透膿散醇提物急性毒性實(shí)驗(yàn)研究※

房良華　劉沈林　王瑞平　胡守友

(江蘇省中醫(yī)院腫瘤內(nèi)科，江蘇　南京　210029)

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透膿散醇提物急性毒性實(shí)驗(yàn)研究※

房良華劉沈林王瑞平△胡守友

(江蘇省中醫(yī)院腫瘤內(nèi)科，江蘇南京210029)

目的探討透膿散醇提物對(duì)小鼠的急性毒性反應(yīng)。方法先進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)，取12只SPF級(jí)昆明種小鼠(雌雄各半)，隨機(jī)分為3組，即透膿散醇提物高、中、低劑量組，每組各4只，分別予透膿散醇提物1.00、0.75、0.50 g/mL濃度藥液0.04 mL/只，每日2次灌胃給藥，連續(xù)觀察5 d，擬找出100%致死量(LD100)、最大全不致死量(LD0)和相應(yīng)的劑量組間距r值。另取小鼠40只(雌雄各半)，隨機(jī)分為2組，即實(shí)驗(yàn)組及對(duì)照組，每組各20只，進(jìn)行最大給藥量實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)組小鼠予高濃度透膿散醇提物(1.00 g/mL)0.04 mL，對(duì)照組予0.9%氯化鈉注射液0.04 mL/只，均每日2次灌胃，連續(xù)14 d。給藥期間每隔2 d測實(shí)驗(yàn)組及對(duì)照組小鼠體質(zhì)量，記錄給藥后2組小鼠活動(dòng)、飲食情況、精神狀態(tài)、不良反應(yīng)情況及死亡數(shù)量、死亡時(shí)間。末次給藥后測定小鼠肝、腎功能變化，然后2組小鼠全部脫頸處死、解剖，肉眼觀察心、肝、脾、肺、腎、腦等各臟器有無異常。結(jié)果預(yù)實(shí)驗(yàn)期間透膿散醇提物高、中、低劑量組小鼠生命狀況良好，無死亡現(xiàn)象，無法測出該藥的半數(shù)致死量(LD50)。最大給藥量實(shí)驗(yàn)觀察期14 d內(nèi)，實(shí)驗(yàn)組及對(duì)照組小鼠毛色、飲食、糞便、活動(dòng)均未見異常，肝、腎功能指標(biāo)正常，未見任何中毒表現(xiàn)，無死亡，尸檢各臟器無異常。結(jié)論小鼠對(duì)透膿散醇提物的最大耐受量為40 g/kg，該量為臨床用量0.625 g/kg的64倍，可以認(rèn)為臨床用藥安全。

急性毒性試驗(yàn)；中草藥；小鼠

透膿散是《外科正宗》中常用的托毒排膿方劑，由生黃芪、當(dāng)歸、川芎、炮穿山甲、皂角刺5味中藥組成，具有補(bǔ)氣托毒、養(yǎng)血散瘀、軟堅(jiān)潰膜等功效。臨床主要用于正虛不能托毒、內(nèi)已成膿、外不易潰、漫腫無頭之癰瘍。有研究表明，透膿散還有良好的抗感染[1-2]和抗腫瘤作用[3-4]。本實(shí)驗(yàn)通過對(duì)昆明種小鼠灌胃給藥，觀察透膿散醇提物的急性毒性，初步評(píng)價(jià)其在腫瘤治療中的安全性，確定其主要的毒性反應(yīng)癥狀，為進(jìn)一步的研究提供科學(xué)依據(jù)。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物SPF級(jí)昆明種小鼠52只，體質(zhì)量18～22 g，雌雄各半，由中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量合格證SCXK(軍)2007-004，合格證編號(hào)0024645，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證SYXK(軍)2007-030。放入實(shí)驗(yàn)室環(huán)境中分籠飼養(yǎng)，每籠5只，保持環(huán)境溫度20～25 ℃，濕度40%～70%，飼以實(shí)驗(yàn)動(dòng)物用配合飼料，自由進(jìn)食、飲水。

1.1.2主要藥物與試劑透膿散：透膿散中5種藥材黃芪、當(dāng)歸、皂角刺、川芎及炮穿山甲均由江蘇省中醫(yī)院提供。其名稱、產(chǎn)地、產(chǎn)品批號(hào)、生產(chǎn)日期和用量詳見表1。取10倍量的藥材共375 g，經(jīng)粉碎過40目篩后用80%乙醇煎煮2次，第1次加入10倍量80%乙醇回流提取2 h，第2次加入8倍量80%乙醇回流提取1.5 h，合并2次提取物，70 ℃減壓濃縮回收至無醇并濃縮至1 g生藥/mL，-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

