尿酸酶多囊脂質(zhì)體的酶學(xué)性質(zhì)及其免疫原性

鄧 雪，何 丹，周云莉，熊華蓉，張景勍

（1.重慶醫(yī)科大學(xué) 藥學(xué)院，重慶400016；2.重慶醫(yī)科大學(xué) 藥物高校工程研究中心/生物化學(xué)與分子藥理學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，重慶400016）

尿酸酶多囊脂質(zhì)體的酶學(xué)性質(zhì)及其免疫原性

鄧 雪，何 丹，周云莉，熊華蓉，張景勍*

（1.重慶醫(yī)科大學(xué) 藥學(xué)院，重慶400016；2.重慶醫(yī)科大學(xué) 藥物高校工程研究中心/生物化學(xué)與分子藥理學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，重慶400016）

研究尿酸酶多囊脂質(zhì)體（Uricase-multivesicular liposomes，UOMVLs）的酶學(xué)性質(zhì)及其免疫原性。采用W/O/W復(fù)乳法制備UOMVLs，測定UOMVLs中尿酸酶（Uricase，UOX）的最適反應(yīng)溫度、最適反應(yīng)pH值、熱穩(wěn)定性以及儲(chǔ)存穩(wěn)定性，并以其為抗原免疫SD大鼠，制備抗血清，通過間接ELISA法檢測血清抗體效價(jià)。UOMVLs和UOX最適反應(yīng)溫度均為40℃；最適反應(yīng)pH值分別為8.0和8.5；UOMVLs的穩(wěn)定性明顯高于UOX；UOMVLs和UOX的血清抗體效價(jià)分別為1∶500和1∶8 000。因此 UOMVLs的酶學(xué)性質(zhì)明顯優(yōu)于游離UOX，免疫原性明顯低于游離UOX，為該酶的臨床應(yīng)用提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

尿酸酶；多囊脂質(zhì)體；酶學(xué)性質(zhì)；免疫原性

尿酸酶（Uricase，UOX）催化嘌呤代謝產(chǎn)物尿酸［1］分解為過氧化氫和尿囊素，其廣泛存在于植物、真菌、細(xì)菌及某些哺乳動(dòng)物的組織中，是生物體內(nèi)嘌呤降解途徑中的一種重要的酶［2］。人體缺乏尿酸酶，尿酸是人體嘌呤分解代謝終產(chǎn)物。當(dāng)尿酸生成增加或排泄減慢時(shí)，血中尿酸水平升高會(huì)形成高尿酸血癥，繼而引發(fā)痛風(fēng)綜合征等一系列疾?。?-4］。UOX專一性強(qiáng)，催化效率高，是治療高尿酸血癥的候選藥物［5］。然而，UOX存在體內(nèi)穩(wěn)定性差、體內(nèi)循環(huán)半衰期短、生物利用度低等缺點(diǎn)［6］，只能通過頻繁給藥維持有效的血藥濃度從而限制了尿酸酶的大范圍的、持續(xù)的應(yīng)用。

采用多囊脂質(zhì)體（Multivesicular liposomes，MVLs）作為UOX的載體，以改善UOX的缺點(diǎn)。MVLs是采用貯庫泡沫技術(shù)的一種新型脂質(zhì)體［7］，它由 Kim［8］于1983年通過改進(jìn)細(xì)胞大小的單室脂質(zhì)體的制備方法首先制得并命名，主要用于運(yùn)輸大分子物質(zhì)和親水性物質(zhì)［9］。多囊脂質(zhì)體具有包封率高、包封容積大、突釋少、生物相容性和生物可降解性良好等優(yōu)點(diǎn)［10］，可以彌補(bǔ)現(xiàn)有技術(shù)難以實(shí)現(xiàn)的對大分子藥物的高包封和低滲漏［11］。作者成功制備了尿酸酶多囊脂質(zhì)體 （Uricase-multivesicular liposomes，UOMVLs），并對其酶學(xué)性質(zhì)及免疫原性進(jìn)行分析，希望克服UOX的缺點(diǎn)，擴(kuò)大其臨床應(yīng)用。

1　材料與方法

1.1材料和儀器

1.1.1主要材料、試劑尿酸酶、異硫氰酸熒光素購自美國Sigma公司；卵磷脂購自德國Lucas Meyer公司；三油酸甘油酯購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；膽固醇購自廣州天馬精細(xì)化工廠；泊洛沙姆407購自南京威爾化工有限公司；泊洛沙姆188購自德國巴斯夫公司；L-賴氨酸購自北京鼎國生物技術(shù)有限公司；含HRP的羊抗鼠工IgG購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；牛血清白蛋白BSA購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；TMB（3，3'，5，5'-四甲基聯(lián)苯胺）購自研域（上海）化學(xué)試劑有限公司；乙醚購自重慶川東化工集團(tuán)有限公司。

