重組大腸桿菌產耐高溫Fe-SOD（H 29A）的發酵條件優化

陳 偉，李 偉，朱 虎，曲劍波，劉建國

（中國石油大學 化學工程學院，山東 青島 266580）

重組大腸桿菌產耐高溫Fe-SOD（H 29A）的發酵條件優化

陳 偉，李 偉，朱 虎，曲劍波，劉建國*

（中國石油大學 化學工程學院，山東 青島 266580）

超氧化物歧化酶在藥物和化妝品等工業中具有重要的應用價值。為了提高超氧化物歧化酶的產量，作者運用E.coli BL21（DE3）/pET28a（+）-SOD重組表達系統，采用單因素實驗和正交實驗相結合的方法，研究了誘導表達條件和發酵培養基對重組大腸桿菌產超氧化物歧化酶的影響。實驗結果表明，在培養基中添加1.20 g/L亮氨酸，30 g/L酵母粉且碳氮質量比為3，誘導劑濃度0.20mmol/L，誘導溫度37℃，誘導時間8 h的條件下，菌體生長量達到最高并且Fe-SOD （H29A）的產量達到全菌體蛋白的49.37%，表達量是LB培養基發酵的1.45倍。

超氧化物歧化酶；重組大腸桿菌；發酵；優化

對于SOD研究較早的是日本和美國，其中日本主要研究溶液環境對SOD的修飾及改變［1-3］，美國集中于研究SOD金屬特異性及反應機理［4］。隨著對SOD研究的不斷深入，其在醫藥［5］，食品以及化妝品［6］等領域的應用越來越廣泛，尤其是在抗衰老，防輻射以及消炎方面的作用被廣泛認可。

作者由嗜熱棲熱菌 T.thermophilus HB27的Mn-SOD基因片段通過聚合酶鏈式反應對第29位脫氧核糖核苷酸進行定點突變，然后經過基因重組并導入到E.coli BL21（DE3）中得到，經過誘導可以表達耐高溫Fe-SOD（H29A），但是該重組菌的SOD表達量還較低［7］。因此，為了提高Fe-SOD（H29A）的表達量，對培養基成份和發酵條件進行優化。最終顯著提高了重組大腸桿菌的產酶水平。

1　材料與方法

1.1菌種

BL21（DE3）/pET28a（+）-SO：由作者所在實驗室構建并保存，具體構建方法參見文獻［7］。

1.2培養基

LB培養基：蛋白胨10 g/L，酵母粉5 g/L，氯化鈉10 g/L，p H調為7.0。

LB固體培養基：每升培養基中加入20 g瓊脂。

以上培養基均在120℃滅菌20 min，添加經過濾除菌的卡那霉素至終質量濃度為0.05 g/L。

在培養基優化過程中，需對培養基的成分進行替換及增加，以考察不同營養物質配比下菌體生長及目的蛋白Fe-SOD（H29A）的表達量。

1.3培養方法

搖瓶種子培養：由平板上挑取單菌落接種于LB培養基中，150 r/min、37℃條件下培養12 h。

搖瓶發酵方法：將搖瓶種子液以4%接種量接入100 mL LB培養基中，150 r/min、37℃條件下培養至對數生長期（A600nm為0.6～0.8），添加IPTG進行誘導。

1.4測定方法

1.4.1菌體濃度測定發酵液經過適當稀釋后，利用紫外分光光度計（UV2450，島津）在A600nm下測定吸光度。A600nm=讀數×稀釋倍數

1.4.2菌體干重測定取菌液15 mL于已稱重的離心管中，于12 000 r/min下離心10 min，棄去上清液，再以超純水清洗菌體，放置于90℃干燥箱中烘干至恒重，稱重［8］。DWG=（烘干質量-離心管質量）× 1 000/15。由此得到A600nm-DCW關系的標準曲線，經過分析得y=0.541 9x+0.306 1（R2=0.994 4），其中y為菌體干重，x為A600nm。

