，糖尿病大鼠體質量增長速度較緩慢，在12wk時體質量明顯低于正常組(P<0.05)，各丹酚酸B治療組與糖尿病對照組相比，體質量無統計學差異(P>0.05)。糖尿病和各治療組大鼠體質量在1～7wk時也呈增長趨勢，在7wk時達最高峰(P<0.05)，第9wk時體質量開始減低(P<0.05)，在12wk時達最低(P<0.05，表1)。

2.2各組大鼠角膜知覺和透明度檢查糖尿病對照組大鼠自造模6wk起出現角膜知覺的減退，第10wk到12wk時角膜知覺減退明顯；丹酚酸B治療組第6wk時輕微的知覺減退，第12wk時角膜知覺減退情況較糖尿病對照組改善明顯，0.05%丹酚酸B組角膜知覺更敏感。裂隙燈檢查正常大鼠角膜始終保持透明，糖尿病對照組大鼠角膜早期透明，7wk后開始出現透明度下降，12wk輕度混濁，各丹酚酸B治療組角膜保持透明度與正常無明顯差異。

2.3各組大鼠角膜組織形態學檢查正常對照組大鼠角膜(圖1A)上皮細胞層、基質層和內皮細胞等各層結構層次清楚，細胞排列整齊，未見新生血管等異常，丹酚酸B治療各組與正常對照組相比無顯著差異，糖尿病對照組(圖1B)大鼠角膜上皮欠光滑，細胞排列緊密，基質層皺褶增加，結構不均勻，與內皮連接不整齊，后彈力層有少部分破壞。

2.4糖尿病大鼠角膜MDA含量和SOD活性糖尿病對照組角膜組織中MDA含量較正常對照組增高(P<0.05)；丹酚酸B治療組MDA含量較正常對照組仍有增高，但較糖尿病對照組降低，差異均有統計學意義(P<0.05)；糖尿病對照組角膜組織中SOD活性較正常對照組降低(P<0.05)；丹酚酸B治療組SOD活性較正常對照組亦有降低，但較糖尿病對照組升高，差異均有統計學意義(P<0.05)；隨著病程的延長，糖尿病對照組與丹酚酸B治療組SOD活性均逐漸降低(P<0.01)，但丹酚酸B治療組較糖尿病對照組降低程度輕，0.05%丹酚酸B治療組明顯升高(表2)。

表1　各組大鼠體質量變化情況，g)

圖1糖尿病和0.05%丹酚酸B組造模后12wk大鼠角膜組織病理變化(HE×200)A：糖尿病組；B：0.05%丹酚酸B組。

表2　各組大鼠SOD活性和MDA含量，nmol/mL)

注：aP<0.05vs正常對照組；bP<0.01vs糖尿病對照組。

3討論

糖尿病的慢性并發癥可累及多個器官和組織，是患者致殘、致死的主要原因。其中糖尿病導致的角膜上皮病變日益受到關注，可引起許多患者視力下降甚至喪失，是一種潛在的致盲性病變。目前糖尿病角膜病變發生機制尚未明確，氧自由基生成及清除抑制蛋白質糖基化反應[6]過程中氧自由基產生增加，引起的過氧化反應在糖尿病并發癥形成上發揮重大作用。丹酚酸B主要經過肝臟代謝，在血清中的濃度極低[7]，故到達眼組織的量極低，局部用藥相對于全身用藥更有利，眼用凝膠能促進其局部吸收。丹酚酸B是丹參的有效水溶性成分，在丹參的功效中有重要地位，能清除氧自由基、抑制脂質過氧化反應，故用于眼部用藥，經國內外文獻檢索丹酚酸B多用于肝、腎、心血管疾病等的治療[8]，丹酚酸B能顯著降低糖尿病大鼠血脂、血糖和糖化血紅蛋白的水平，改善腎功能，提高胰島素敏感指數，改善胰島素耐量及糖耐量[2]，也有學者進行丹酚酸B眼用凝膠改善大鼠糖尿病性白內障的研究，并取得良好的效果[3]，但未發現用于糖尿病性角膜病變治療的報道。

