MRSA大鼠感染性心內膜炎模型的建立

白羽，李雪，楊信怡，李聰然，盧曦，胡辛欣，聶彤影，龐晶，王秀坤，游雪甫

論著

MRSA大鼠感染性心內膜炎模型的建立

白羽，李雪，楊信怡，李聰然，盧曦，胡辛欣，聶彤影，龐晶，王秀坤，游雪甫

目的選用 ATCC43300 標準菌株，建立 MRSA 感染的大鼠心內膜炎模型。

方法大鼠經右側頸總動脈插管至左心室，術后 24 h，尾靜脈注射 103、104和 105CFU/只感染量的 ATCC43300 菌液，分別在感染后的 1、3、5 和 7 d 處死大鼠，采集心臟贅生物、脾臟和腎臟進行菌落計數，同時設非手術感染組和手術非感染組作為對照。

結果感染 1 d 后，心臟插管大鼠瓣膜處均有贅生物形成，嚴重者甚至形成壁性贅生物，且隨感染菌濃度的增加，心內膜炎感染程度加劇。103CFU/只感染量組、104CFU/只感染量組、105CFU/只感染量組，贅生物細菌計數的對數值分別為 7.04 ± 1.38、9.32 ± 1.22、9.78 ± 1.03；感染 3 d 后，細菌性心內膜炎感染最為嚴重，細菌計數的對數值最高可達10.03 ± 0.71；隨后的 5 ～ 7 d，感染程度隨感染量均有不同程度的下降，103CFU/只感染量組和 104CFU/只感染量組，分別下降至 6.87 ± 0.63 和 8.23 ± 1.05；脾臟和腎臟的感染趨勢與心臟大致相同，但感染程度低于心臟。手術非感染組和非手術感染組則無贅生物的形成。

結論應用該方法建立的模型具有可操作性強、簡單、穩定、重復性好和成功率高的特點，更加適用于抗菌藥物機制、新藥篩選評價及心內膜炎相關性疾病的研究。

耐甲氧西林金黃色葡萄球菌；心內膜炎，細菌性；疾病模型，動物；大鼠

www.cmbp.net.cn中國醫藥生物技術， 2016， 11（4）：289-294

感染性心內膜炎（infective endocarditis，IE）是指由病原微生物直接侵犯心內膜而引起的炎癥性疾病。細菌是引發心內膜炎的主要病原微生物，因此，IE 又稱細菌性心內膜炎。近年來其發病率在國外逐年上升，與無抗生素時代相比，IE 占心內膜炎的比例已由 20% 增至 70%。而我國亦呈現穩定增長趨勢，這可能與人口老齡化造成的瓣膜退行性病變增多、人工瓣膜和心臟內裝置的應用相對廣泛、接受血液透析和牙周疾病的患者增多相關［1-4］。

IE 所致的心臟病變損害嚴重，臨床治療較困難，病死率可高達 21% ～ 35%［5］，主要致病菌為葡萄球菌、鏈球菌和腸球菌。鏈球菌是既往最常見的病原菌，而近年來金黃色葡萄球菌的感染情況最為嚴重，且隨著耐藥菌株不斷出現，耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（methicillin-resistant Staphylococcus aureus，MRSA）引起的 IE 感染情況亦不斷增長，臨床上大約 53.3% 的病例為 MRSA 感染。由MRSA 引發的 IE 病情十分兇險，從而給抗生素治療帶來挑戰。目前糖肽類抗生素——萬古霉素是MRSA 感染性心內膜炎的標準治療原則。但隨著萬古霉素在臨床應用的增加，MRSA 對萬古霉素的敏感性呈下降趨勢，臨床報道的治療失敗率較高，尚缺乏控制 IE 感染的確切治療手段［6-8］。目前，IE 臨床前研究亦需合適的動物模型。以往采用兔心內膜炎模型存在諸多缺點，因此本研究采用 MRSA 的國際標準菌株 ATCC43300 建立大鼠鞏固、穩定和重復性好的 IE 動物模型，以利于 IE 發病機制的研究及其抗耐藥菌新藥的篩選評價。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1動物SPF 級 SD 大鼠 200 只，280 ～300 g，雌雄各半，由北京維通利華實驗動物技術有限公司提供，合格證號：SCXK（京）2012-0001，飼養于中國醫學科學院醫藥生物技術研究所感染動物房。