1.4.3目的蛋白表達量測定發酵液在4℃10 000 r/min離心20 min，棄去上清液，以TE緩沖液重懸菌體。選定超聲破碎儀功率400W，破碎時間4 s，間隔時間2 s，破碎次數99次，離心管放置于冰浴中。將破碎液在4℃10 000 r/min下離心10min，取上清液，用質量分數15%SDS-PAGE檢測目的蛋白表達量。

圖1　DWG與A680 nm關系的標準曲線Fig.1　Standard curve of dry cellweight vs.A600 nm

電泳結束后，將凝膠用Tanon 1600凝膠成像系統分析計算表達量。

2　結果與討論

2.1培養基優化

2.1.1氨基酸種類對菌體生長及Fe-SOD（H29A）產量的影響培養基中添加適當的氨基酸可以提供重組蛋白合成所需的原料，從而使重組蛋白正常表達。另外，還可以減少產物在細菌里的降解，促進穩定。本試驗中所添加的氨基酸是Fe-SOD（H29A）所含數量最多的3種，分別為：甘氨酸（Gly）、丙氨酸（Ala）、亮氨酸（Leu），實驗結果如圖2所示。

實驗結果表明，添加氨基酸對于菌體的生長影響并不明顯，菌體密度基本維持在一個相對穩定的水平。但不同氨基酸對Fe-SOD（H29A）表達量的影響存在一定的差別。添加甘氨酸及丙氨酸對表達量提升作用不明顯，而添加亮氨酸至0.4 g/L時對Fe-SOD（H29A）表達量提升促進作用較明顯，因此，考察不同亮氨酸濃度對產酶水平的影響。

圖3表明，當添加亮氨酸時，Fe-SOD（H29A）的表達水平逐步提高，當亮氨酸質量濃度達到1.00 g/L時，Fe-SOD（H29A）的表達量達到了較高的水平，說明亮氨酸對產酶水平有促進作用，因此確定亮氨酸加入質量濃度為1.00 g/L。

圖2　不同氨基酸對菌體生長及Fe-SOD（H29A）產量的影響Fig.2　Effects of different kinds of am ino acids on the grow th of recombinant E.coli and the yield of Fe-SOD（H 29A）

圖3　亮氨酸對菌體生長及Fe-SOD（H29A）產量的影響Fig.3　Effects of Leu concentration on the grow th of recombinant E.coli and the yield of Fe-SOD （H29A）

2.1.2有機氮源對菌體生長及Fe-SOD（H29A）產量的影響有機氮源可以直接提供細菌在生長代謝過程中所需要的營養物質。但是，不同的細菌代謝過程對有機氮源的需求不盡相同，所以，選擇合適配比的有機氮源是保證細菌良好生長并表達外源蛋白的基礎。選定總有機氮含量為1.5 g/L，通過改變酵母粉（Y.E）和蛋白胨（T）的配比，考察了有機氮源配比對Fe-SOD（H29A）表達水平的影響（圖4）。

結果表明，當培養基完全為酵母粉時菌體密度最高，說明酵母粉有利于重組菌的生長，而蛋白胨含量增加時，菌體密度呈現逐步下降的趨勢。目的蛋白的表達量在氮源完全為酵母粉或蛋白胨時最高，在混合氮源時較低，雖然完全由蛋白胨作為氮源時，Fe-SOD（H29A）表達量較高，但是此時菌體密度較低，總產酶量并不高，相比較之下在純酵母培養基中，由于細菌密度可以達到較高的水平，所產目的蛋白多于添加蛋白胨的培養基，所以確定優化條件為酵母粉30 g/L。

圖4　有機氮源配比對菌體生長及Fe-SOD（H29A）產量的影響Fig.4　Effects of organic nitrogen ratios on the grow th of recombinant E.coli and the yield of Fe-SOD （H 29A）