我們的研究旨在探究丹酚酸B抗氧化應激對糖尿病大鼠角膜的保護作用，并使用眼用凝膠增強藥物的吸收。研究結果顯示：(1)HE染色在普通光學顯微鏡未見明顯異常；(2)MDA和SOD檢測顯示丹酚酸B能夠抑制角膜組織中氧化應激的作用。

實驗通過角膜檢查、角膜組織結構改變，發現其無明顯的變化，根據角膜在糖尿病病變過程中進程緩慢，在普通光學顯微鏡活體觀察和HE組織染色無法發現明顯變化，其原因可能由于其變化細微，需要用更高級的檢測技術才能發現，有相關報道提示糖尿病大鼠早期12wk在掃描電鏡下可觀察到角膜上皮細胞表面不平整，形態不規則，細胞間出現裂縫，表面微絨毛疏松[9]。因此，電鏡檢查和免疫組化檢查亦是本實驗可以改進的地方，普通光學顯微鏡未見病變，但在電子顯微鏡及其免疫組化等均有可能發現其病變。這與王春霞等[10]報道的一致，他們的研究提出未施加干預因素的情況下觀察角膜：糖尿病大鼠實驗最初3mo各組的角膜損傷未見明顯的進展。

雖然在病理形態學未檢測到異常，但在生化方面有著明顯的變化，并進一步證實大鼠糖尿病病變及其丹酚酸B的抗氧化應激作用。SOD能清除糖尿病蛋白質糖基化反應[6]產生的氧自由基，糖尿病引起SOD的活性下降，其值隨之下降。通過與對照組的比較，實驗組的值明顯上升。蛋白糖基化反應的產物(氧自由基)攻擊生物膜中的不飽和脂肪酸，可引發脂質過氧化反應，形成脂質過氧化物，MDA 為其中之一，糖尿病大鼠由于高血糖引起大量氧自由基堆積，產生大量MDA，其值亦相應上升；實驗中觀察到丹酚酸B組的值下降。比較各組數據結果顯示，丹酚酸B凝膠組角膜知覺反射明顯優于糖尿病對照組和正常對照組，丹酚酸B組SOD活性高于糖尿病對照組和正常對照組，丹酚酸B凝膠組MDA含量低于糖尿病對照組和正常對照組，0.05%丹酚酸B凝膠組療效更明顯，精確的最有效濃度可進一步探索。

本實驗中，MDA和SOD的變化提示糖尿病角膜組織病變存在氧化應激反應，進一步闡明了發病機制。此外，丹酚酸B對糖尿病大鼠角膜有保護作用，對防治糖尿病性角膜病變具有臨床指導意義。

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Protective effects and its mechanism of Salvianolic acid B on the cornea of diabetic rats

Sheng-Hui Wu, Yan-Feng Wang, Xiao-Qin Zhang, Zhen-Zhen Huang, Yi Lin, Yan Huang, Wei-Dong Zheng

2016-03-07Accepted：2016-08-08

?Salvianolic acid B; diabetes mellitus; cornea; oxidative stress; superoxide dismutase; malondialdehyde

福建省自然科學基金(No.2016J01155)；福建醫科大學省級大學生創新實驗項目(No.20141039207)

(350000)中國福建省福州市，福建醫科大學醫學技術與工程學院視光學系

吳升輝，本科，研究方向：眼科學基礎。

黃焱，博士，教授，研究方向：眼科學基礎.13960888823@139.com

2016-03-07

2016-08-08

Wu SH, Wang YF, Zhang XQ,etal. Protective effects and mechanism of Salvianolic acid B on the cornea of diabetic rats.GuojiYankeZazhi(IntEyeSci) 2016;16(9):1629-1631

10.3980/j.issn.1672-5123.2016.9.07