MALDI-TOF-MS鑒定3種水稻細菌的方法

王文彬，匡 華，徐麗廣，馬 偉，劉麗強，胥傳來

（江南大學 食品學院，江蘇無錫214122）

MALDI-TOF-MS鑒定3種水稻細菌的方法

王文彬，匡 華，徐麗廣，馬 偉，劉麗強，胥傳來*

（江南大學 食品學院，江蘇無錫214122）

用哥倫比亞培養基培養了水稻細菌性谷枯病菌（NCPPB 2391，NCPPB 3591）、水稻細菌性條斑病菌（NCPPB 1585）、水稻細菌性褐斑病菌（NCPPB 2844），菌落采用乙醇/甲酸處理法處理后用基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜（MALDI-TOF-MS）分析其蛋白質指紋圖譜。除水稻細菌性條斑病菌無匹配結果外，其它2種細菌均有正確的鑒定結果。用Bruker公司標準方法建立了水稻細菌性條斑病菌蛋白質指紋圖譜庫。采用水稻葉片作為空白樣品添加了上述3種植物病菌，回收實驗結果表明3種植物病菌均可以用本方法檢測。該研究為應用MALDI-TOF-MS方法檢測水稻細菌奠定了基礎。

基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜；水稻病菌；檢測

水稻是全球僅次于小麥的第二大糧食作物，也是中國最重要的糧食作物之一，水稻產量直接關系著中國的糧食安全。真菌、病毒或細菌引起的水稻病害輕者引起水稻減產，嚴重時可導致大片稻田顆粒無收［1］。水稻細菌性褐斑病是由丁香假單胞菌丁香致病變種（Pseudomonas syringae pv.syringae）引起的一種細菌性病害，病害在我國主要分布在東北水稻產區［2］。水稻細菌性條斑病菌（Xanthomonas oryzae pv.Oryzicola）是引起水稻條斑病的水稻細菌，最先發現于廣東后來蔓延到湖南、江西、浙江、江蘇等南方稻區［3］。水稻細菌性谷枯病菌（Burkholderia glumae）是一種可引起苗期水稻秧苗腐爛、穗期水稻谷粒枯死的水稻細菌，主要分布于日本、越南，2007年已列入我國進境植物檢疫性有害生物名錄［4］。

目前水稻細菌性褐斑病還沒有國標檢測方法，檢測方法也未見報道。水稻細菌性條斑病菌和水稻細菌性谷枯病菌目前均有國標檢測方法，主要根據病株形態學特征，并采用分離培養、PCR（polymerase chain reaction）方 法 和 ELISA（enzyme linked immunosorbent assay）方法結合生理生化以及菌株致病性進行鑒定。廖曉蘭等建立了快速檢測水稻細菌性條斑病菌的實時熒光PCR方法，該方法可以區分水稻白葉枯菌與水稻細菌性條斑病菌［5］。馮雯杰，張華分別建立了可以區分水稻白葉枯菌與水稻細菌性條斑病菌的水稻細菌性條斑病菌的常規PCR方法，成本相對較低，適合在種子檢疫站進行推廣［6-7］。羅金燕等分別用常規PCR和免疫PCR檢測水稻細菌性谷枯病菌，發現兩種方法均可以特異性檢測水稻細菌性谷枯病菌，但免疫PCR可以檢測103cfu/ mL的菌懸液，靈敏度比常規PCR高兩個數量級［8］。莫瑾等設計了兩對水稻細菌性谷枯病菌的特異性引物，建立了雙重PCR檢測方法，提高了PCR檢測的特異性，準確性和檢測靈敏度［9］。

基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜（Matrixassisted laser desorption ionization-time of flight massspectrometry，MALDI-TOF-MS）技術是一種軟電離新型生物質譜，開始被用來鑒定蛋白和多肽的相對分子質量以及鑒定未知蛋白，后來在檢測疾病標志物、微生物分類、臨床微生物診斷等方面都得到成功的應用［10-12］。目前MALDI-TOF-MS已被廣泛報道用于檢測鑒定病原微生物，具有快速、重復性好的特點。作者報道了一種用MALDI-TOF-MS檢測水稻細菌性谷枯病菌、水稻細菌性條斑病菌、水稻細菌性條斑病菌的方法，為應用MALDI-TOF-MS檢測其它水稻病菌奠定了基礎。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1供試菌株標準菌株：水稻細菌性谷枯病菌（Burkholderia glumae，NCPPB 2391），水稻細菌性谷枯病菌（Burkholderia glumae，NCPPB 3591），水稻細菌性條斑病菌 （Xanthomonas oryzae pv.Oryzicola，NCPPB 1585），丁香假單胞菌丁香致病變種（Pseudomonas syringae pv.syringae，NCPPB2844），均購于英國NCPPB中心。