2.1.3不同碳氮質量比對菌體生長及 Fe-SOD （H29A）產量的影響重組細菌在生長過程中需要消耗碳以維持正常的生理機能，在各種碳源中，葡萄糖廉價易得，檢測手段簡單，成為發酵過程主要的碳源。通過調整葡萄糖的加入量可以調節碳氮質量比，從而影響重組菌的生長情況。如碳氮質量比過低，則重組菌生長受到抑制，不能充分表達；而碳氮質量比過高，則重組菌代謝過于旺盛，副產物增加，同樣不利于目的蛋白的表達，因此需要考察不同的碳氮質量比對Fe-SOD（H29A）表達水平的影響。

圖5　碳氮質量比對菌體生長及Fe-SOD（H 29A）產量的影響Fig.5　Effect of different C/N on the grow th of recombinant E.coli and the yield of Fe-SOD（H 29A）

如圖5所示，當碳氮質量比為2時，菌體生長密度相對較高，并且目的蛋白表達量也較高，而當碳氮質量比高于2時，菌體密度有所下降，可能是重組菌代謝活躍，產生的副產物抑制了重組菌的生長，并造成雜蛋白表達，與目的蛋白競爭營養物質，不利于目的蛋白的形成。因此，確定碳氮質量比為2。

2.2誘導條件優化

2.2.1誘導劑濃度對菌體生長及Fe-SOD（H29A）產量的影響IPTG是較常用的一種誘導劑，由于其本身具有毒性，當其濃度過高時，就會對菌體生長產生明顯的抑制作用，進而降低目的蛋白的表達量。因此，作者考察了IPTG濃度對重組菌的生長及目的蛋白表達量的影響（圖6）。

圖6　IPTG濃度對菌體生長及Fe-SOD（H29A）產量的影響Fig.6　Effects of IPTG concentrations on the grow th of recombinant E.coli and the yield of Fe-SOD （H29A）

實驗結果表明IPTG對重組菌的生長會產生抑制作用，當IPTG濃度增加時，重組菌生長密度呈逐步下降趨勢。因此，在選定誘導劑濃度時不宜濃度過高。Fe-SOD（H29A）表達量隨IPTG濃度的增加呈先升高后降低的趨勢。這可能是因為IPTG對重組菌生長的抑制作用，影響了Fe-SOD（H29A）的表達，導致了表達量在IPTG濃度達到0.20mmol/L時達到最高值，然后隨IPTG濃度升高逐步下降，因此確定最優IPTG濃度為0.20mmol/L。

2.2.2誘導溫度對菌體生長及Fe-SOD（H29A）產量的影響溫度是影響發酵過程的一個重要因素，它不僅可以影響重組菌體的生長狀況，還可以影響重組酶的活性，因此選定了18、30、37、45℃來考察溫度對重組菌生長及Fe-SOD（H29A）表達的影響，見圖7。

實驗結果表明菌體密度在37℃前隨溫度升高而升高，而45℃時，菌體密度明顯下降，可能是因為溫度過高，使得重組菌提前進入了衰亡期；Fe-SOD（H29A）表達量在30～37℃之間達到較高水平，而45℃時表達量明顯下降，由于目的蛋白具有耐高溫特性，因此排除45℃下酶失活的可能，據此推測可能是菌體代謝旺盛，增強了雜蛋白的表達過程，從而抑制了Fe-SOD（H29A）的表達。最終確定重組菌的誘導溫度為37℃。

圖7　誘導溫度對菌體生長及Fe-SOD（H 29A）產量的影響Fig.7　Effects of induction temperatures on the grow th of recombinant E.coli and the yield of Fe-SOD （H 29A）

2.2.3誘導時間對菌體生長及Fe-SOD（H29A）產量的影響選擇恰當的誘導時間不僅可以使重組菌高效生長，還影響著目的蛋白的產量，因此誘導時間是決定發酵周期長短的因素之一。為了確定重組菌E.coli BL21（DE3）的最適誘導時間，對發酵過程進行了24 h誘導試驗，結果如圖8所示。