1.1.2菌株耐甲氧西林金黃色葡萄球菌標準菌株 ATCC43300，購自美國模式菌種收集中心（ATCC），實驗室保藏。

1.1.3藥品與試劑BHI 培養基為美國 Defico公司產品；PE10 導管為美國 Smiths Medical 公司產品；營養瓊脂購自中國藥品生物制品檢定所；戊巴比妥鈉購自德國 Serva 公司。

1.1.4儀器T25 型勻漿儀為德國 IKA 公司產品。

1.2實驗方法

1.2.1大鼠心臟插管SD 大鼠，腹腔注射 1%的戊巴比妥鈉溶液（40 mg/kg），麻醉后固定于手術臺上，暴露頸部正中位置，用 75% 的酒精清理下巴到略低于胸骨的脖頸區域，用手術剪在大鼠頸部中心偏右的地方開一小口，用鑷子小心分離皮下組織及肌肉，分離出右側頸總動脈。用手術縫合線將遠心端結扎，在近心端用動脈夾夾閉，并且準備一根手術縫合線在近心端打一小結（未結扎），以便在后續過程中快速結扎，減少大鼠出血量（圖 1A）。用眼科手術剪在右側頸總動脈剪一小斜切口，插入PE10 導管（圖 1B），去掉動脈夾，將導管緩慢向前推入，直到遇到阻力。遇到阻力后，稍稍收回導管，使之插入距離為 4 ～ 4.5 cm（圖 1C）。去掉動脈夾，對近心端進行結扎和導管末端封口處理。清理手術過程中的血液之后，可以看到導管隨心臟有較強的搏動感，表明導管已進入左心室腔內。縫合手術切口，消毒后放回籠中飼養，24 h 后進行細菌感染。

1.2.2動物分組術后 24 h 的大鼠隨機分為手術感染組和手術非感染組。手術感染組即大鼠感染性心內膜炎模型組，該組大鼠進行心臟插管手術后，通過尾靜脈注射感染菌。手術非感染組，即只進行心臟插管手術，尾靜脈注射給予等量的無菌生理鹽水；同時設非手術感染組，即不進行心臟插管手術，只通過尾靜脈注射感染菌。

1.2.3細菌感染ATCC43300 菌株在 BHI 培養基中 37 ℃ 下培養 24 h，無菌生理鹽水稀釋到所需菌液濃度。手術感染組和非手術感染組大鼠分別尾靜脈注射菌液 0.5 ml/只；手術非感染組注射等量的無菌生理鹽水。

1.2.4組織菌落計數和贅生物檢查手術感染組和非手術感染組存活大鼠，分別于感染后的 1、3、5 和 7 d進行組織菌落計數和贅生物檢查。具體方法為：將大鼠腹腔注射過量的戊巴比妥鈉溶液處死，75% 酒精擦拭大鼠的腹部和胸腔，用手術剪在腹部剪一個 V 型開口，取出大鼠的脾臟和腎臟。隨后打開胸腔，小心分離出右側頸總動脈，觀察導管位置并確認導管是否插入到心臟內，順著導管的方向取出心臟，沿導管把心臟剪開，在左心室腔內、瓣膜處以及導管周圍密切觀察有無贅生物形成，挑取出贅生物（壁性贅生物）。非手術感染組若無贅生物生成，則剪取部分動脈瓣膜。凡是導管不在心臟內的一律淘汰。在無菌條件下稱取各組織和贅生物的重量，分別加入適量的無菌生理鹽水，勻漿后涂于瓊脂平板進行菌落計數。手術非感染組大鼠，于手術后第 8 天處死，采集部分動脈瓣膜、脾和腎進行菌落計數。

1.2.5模型成功評判標準在本實驗中，心內膜炎模型建立成功的評判標準主要為：①導管插入心臟后，是否可以觀察到導管規律性搏動；②動物處死剖取心臟觀察，導管前端應插入左心室腔內；③主動脈瓣應有贅生物形成。不符合標準的動物淘汰。

圖1　大鼠左心室 PE10 導管插管（A：分離右側頸總動脈，對遠心端進行結扎，在近心端用動脈夾夾閉；B：將 PE10 導管插入到頸總動脈中；C：插管示意圖）Figure 1　Cardiac catheterization involves passing PE10 catheter into the left ventricle （A： Separate the right carotid artery and tie off the artery at the exposed cephalic end， then place a clip on the artery to prevent bleeding； B： Insert a catheter with a forceps through the hole into the artery； C： Schematic diagram of intubation）