1.1.2主要儀器與動(dòng)物AB204S電子分析天平購自瑞士Mettler Toledo儀器公司；RE 52 AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器購自上海亞榮生化儀器廠；QL-901型旋渦混合器購自海門市其林貝爾儀器制造有限公司；TGL-16B臺(tái)式高速離心機(jī)購自上海安亭科學(xué)儀器廠；TCS-SP2激光掃描共聚焦顯微鏡購自德國Leica公司。清潔級(jí)SD大鼠，（230±20）g，由重慶醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，動(dòng)物合格證書為SCXK渝2012-0001。

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1UOMVLs的制備采用W/O/W復(fù)乳法制備UOMVLs［12-13］，取處方量的卵磷脂、膽固醇、三油酸甘油酯溶于乙醚作為油相（O），取處方量的泊洛沙姆407、泊洛沙姆188溶于質(zhì)量分?jǐn)?shù)3%葡萄糖溶液中作為內(nèi)水相（W1），將UOX溶于內(nèi)水相。內(nèi)水相與油相等體積混合后，渦旋8 min制得 W/O型初乳。將初乳快速注入到含L-賴氨酸與質(zhì)量分?jǐn)?shù)4%葡萄糖的外水相（W2）中，初乳與外水相的體積比為1∶3，高速分散均質(zhì)機(jī)剪切制成 W/O/W型復(fù)乳，室溫下減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去有機(jī)溶劑，即得UOMVLs。

1.2.2UOMVLs的包封率的測定UOMVLs包封率的測定采用間接法［14-15］測定UOMVLs的包封率。吸取適量UOMVLs，離心5min后取上清液，加入氯仿混合均勻。取水層溶液，并用0.45μm的微孔濾膜過濾。取續(xù)濾液，加入考馬斯亮藍(lán)G-250，放置2 min后在595 nm波長處測定吸收度值，計(jì)算樣品中游離UOX的濃度。另取UOMVLs，直接用氯仿破乳后同法操作取續(xù)濾液，并用所得吸收度值計(jì)算UOMVLs中的藥物總濃度。重復(fù)3次，計(jì)算包封率。包封率按下式計(jì)算：包封率（%）=（投藥質(zhì)量-游離藥質(zhì)量）/投藥質(zhì)量×100%

1.2.3UOMVLs和UOX最適反應(yīng)溫度的測定取UOMVLs和UOX樣品液，分別于20～70℃的水浴，pH8.5的硼酸緩沖液條件下測定UOMVLs及游離UOX的活性，繪制溫度—活性曲線圖。具體方法按照參考文獻(xiàn)［16］。

1.2.4UOMVLs和UOX最適反應(yīng)pH值的測定取UOMVLs和游離UOX樣品液，在酶的最適反應(yīng)溫度下，分別于pH 6.5～9.5的硼酸緩沖體系中測定UOMVLs及游離UOX的活性，繪制pH—活性曲線圖。

1.2.5UOMVLs和UOX儲(chǔ)存穩(wěn)定性的測定按照張敉［17］等人的方法，將UOMVLs及游離UOX放置于4℃的冰箱中，分別于第 0，1，2，4，7，10，14，20，28 d時(shí)測定UOMVLs及游離UOX的活性，繪制時(shí)間—活性曲線圖。

1.2.6UOMVLs和UOX熱穩(wěn)定性的測定將UOMVLs及游離UOX置于55℃的水浴中，分別于0、1、2、3、4、5 h測定UOMVLs及游離UOX的活性，繪制活性—時(shí)間曲線圖。

1.2.7UOX活性的測定UOX活性單位的定義：每分鐘催化1μmol底物尿酸轉(zhuǎn)化為產(chǎn)物所需的UOX的量。具體方法按照參考文獻(xiàn)［18］。在pH 8.5的硼砂緩沖液中，以75μmol/L尿酸為底物，加入20 μL濃度為0.1mg/mL的酶樣品溶液，加酶后迅速用手輕輕振搖5秒，25℃條件下反應(yīng)，于0，10，20，30，40，50，60 s測定A293nm值。

1.2.8UOX與脂質(zhì)膜的相互作用檢測分別取空白MVL、空白MVL與UOX的混合液及UOX樣品液各980μL，再加入20μL濃度為5.14μmol/L的異硫氰酸熒光素溶液［19］，黑暗處孵化5 min，熒光分光光度計(jì)掃描，1 mL的比色皿中檢測其熒光強(qiáng)度。