圖8　誘導時間對菌體生長及Fe-SOD（H 29A）產量的影響Fig.8　Effect of induction　times on　the grow th　of recombinant E.coli and the yield of Fe-SOD （H 29A）

實驗結果表明當誘導時間為8 h時，菌體密度達到最大值，然后進入衰亡期，菌體密度逐漸開始下降。目的蛋白表達量在誘導前10 h內逐步增加，誘導10 h時達到最大值，隨后有所降低，這可能是因為培養基性質的變化，引起了目的蛋白發生降解，從而導致了表達量的降低。因此，確定誘導時間為10 h。

2.3正交試驗

在單因素優化的基礎上，進行了正交試驗分析，設計因素包括A亮氨酸質量濃度（g/L）、B碳氮質量比、C誘導劑質量濃度 （mmol/L）、D誘導時間（h）的L9（34）正交試驗，設計表見表1。

通過對實驗結果進行極差分析，可知C＞A＞D＞B，即各因素對目的蛋白表達的影響顯著性次序為誘導劑濃度＞亮氨酸濃度＞誘導時間＞碳氮質量比。最佳實驗方案為A3B3C2D1，即當亮氨酸質量濃度為1.20 g/L，碳氮質量比為3，誘導劑質量濃度為0.20mmol/L，誘導時間為8 h時重組蛋白的表達量達到最大，為49.37%，相對于未經過發酵優化的LB培養基發酵提高了45.21%，并且菌體生長模式也有明顯變化，結果見圖9。

表1　因素水平表L9（34）Table 1　Factors and levels graph L9（34）

表2　正交試驗結果Table 2　Resut of orthogonal test

圖9　重組菌生長曲線Fig.9　Grow th curve of recombinant E.coli

3　結語

作者針對產耐高溫Fe-SOD（H29A）重組大腸桿菌E.coli BL21（DE3）的搖瓶發酵過程進行了優化，主要包括培養基優化和誘導條件優化。通過單因子優化方法確定了添加亮氨酸時可以有效提高目的蛋白表達量，說明亮氨酸是目的蛋白表達過程中的關鍵氨基酸，適當添加亮氨酸既可以提高產率，又可以避免原材料的浪費。此外，蛋白胨雖然可以提高目的蛋白的表達量，但是對重組菌體的生長不利，這與文獻報道的結論一致［9］，酵母粉作為氮源不僅使目的蛋白有較高的表達量，而且有利于菌體生長，酶的產量也高于蛋白胨。適當的碳氮質量比會促進細菌的生長及目的蛋白表達，但是過高的碳氮質量比會導致重組菌生長過于旺盛，從而可能產生不利于重組菌生長的副產物，并且雜蛋白的表達量也會提高，使目的蛋白表達量降低。此外在誘導條件的優化過程中，作者發現IPTG在一定濃度范圍內會促進Fe-SOD（H29A）的表達，濃度過高則會抑制重組細菌的正常生長，從而不利于目的蛋白表達。誘導溫度過高則會使重組菌代謝活動旺盛，提前進入衰亡期，并且使雜蛋白表達量增加。最終通過正交優化實驗確定了培養基添加1.20 g/L亮氨酸，有機氮源為30 g/L酵母粉，碳氮質量比為3，誘導劑濃度為0.20 mmol/L，誘導溫度為37℃，誘導時間為8 h，可使最終表達量達到49.37%，是LB培養基表達量的1.45倍，達到了較高的水平，為后續研究Fe-SOD（H29A）奠定了基礎。

［1］Vance C K，M iller A F.Spectroscopic comparisons of the pH dependencies of Fe-substituted（Mn）superoxide dismutase and Fe-superoxide dismutase［J］.Biochem istry，1998，37：5518-5527.