1.3統計學處理

應用 SPSS 16.0 軟件對結果進行分析，各組數值以±s 表示。各組間數據的顯著性比較，采用單因素方差分析，結合 Dunnet's test 檢驗完成。檢驗結果判定，以 P ＜ 0.05 為差異有顯著性意義，P ＜ 0.01 為差異有非常顯著意義。

2　結果

2.1手術非感染組結果

對 10 只 SD 大鼠進行心臟插管手術，不給予細菌感染，考察手術后大鼠的存活狀態及存活率。結果顯示，心臟插管后 1 d 內，動物死亡 2 只，其余動物活動基本正常；繼續觀察 7 d，再無動物死亡情況發生，且動物飲食、精神狀態佳，無明顯異常狀況，能夠正常生存。實施心臟插管手術的大鼠存活率為 80%，存活時間在 8 d 以上。心臟插管 8 d 后，大鼠經過量麻醉處死并解剖心臟觀察顯示，導管前端均插在左心室腔內；導管與心臟瓣膜無粘連，與主動脈瓣膜相連處導管周圍及主動脈瓣處無異物；左心室腔內光滑，無贅生物生長；細菌計數顯示未有細菌生長；脾臟和腎臟的勻漿液涂平皿，37 ℃ 培養 24 h，未見菌落生長。

2.2非手術感染組結果

正常大鼠尾靜脈注射不同菌液濃度的ATCC43300 進行感染，各組分別于感染后的 1、3、5 和 7 d 處死部分動物，解剖心臟觀察，對動脈瓣膜、脾臟和腎臟進行組織菌落計數，考察動物有無心臟瓣膜損傷，血液中的細菌是否引起 IE 主要受累臟器的感染。結果如表 1 所示，在各感染劑量下均未發現有心臟贅生物形成，主動脈瓣膜勻漿計數顯示無細菌感染。脾臟和腎臟組織均有不同程度的細菌檢出，組織勻漿計數顯示，各組動物脾臟和腎臟組織細菌對數值無規律性，脾臟和腎臟感染情況呈現出明顯的不穩定性。

2.3手術感染組

大鼠心臟插管手術 24 h 后，通過尾靜脈注射適量細菌感染，1 ～ 7 d 解剖檢查發現，動物的主動脈瓣膜與導管的接觸面均排列有形狀不規則和大小不等的疣狀或息肉狀贅生物，呈灰白色半透明（圖 2）；部分動物出現壁性贅生物，呈團塊狀，容易剝離，一般較主動脈瓣贅生物大，最大者幾乎占滿整個心室腔。依據模型評價標準，提示建模成功。分別觀察 1、3、5 和 7 d 后的感染情況。結果如表 2 所示，動物處死后解剖心臟觀察，各感染劑量組動物皆在感染 1 d 后有明顯的贅生物形成。組織勻漿計數顯示，心臟贅生物、脾臟和腎臟組織中均有細菌檢出。

103CFU/只感染量組，感染 1 d 后心臟贅生物細菌計數的對數值為 7.04 ± 1.38，感染 3 d 時心臟贅生物中細菌計數的對數值升高達到 8.85 ± 1.81，感染 5 ～ 7 d，心臟贅生物中細菌數隨時間緩慢降低。該劑量組中，脾臟和腎臟相同，即感染 3 d 組織中細菌數達最高值，隨后緩慢降低。

104CFU/只感染量組，感染 1 d 后心臟贅生物細菌計數的對數值為 9.32 ± 1.22，3 d 后達最高值10.03 ± 0.71，隨后的感染 5 ～ 7 d 內心臟贅生物中細菌數稍有下降。該劑量組中，脾臟組織細菌計數數值趨勢與心臟贅生物細菌計數數值趨勢相同，感染 3 d 組織中細菌數達最高值，感染 5 ～ 7 d 后數值皆有所降低，隨后趨于平穩，而腎臟組織細菌計數對數值基本維持在 5 左右。

表1　非手術感染組脾臟和腎臟重量及組織菌落計數結果（n = 6）Table 1　Weights of spleen and kidney in the non surgical infection groups and the results of the colony counts （n = 6）

圖2　解剖顯示心臟插管位置（A）及心臟贅生物（B）Figure 2　Cardiac anatomy showed that the catheter was in the correct place （A） and numerous vegetations were visible around the aortic valves （B）

表2　手術感染組脾臟和腎臟重量及組織菌落計數結果（n = 6）Table 2　Weights of spleen and kidney in the surgical infection groups and results of the colony counts （n = 6）