1.1.2培養基哥倫比亞瓊脂培養基，購于杭州微生物試劑有限公司。

1.1.3試劑無水乙醇：色譜純，購自百靈威科技有限公司；甲酸（formic acid，FA）、乙腈（acetonitrile，ACN）：均為色譜純，購于Sigma公司；基質 α-氰-4-羥基肉桂酸（α-Cyano-4-hydroxy-cinnamic acid，CHCA），校 準 蛋 白 干 粉（proteincalibration standard）：購自德國布魯克公司。水稻葉片、玉米葉片由湖南檢驗檢疫局提供，白菜購于本地超市。

1.1.4實驗儀器基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜儀（ultrafleXtreme MALDI-TOF），德國布魯克公司。生物安全柜，Thermo scientific。

1.2方法

1.2.1植物病菌的培養條件-80℃凍存的菌液在哥倫比亞瓊脂培養基平板上劃線，28℃培養2～3 d，傳代2～3次。

1.2.2樣品處理與鑒定參考陳秀金的方法進行MALDI-TOF-MS檢測。

1.2.3建立細菌MALDI-TOF指紋圖譜數據庫按照布魯克公司標準方法建立。

1.2.4樣品添加回收水稻葉片用適量滅菌的蒸餾水沖洗3次，再用體積分數70%乙醇浸泡3min，隨后用適量滅菌的蒸餾水浸泡洗滌，重復3次。取適量葉片于一次性平皿中，用一次性接種針將植物病菌接種到平皿中的葉片上。樣品處理按照GB/T 28078—2011—水稻白葉枯病菌、水稻細菌性條斑病菌檢疫鑒定方法中未顯癥的可疑組織的方法進行。劃線后的平板按照1.2.1的方法培養，平板上可疑菌落采集后采用1.2.2的方法進行處理和鑒定。

2　結果與討論

2.1植物病菌培養條件

哥倫比亞培養基營養豐富，目前用于培養植物病菌的報道比較少。本研究中的幾種植物病菌均采用哥倫比亞培養基培養效果不錯，2～3 d可以長出米粒大小的菌落。培養溫度，水稻細菌性谷枯病菌最適生長溫度是30～35℃。水稻細菌性條斑病菌最適生長溫度是28～30℃。丁香假單胞菌丁香致病變種，又稱水稻細菌性褐斑病，最適生長溫度是25～30℃。因此，作者采用了28℃培養，在該溫度下3種植物病菌均可較好的生長。

2.2植物病菌蛋白質指紋圖譜的建立

用TFA法對培養的4株植物病菌進行樣品處理并用MALDI-TOF-MS分析，其蛋白質指紋圖譜如圖1～3所示。檢索Bio-Typer數據庫后4株菌的鑒定結果如表1所示。檢索Bio-Typer數據庫后，水稻細菌性谷枯病菌NCPPB 2391、水稻細菌性谷枯病菌NCPPB 3591和水稻細菌性褐斑病菌NCPPB 2844均有正確的匹配結果。鑒定結果如表1所示。水稻細菌性條斑病菌NCPPB 1585在數據庫中沒有匹配結果，檢索后發現數據庫中沒有該菌的質譜數據庫。因此，按照布魯克公司標準方法建立了水稻細菌性條斑病菌NCPPB 1585的數據庫。

可信度得分在2.300到3.000之間的結果可鑒定到種；可信度得分在2.000到2.299之間的結果確定鑒定到屬，很可能是鑒定到種；得分在1.700到1.999之間的結果很可能可鑒定到屬。水稻細菌性谷枯病菌NCPPB 2391可信度得分低于水稻細菌性谷枯病菌NCPPB 3591但均有正確的匹配結果。Bio-Typer數據庫中沒有水稻細菌性條斑病菌，因此作者采用布魯克公司的標準方法建立了水稻細菌性條斑病菌的數據。水稻細菌性褐斑病菌NCPPB 2844又稱丁香假單胞菌丁香致病變種鑒定結果為丁香假單胞菌，雖然沒有鑒定到丁香致病變種，但在種的水平上是正確的。