［2］陳祥娥，凌沛學，張天民.超氧化物歧化酶的應用［J］.食品與藥品，2013，15（4）：283-285. CHEN Xiange，LING Peixue，ZHANG Tianm in.Application of superoxide dismutase［J］.Food and Drug，2013，15（4）：283-285.（in Chinese）

［3］Yamakura F，Kobayashi K，Ue H，et al.The pH-dependent changes of the enzym ic activity and spectroscopic properties of iron-substituted manganese superoxide dismutase.A study on themetal-specific activity of Mn-containing superoxide dismutase ［J］.Eur J Biochem，1995，227（3）：700-706.

［4］M iller A F.Redox tuning overalmost1 V in a structurally conserved active site：lessons from Fe-containing superoxide dismutase ［J］.Accounts of Chem ical Research，2008，41（4）：501-510.

［5］王君明，崔瑛，王崢濤，等.超氧化物歧化酶參與肝損傷的研究進展［J］.中國實驗方劑學雜志，2011，17（7）：265-269. WANG M ingjun，CUIYing，WANG Zhengtao，et al.Research progress of superoxide dismutase involved in liver injury［J］. Chinese Journal of Experimental TraditionalM edical Formulae，2011，17（7）：265-269.（in Chinese）

［6］董亮，何永志，王遠亮，等.超氧化物歧化酶（SOD）的應用研究進展［J］.中國農業科技導報，2013，15（5）：53-58. DONG Liang，HE Yongzhi，WANG Yuanliang，et al.Research progress on application of superoxide dismutase（SOD）［J］. Journal of Agricultural Science and Technology，2013，15（5）：53-58.（in Chinese）

［7］寧守嬌.生物信息學方法指導改變超氧化物歧化酶金屬結合類型的研究［D］.青島：中國石油大學（華東），化學工程學院. 2012.

［8］喬宇，丁宏標，閆俊艷，等.重組大腸桿菌產普魯蘭酶的高密度發酵工藝研究［J］.生物技術進展，2012（3），2（3）：195-200. QIAO Yu，DING Hongbiao，YAN Junyan，et al.Production of pullulanase by high cell density cultivation of recombinant Escherichia coli［J］.Current Biotechnology，2012（03），2（3）：195-200.（in Chinese）

［9］楊海麟，王長城，張玲，等.產膽固醇氧化酶重組大腸桿菌的發酵培養基和誘導條件的優化 ［J］.食品與生物技術學報，2009，28（5）：670-674. YANG Hailin，WANG Changcheng，ZHANG Ling，etal.Optim ization of culture conditions forproduction of cholesteroloxidase using recombinant E.coli［J］.Journal of Food Science and Biotechnology，2009，28（5）：670-674.（in Chinese）

Optim ization of Fermentation Process for a Hyperthermostable Fe-Superoxide Dismutase（H 29A）Expressed in Recombinant E.coli BL21（DE3）

CHENWei，LIWei，ZHU Hu，QU Jianbo，LIU Jianguo*
（College of Chemical Engineering，China University of Petroleum，Qingdao 266580，China）

Superoxide dismutase（SOD）is an important antioxidant enzyme which has been generally applied in pharmaceuticaland cosmetics industries.A combination of single factormethod and orthogonal design was utilized to study the effect of induction expression conditions and the fermentationmedium on SOD production expressed in a recombinant E.coli BL21（DE3）/pET28a（+）-SOD and improve the production of SOD.The optimalexpression levelof49.37%and 1.45 timesof that in LB medium were achieved under the follow ing condition including 1.20 g/L of leucine，30 g/L of yeastextract，the carbon to nitrogen（C∶N）ratio of 3∶1，0.20mmol/L IPTG，induce temperature at37℃and induction timeover8 h.

superoxide dismutase，recombinant E.coli，fermentation，optim ization

Q 819

A

1673—1689（2016）04—0381—06

2014-07-03

國家自然科學基金項目（21276280）；中國石油大學（華東）自主創新科研計劃項目（13CX02062A，24720142056A）。

劉建國（1976—），男，山東臨清人，理學博士，教授，碩士研究生導師，主要從事生物發酵工程及分離工程研究。E-mail：jianguoliu@upc.edu.cn