105CFU/只感染量組，感染 1 d 心臟贅生物細菌計數的對數值為 9.78 ± 1.03，感染 3 d 時，其值高達 9.95 ± 0.59，并有動物陸續出現死亡；部分死亡大鼠解剖心臟，大體觀察顯示，贅生物充滿整個左心室腔。感染 5 d 后動物死亡率為 100%；感染1 d 和 3 d 脾臟和腎臟組織細菌計數對數值皆為6 左右。

統計顯示，在感染天數為 1d 情況下，與103CFU/只感染量組相比，其他兩個感染劑量組的贅生物、脾臟和腎臟中感染細菌對數值皆明顯升高（P ＜ 0.05）。

3　討論

感染性心內膜炎主要表現為附著在心內膜表面的大小不等且形狀不一的贅生物，該贅生物是包含大量微生物和少量炎癥細胞的血小板和纖維素團塊，瓣膜為最常受累部位。研究表明，雖然健康的心臟血管內皮細胞可以抵抗菌血癥，但是當心內膜損傷后，炎性細胞因子和組織相關纖維蛋白因子的釋放，導致了血小板纖維蛋白血栓的形成，從而使菌落更加容易黏附［9］。心臟瓣膜硬化、風濕性心內膜炎或者菌血癥（特別是金黃色葡萄球菌）是導致心內膜受損的主要原因［10］。黏附蛋白如纖連蛋白結合蛋白和葡萄球菌凝集因子 A 和 B 是細菌黏附的介質，同時也是細菌致病性的決定性因素。細菌定植引起內皮損傷和血栓沉積，最終形成贅生物。生物膜的產生（含多糖和蛋白質基質的多層細菌團）可以協助細菌抵抗抗生素，增加治療難度［11］。根據病程長短，IE 分為急性和亞急性，亞急性 IE主要發生于器質性心臟病，為病程長的慢性持續性感染。急性 IE 多由致病菌感染受損的心內膜引發，病程進展迅速，瓣膜破壞嚴重，感染遷移多見。

IE 為威脅生命的嚴重感染，即便是醫學發展到目前這個高度來講，病死率相對其他疾病仍較高。隨著耐藥菌株的出現，尤其是 MRSA 的感染情況不斷增長，難以控制的 IE 感染更加成為棘手問題。目前，MRSA 感染的心內膜炎藥物治療效果不佳，失敗率較高，耐萬古霉素的耐藥菌株的出現也給治療帶來了巨大的阻力。利用感染性動物模型可以為人類心內膜炎疾病研究和治療提供良好工具。建立合適的 IE 動物模型，用于 IE 發病機制研究、評價和篩選新藥，大大推動我國的抗菌藥物體內研究和新藥的發現。

適宜動物種類的選擇是模型建立成功的關鍵，家兔、大鼠和小鼠皆可用于 IE 感染模型研究。以往 IE 動物模型均采用家兔，家兔模型插管手術容易操作，但經濟成本高，不適用于大規模的實驗研究。而體型小、價格低廉的大、小鼠則更加實用。小鼠經濟實惠，可以降低科研經費和飼養費，但小鼠頸動脈細小，需要借助體視鏡進行心臟插管，手術難度較大，動物意外死亡率高，造模成功率較低，且造模成功的動物心臟內的贅生物微小不易分離。大鼠 IE 是一種急性和亞急性復合的感染性動物模型，能夠很好地模擬人類自身瓣膜性心內膜炎。

本研究顯示，采用 PE10 進行大鼠心臟插管，手術操作方便，造模速度快，動物意外死亡率低，手術成功率高。只進行心臟插管手術不給予ATCC43300 感染菌的動物，術后 1 ～ 7 d 內其心臟無贅生物生長，心臟以及脾臟和腎臟均無細菌感染情況發生，說明大鼠心臟瓣膜創傷性損傷在體內無致病菌感染的情況下，不引起 IE 的發生。無心臟瓣膜插管損傷的正常動物，靜脈給予不同濃度感染菌，亦不能引起 IE。脾臟和腎臟組織均有細菌感染，但感染劑量組之間比較，感染情況不穩定、無規律性，主要由于不同動物的免疫狀態存在差異導致。術后 24 h 給予 ATCC43300 感染菌，103CFU/只和 104CFU/只感染量組的動物均能存活 7 d以上；105CFU/只感染量組動物能存活 3 d，而后動物因 IE 感染情況嚴重，出現急性 IE 感染死亡。各組感染量雖不同，感染 1 d 后均可出現不同程度的主動脈瓣贅生物，甚至出現壁性贅生物，與人類急性心內膜炎感染的贅生物特征相符，且隨感染菌濃度和時間的增加，心內膜炎感染程度加劇；感染 3 d 后，各感染量的動物心臟瓣膜細菌感染均達最高。隨后的 5 ～ 7 d，大鼠心內膜炎的感染程度隨感染量不同有所變化，103CFU/只和104CFU/只感染量組的動物心內膜炎的感染程度逐漸降低，105CFU/只感染量組的動物因 IE 感染嚴重而全部死亡。各感染量下的動物，脾臟和腎臟的感染情況與心臟相似。說明 103～ 105CFU/只的感染量，均可形成大鼠 MRSA 急性 IE 模型，應用中可根據具體情況選擇合適感染量。