1.2.9UOMVLs和UOX免疫原性的檢測將SD大鼠分為4組（n=6），分別為UOMVLs組，UOX組和陽性對照組、陰性對照組。分別靜脈注射UOMVLs、UOX、卵白蛋白及生理鹽水，給藥劑量為0.5mg/kg，每周1次，連續(xù)6周。每周給藥24 h后采血，分離血清，采用間接ELISA法［20-21］測定血清抗體效價(jià)：將抗原包被用pH 9.6碳酸-重碳酸鹽緩沖液稀釋為10μg/mL，加入孔板，100μL/孔，4℃靜置過夜；棄去孔內(nèi)液，洗板液洗滌3次，然后加入3%的BSA 100μL，37℃孵育1.5 h；洗滌，待測血清用質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.5%的BSA稀釋100倍，待陰性對照組及陽性對照組血清加樣后37℃孵育1 h；洗滌，加入含HRP的羊抗鼠工IgG，100μL/孔；洗滌，每孔加新配制的反應(yīng)液TMB反應(yīng)10 min后終止反應(yīng)，用酶標(biāo)儀測定A450nm。最后一次免疫2周后取各組血清按照1∶500，1∶1 000，1∶2 000，1∶4 000，1∶8 000，1∶16 000稀釋后，計(jì)算各組的抗血清效價(jià)。

2　結(jié)果與討論

2.1UOMVLs的包封率

經(jīng)檢測，UOMVLs的平均包封率為 （63.75± 3.65）%。

2.2UOMVLs和U0X的最適反應(yīng)溫度

測定結(jié)果顯示，UOMVLs和UOX的最適反應(yīng)溫度均為40℃，見圖1。

圖1　UOMVLs和游離UOX的最適溫度（n=3）Fig.1　Optimal tem perature of UOMVLs and free UOX，（n=3）

2.3UOMVLs和U0X的的最適反應(yīng)pH值

測定結(jié)果顯示，UOMVLs的最適反應(yīng)pH值為8.0，UOX的最適反應(yīng)pH值為8.5（見圖2）。在最適溫度下，UOMVLs的最適pH值為8.0，這種轉(zhuǎn)變可能是在制備過程中UOX的構(gòu)象發(fā)生改變所致。

圖2　UOMVLs和游離UOX的最適pH（n=3）Fig.2 OptimalpH valuesofUOM VLsand free UOX（n=3）

2.4UOMVLs和UOX儲(chǔ)存穩(wěn)定性的測定

由圖3可知，在4℃貯存條件下中，28 h時(shí)UOMVLs中酶活性隨時(shí)間變化保持在90%以上，UOX的活性由100%下降到34.5%。說明，UOMVLs提高了酶的穩(wěn)定性。

圖3　4℃條件下UOMVLs和UOX的穩(wěn)定性（n=3）Fig.3　Stability of UOMVLs and free UOX incubated at 4℃（n=3）

2.5UOMVLs和UOX熱穩(wěn)定性的測定

圖4顯示，0～5 h內(nèi)，UOMVLs在55℃水浴條件下酶活性隨時(shí)間變化保持在90%以上，游離UOX的酶活性由100%下降到39.71%。

圖4　55℃條件下UOMVLs和UOX的穩(wěn)定性（n=3）Fig.4　Stability of UOMVLs and free UOX incubated at55℃（n=3）

2.6UOX與脂質(zhì)膜的相互作用

FITC與一定量游離酶結(jié)合后會(huì)有一定值的熒光強(qiáng)度，而當(dāng)體系中的游離酶與脂質(zhì)體膜結(jié)合后，與FITC結(jié)合的游離酶相應(yīng)減少，使熒光強(qiáng)度減弱［22-23］。如圖5所示，MVLs的熒光強(qiáng)度最小，UOX與MVLs混合溶液的熒光強(qiáng)度增加，而UOX的熒光強(qiáng)度最大。UOMVLs較MVLs熒光強(qiáng)度增加，表明UOX與異硫氰酸熒光素競爭性結(jié)合脂質(zhì)體膜，據(jù)此推斷，UOX與MVLs發(fā)生相互作用。

圖5　熒光圖譜Fig.5 FITC fluorescence spectra

2.7UOMVLs和UOX的免疫原性

ELISA結(jié)果顯示，UOMVLs的抗血清效價(jià)為1∶500，UOX的抗血清效價(jià)為1∶8 000，表明UOMVLs有效降低了其免疫原性。