表1　透膿散藥材信息

1.2實(shí)驗(yàn)方法1.2.1預(yù)實(shí)驗(yàn)取12只小鼠(雌雄各半)，適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d后，禁食12 h，不禁水，隨機(jī)分為3組，即透膿散醇提物高、中、低劑量組，每組各4只。按照受試物的配制方法，配制成透膿散醇提物1.00、0.75、0.50 g/mL(高、中、低)3個(gè)濃度的藥液，以0.04 mL/g每日分2次給各對(duì)應(yīng)組小鼠灌胃給藥，連續(xù)觀察5 d，擬找出100%致死量(100% lethal dose，LD100)、最大不全致死量(LD0)和相應(yīng)的劑量組間距r值。1.2.2最大給藥量實(shí)驗(yàn)另取小鼠40只(雌雄各半)，適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d后，禁食12 h，不禁水，隨機(jī)分為2組，即實(shí)驗(yàn)組及對(duì)照組，每組各20只。實(shí)驗(yàn)組小鼠予高濃度透膿散醇(1.00 g/mL)0.04 mL，每日2次灌胃給藥，連續(xù)14 d。對(duì)照組小鼠予0.9%氯化鈉注射液0.04 mL，每日2次灌胃，連續(xù)14 d。

1.3觀察項(xiàng)目最大給藥量實(shí)驗(yàn)給藥期間每隔2 d測實(shí)驗(yàn)組及對(duì)照組小鼠體質(zhì)量，記錄給藥后2組小鼠活動(dòng)、飲食情況、精神狀態(tài)、不良反應(yīng)情況及死亡數(shù)量、死亡時(shí)間[5]。末次給藥后24 h眼眶靜脈叢采血，測定小鼠肝、腎功能[主要指標(biāo)為丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)、尿素氮(BUN)、血肌酐(Cr)]變化。然后2組小鼠全部脫頸處死、解剖，肉眼觀察心、肝、脾、肺、腎、腦等各臟器有無異常[6]。

2　結(jié)　果

2.1預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果預(yù)實(shí)驗(yàn)期間透膿散醇提物高、中、低劑量組小鼠生命狀況良好，無死亡現(xiàn)象，因而無法測出該藥的LD50，故進(jìn)行最大給藥量實(shí)驗(yàn)。2.2最大給藥量實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.2.1小鼠一般情況觀察期14 d內(nèi)，實(shí)驗(yàn)組及對(duì)照組小鼠毛色、飲食、糞便、活動(dòng)均未見異常，無小鼠死亡。

2.2.22組小鼠體質(zhì)量變化情況比較見表2。

表2　2組小鼠體質(zhì)量變化情況比較　±s

由表2可見，隨著用藥時(shí)間的延長，實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組小鼠體質(zhì)量均呈上升趨勢，但2組間小鼠體質(zhì)量變化比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。2組給藥后14 d小鼠體質(zhì)量與本組給藥前比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

2.2.32組小鼠肝、腎功能指標(biāo)比較見表3。

表32組小鼠肝、腎功能指標(biāo)比較

±s

由表3可見，與對(duì)照組比較，實(shí)驗(yàn)組小鼠肝、腎功能無明顯變化，比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

2.2.42組小鼠主要臟器變化經(jīng)解剖肉眼觀察，2組小鼠心、肝、脾、肺、腎、腦等主要器官未見明顯異常。

3　討　論

透膿散方以生黃芪為君藥，善于走表，斂汗托毒消腫，兼升陽舉陷；皂角刺消腫散結(jié)，拔毒透膿，與穿山甲相須為用，使膿外達(dá)；川芎、當(dāng)歸養(yǎng)血活血，扶助正氣，助膿托出，用于正虛不能托毒、內(nèi)已成膿、外不易潰、漫腫無頭之癰瘍。前期實(shí)驗(yàn)表明，透膿散具有良好的抗腫瘤作用，且隨著劑量的增大作用增強(qiáng)[3，7]。目前透膿散在臨床無毒性反應(yīng)的報(bào)道，但由于該方常規(guī)用于癰瘍的治療，劑量較小。而用于腫瘤的治療需要提高劑量，且基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)研究表明其抗腫瘤作用具有明顯的量效關(guān)系。因此，我們進(jìn)行該藥物的毒性反應(yīng)實(shí)驗(yàn)，為后續(xù)臨床使用透膿散進(jìn)行抗腫瘤劑量的選擇和觀察指標(biāo)的設(shè)計(jì)提供參考信息。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，小鼠對(duì)透膿散醇提物的最大耐受量為40 g/kg，該量已為臨床用量0.625 g/kg的64倍，為臨床提供了用藥安全的依據(jù)。