2.3樣品添加回收

圖1　水稻細菌性谷枯病菌NCPPB 2391（上），NCPPB 3591（下）的蛋白質指紋圖譜Fig.1　Protein mass spectrometric profiles of Burkholderia glumae NCPPB 2391（up）and Burkholderia glumae NCPPB 3591（down）

為研究基質影響和探索基于蛋白質指紋圖譜的水稻病菌檢測方法，選擇用水稻葉片進行了樣品添加實驗。表2是各樣品的鑒定結果，由表可知4株植物病菌的添加樣品均可用該方法正確鑒定。

圖2　水稻細菌性條斑病菌NCPPB 1585的蛋白質指紋圖譜Fig.2　Protein mass spectrometric profile of Xanthomonas oryzae pv.Oryzicola NCPPB 1585

圖3　丁香假單胞菌丁香致病變種NCPPB2844的蛋白質指紋圖譜Fig.3　Protein mass spectrometric profile of Pseudomonas syringae pv.syringae NCPPB2844

表1　純培養菌株的M ALDI-TOF-MS指紋圖譜在Bio-Typer數據庫中的匹配結果Table 1　Matching results of pure cultures by MALDI-TOF-MS in Bio-Typer

表2　添加樣品中分離株的M ALDI-TOF-MS指紋圖譜在Bio-Typer數據庫中的匹配結果Table 2　M atching results of isolated colonies from spiked sam ples by MALDI-TOF-MS in Bio-Typer

3　結語

近年來MALDI-TOF-MS技術已經越來越多地用來檢測病原微生物，然而主要集中在沙門氏菌、單增李斯特菌等常見的食源性致病菌或者臨床上重要的致病菌，而應用于檢測水稻細菌的報道還比較少見。目前檢測水稻細菌性條斑病菌、水稻細菌性谷枯病菌主要采用PCR擴增細菌特異性片段進行檢測，檢測靈敏度高、特異性好，但也存在著對操作人員技術要求高的特點。MALDI-TOF-MS檢測方法基于細菌全細胞蛋白質的指紋圖譜，具有操作簡單、檢測速度快、檢測結果穩定的優點，因此相信隨著研究的深入，MALDI-TOF-MS將成為檢測水稻實際樣品中病原菌的有力工具。

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Identification of Three Rice Pathogens by MALDI-TOF-MS

WANGWenbin，KUANG Hua，XU Liguang，MAWei，LIU Liqiang，XU Chuanlai*
（School of Food Science and Technology，Jiangnan University，Wuxi 214122，China）

A fter Burkholderia glumae（NCPPB 2391，NCPPB 3591），Xanthomonas oryzae pv. Oryzicola（NCPPB 1585）and Pseudomonas syringae pv.Syringae（NCPPB2844）were cultured by Columbia agarmedium and bacterial colonies were treated w ith an ethanol-form ic acid extraction procedure，the protein fingerprints were obtained and analyzed by MALDI-TOF-MS.Three plant pathogenswere accurately identified except that Pseudomonas syringae pv.Syringae did notexist in the Bio-Typer.W ith the standard method from Bruker，we established the protein fingerprint of Pseudomonassyringae pv.syringae in Bio-Typer.For the rice leaf spiked w ith these rice pathogens，they could be detected using thismethod.This study shed lighton the detection of rice pathogensby MALDI-TOF-MS.

MALDI-TOF-MS，rice pathogen，detection

S435.11

A

1673—1689（2016）04—0370—05

2014-07-02

國家“十二五”科技支撐計劃項目（2012BAC01B07）。

王文彬（1990—），男，河南南陽人，食品科學博士研究生，主要從事食品安全檢測研究。E-mail：wenbin66@yeah.net

胥傳來（1965—），男，江蘇鹽城人，工學博士，教授，博士研究生導師，主要從事食品安全檢測研究。E-mail：xcl@jiangnan.edu.cn