3　結(jié)語

UOX氧化尿酸為可溶性的尿囊素，可用于痛風(fēng)的臨床診斷和治療［24］。但由于蛋白質(zhì)與多肽的水溶性極好，制備普通脂質(zhì)體無法達(dá)到理想的包封率，藥物滲漏與突釋現(xiàn)象也使得藥物釋放不甚理想［25］。作者成功制備了UOMVLs，從包封率、最適反應(yīng)溫度、最適反應(yīng)pH、熱穩(wěn)定性、貯存穩(wěn)定性、免疫原性對UOMVLs和游離UOX進(jìn)行了研究，包封率達(dá)到了（63.75±3.65）%，克服了普通脂質(zhì)體對UOX包封率低的缺點(diǎn)。

從最適溫度的實(shí)驗(yàn)結(jié)果（圖1）可看出UOMVLs 和UOX的最適反應(yīng)溫度均為40℃，此條件下UOMVLs的活性為UOX的213%。從最適pH的實(shí)驗(yàn)結(jié)果（圖2）可看出UOMVLs和UOX的最適反應(yīng)pH分別為8.0和8.5。當(dāng)pH8.0時(shí)，UOMVLs的活性為UOX的160.44%；pH8.5時(shí)，UOMVLs的活性為UOX的131.00%。pH 6.5～9.5條件下，UOMVLs的活性均高UOX。

UOMVLs的穩(wěn)定性是其質(zhì)量控制的關(guān)鍵因素，良好的穩(wěn)定性是大規(guī)模生產(chǎn)和應(yīng)用于臨床實(shí)現(xiàn)的關(guān)鍵［26］。由圖3和圖4的結(jié)果可知，在加熱條件（55℃）和貯存條件（4℃）下，UOMVLs均能很好的保持UOX的活性，這說明UOX被MVLs包封在脂質(zhì)膜內(nèi)部后有更好的對抗外界溫度變化的能力。作為一種新型制劑，UOMVLs不僅提高了UOX的貯存穩(wěn)定性和熱穩(wěn)定性，實(shí)驗(yàn)證明UOMVLs還有效降低了UOX的免疫原性。

因此，UOMVLs有增強(qiáng)UOX活性、提高UOX體外穩(wěn)定性、降低UOX免疫原性的優(yōu)點(diǎn)。大鼠體內(nèi)靜脈注射UOMVLs和UOX的藥代動(dòng)力學(xué)結(jié)果顯示，UOMVLs較UOX半衰期延長，達(dá)峰時(shí)間延后，峰濃度提高，UOMVLs的相對生物利用度約為UOX 的1 751%，UOMVLs可提高尿酸酶的生物利用度，為尿酸酶的臨床應(yīng)用提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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Enzymology and Immunogenicity of Uricase-M ultivesicular Liposomes

DENG Xue，HE Dan，ZHOU Yunli，XIONG Huarong，ZHANG Jingqing*
（1.College of Pharmacy，Chongqing Medical University，Chongqing 400016，China；2.Engineering Research Center in University/Chongqing Key Laboratory of Biochemical＆Molecular Pharmacology，Chongqing Medical University，Chongqing 400016，China）

This study aimed to investigate the enzymatic property and immunogenicity of uricase-multivesicular liposomes（UOMVLs）.UOMVLs were prepared by a double emulsion method，and optimal temperatures，pH values，storage and thermal stabilities of UOMVLs and uricase （UOX）were determ ined.SD rats were immunized using UOMVLs as antigens，and their serum antibody titerswere determ ined.Results showed that the optimal temperatures for UOMVLs and U0X were both 40℃，while the optimal pH valueswere 8.0 and 8.5，respectively.The stability of UOMVLswas significantly higher than thatof U0X.The serum antibody titers of rats immunized w ith UOMVLsand UOX were 1∶500 and 1∶8 000，respectively.Therefore，the enzymatic property of UOMVLswas significantly better and the immunogenicity was obviously lower than UOX，which provided an experimentalbasis for the clinicalapplication of UOX.

uricase，multivesicular liposome，enzymatic property，immunogenicity

Q 556；R 392-33

A

1673—1689（2016）04—0364—06

2014-11-25

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（30973645）；重慶市首批高等學(xué)校優(yōu)秀人才資助計(jì)劃。

張景勍（1973—），女，重慶人，理學(xué)博士，教授，博士研究生導(dǎo)師，主要從事藥物新劑型與新技術(shù)研究。E-mail：zjqrae01@163.com