中藥、天然藥物的急性毒性往往難以表現(xiàn)出來，即使在采用大劑量時(shí)能觀察到動(dòng)物死亡情況，但該劑量可能與有效劑量或擬臨床用量相差很大，其毒性反應(yīng)對(duì)其他安全性試驗(yàn)及臨床的指導(dǎo)意義已不大。國家食品藥品監(jiān)督管理局1999年頒布的《中藥新藥藥理毒理研究的技術(shù)要求》明確規(guī)定，因受試物的濃度或體積限制，無法測出半數(shù)致死量(LD50)時(shí)，可做最大給藥量實(shí)驗(yàn)進(jìn)行中藥急性毒性實(shí)驗(yàn)。本研究預(yù)實(shí)驗(yàn)的目的有2個(gè)：①觀察3個(gè)劑量對(duì)小鼠的致死率分別是多少，選擇最佳劑量進(jìn)行后續(xù)的正式實(shí)驗(yàn)。②如果3個(gè)劑量都沒有出現(xiàn)致死，那么就選擇最高劑量進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。本實(shí)驗(yàn)在預(yù)實(shí)驗(yàn)期間對(duì)實(shí)驗(yàn)小鼠予透膿散醇提物1.00、0.75、0.50 g/mL 3個(gè)濃度的藥液灌胃，均未有小鼠死亡，未得到LD50值，故以透膿散醇提物最高濃度1.00 g/mL給藥，證實(shí)小鼠完全耐受，未出現(xiàn)任何毒性反應(yīng)，其用量相當(dāng)于成人臨床日用量的64倍。說明透膿散醇提取液安全，急性毒性小，LD50遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于40 g/kg的劑量。但此實(shí)驗(yàn)觀察時(shí)間較短，還需要結(jié)合長期毒性實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步觀察此藥物的毒性。

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(本文編輯：曹志娟)

Experimental study of acute toxicity of the alcohol extraction of Tou-nong powder

FANGLianghua,LIUShenlin,WANGRuiping,etal.

DepartmentofMedicalOncology,HospitalofTraditionalChineseMedicineinJiangsuProvince,Jiangsu,Nanjing210029

Objective To study the acute toxicity reaction of alcohol extraction of Tou-nong powder in mice. Methods 12 SPF Konmin mice (half male and female) were randomly divided into three groups that Tou-nong powder-alcohol extraction high, middle and low dose groups, 4 mice in each group. Mice in high, middle and low dose groups were received Tou-nong powder-alcohol extraction at concentration of 1.00,0.75,0.50 g/mL respectively, intragastric administration of 0.04 mL/mouse, twice per day for 5 d. To find out the 100% lethal dose (LD100), lethal dose-0 (LD0) dose and the r-value of corresponding dose. The other 40 mice (half male and female) were randomly divided into experimental group and control group. Mice in experimental group received high concentration (1 g/mL) of Tou-nong powder-alcohol extraction (0.04 mL/mouse). Mice in control group received 0.9% sodium chloride injection (0.04 mL/mouse), intragastric administration twice per day for 14 d. The body mass of mice were detected every 2 d during experimental period in experimental and control groups. The activity, diet condition, mental state, adverse reaction, the number and time of deaths after administration were recorded in two groups. The changes of liver and kidney functions were mesured after final administration. Then, all mice were decapitated. The organ conditions such as heart, liver, spleen, pulmonary, kidney and brain were observed by dissection. Results Mice life indication stabilize in Tou-nong powder-alcohol extraction high, middle and low dose groups during preliminary experiments, without death, and the medianl lethal dose(LD50) could not be detected. During observation period of themaximum dosage experiment (14 d), there were no abnormal changes about coat color, eating, drinking, faeces and activity in experimental and control groups that with normal serum liver and kidney function indexes and without intoxicating phenomenon and death. Mice were sacrificed after 14 days and postmortem examination showed that there were no abnormal changes in organs. Conclusion The maximum tolerance dose of Tou-nong powder-alcohol extraction is 40 g/kg in mice which is more than 640 percent than clinical dosage (0.625 g/kg), can be considered clinical medication safety.

Acute toxicity test; Chinese herbal medicine; Mice

10.3969/j.issn.1002-2619.2016.01.026

△江蘇省中醫(yī)院腫瘤內(nèi)科，江蘇南京210029

房良華(1976—)，女，副主任醫(yī)師，碩士研究生導(dǎo)師，博士，博士后。從事腫瘤的中西醫(yī)結(jié)合治療和免疫治療。

R285.5；R994.13

A

1002-2619(2016)01-0085-03

2014-07-15)

※ 項(xiàng)目來源：江蘇省財(cái)政廳 江蘇省科學(xué)技術(shù)廳2014年省級(jí)自然科學(xué)基金(青年科技人才專項(xiàng)資金)項(xiàng)目(編號(hào)：BK20141034)；江蘇省人民政府辦公廳江蘇高校優(yōu)勢學(xué)科建設(shè)工程項(xiàng)目(編號(hào)：NO.012062003010)；江蘇省六大人才高峰項(xiàng)目(編號(hào)：NO.2011-WS-049)