總之，本實驗經心臟插管后尾靜脈注射ATCC43300 菌株，103、104和105CFU/只感染濃度均可成功建立 MRSA 大鼠 IE 模型。該模型制作具有贅生物明顯、易于操作、穩定、重復性好和成功率高的優點。在該模型的實際應用中，可根據不同的實驗目的，選擇適宜的感染濃度以建立實用的感染模型，使其更接近于臨床患者的 IE 感染狀況。MRSA 大鼠 IE 模型的成功建立，有助于在細菌耐藥機制、IE 病理機制和抗菌藥物的篩選評價等方面取得研究進展，以應對日趨復雜的臨床耐藥感染狀況，為人類心內膜炎相關疾病研究和防治提供實驗性參考。

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【Abstract】

ObjectiveTo establish an rat model of Staphylococcus aureus （MRSA） infected endocarditis（IE）by using the ATCC43300 standard strains.

MethodsValve trauma was produced by introduction of an indwelling PE10 catheter into the aortic valve via the left carotid artery. After operation， the ATCC43300 standard strains were injected into the lateral tail vein within 24 hours， and the rats were sacrificed at day 1， 3， 5 and 7 post-infection， examined and removed vegetations from the valve as well as kidney and spleen for quantitative culture. The non surgical infection groups and non infection groups were also set in this experiment.

ResultsDay one after infection， there were different size of valvular vegetations around cardiac catheterization， and even the wall vegetations were found in the serious MRSA infectious rats. IE in the rats were even worse along with increase of the concentration. Log CFU/g of vegetation in infection groups of 103CFU/animal， 104CFU/animal and 105CFU/animal was 7.04 ± 1.38， 9.32 ± 1.22 and 9.78 ± 1.03， respectively. IE was most serious at day 3 post-infection， and the highest log CFU/g could reach 10.03 ± 0.71. Within 5 - 7 days， the degrees of IE varied in different groups， and log CFU/g of vegetation in infection groups of 103CFU/animal and 104CFU/animal declined to 6.87 ± 0.63 and 8.23 ± 1.05， respectively. The trends of infection in the spleen and kidney were roughly the same as in the heart， but the colony counts were all lower than those of the heart. There were no vegetations in non surgical infection groups and non infection groups.

ConclusionThe model established by this method has high maneuverability， simplicity， stability， repeatability and success rate. It shows promise in evaluating the predictive efficacy of antibiotics for MRSA infected endocarditis.

Author affiliation： Department of Pharmacology， Institute of Medicinal Biotechnology， Chinese Academy of Medical Sciences & Peking Union Medical College， Beijing 100050， China

Corresponding Authors： WANG Xiu-kun， Email： xiukunwang@139.com； YOU Xue-fu， Email： xuefuyou@sohu.com

www.cmbp.net.cnChin Med Biotechnol， 2016， 11（4）：289-294

Establishment of MRSA infected endocarditis model in rats

BAI Yu， LI Xue， YANG Xin-yi， LI Cong-ran， LU Xi， HU Xin-xin， NIE Tong-ying， PANG Jing， WANG Xiu-kun， YOU Xue-fu

Methicillin-resistant staphylococcus aureus；Endocarditis， bacterial；Disease models， animal；Rats

10.3969/j.issn.1673-713X.2016.04.001

“十二五”國家科技重大專項（2012ZX09301002-001、2012ZX09301002-005、2014ZX09507009-012）；北京市重點實驗室科技創新基地培育與發展工程（Z141102004414065）；高等學校博士學科點專項科研基金（20121106120027）

100050 北京，中國醫學科學院北京協和醫學院醫藥生物技術研究所藥理室

王秀坤，Email：xiukunwang@139.com；游雪甫，Email：xuefuyou@sohu.com

2016-03-14