苦豆子總堿對糖尿病性膀胱病大鼠逼尿肌活動的影響*

李　妍，孫　安，牛彩琴（.靜寧縣人民醫(yī)院，甘肅平?jīng)?43400；.蘭州軍區(qū)空軍機關(guān)醫(yī)院特診科，甘肅蘭州73000；3.川北醫(yī)學(xué)院中西醫(yī)臨床醫(yī)學(xué)系，四川南充637007）

苦豆子總堿對糖尿病性膀胱病大鼠逼尿肌活動的影響*

李妍1，孫安2，牛彩琴3△
（1.靜寧縣人民醫(yī)院，甘肅平?jīng)?43400；2.蘭州軍區(qū)空軍機關(guān)醫(yī)院特診科，甘肅蘭州730020；3.川北醫(yī)學(xué)院中西醫(yī)臨床醫(yī)學(xué)系，四川南充637007）

目的觀察苦豆子總堿（TASa）對糖尿病性膀胱病（DCP）大鼠膀胱逼尿肌活動的影響。方法（1）采用鏈脲佐菌素法建造糖尿病模型；（2）測定尿流動力學(xué)指標(biāo)確立DCP模型；（3）采用恒溫灌流浴槽，將大鼠膀胱逼尿肌離體肌條標(biāo)本分為對照組（正常肌條，12份）和DCP模型組（DCP肌條，72份），再將DCP模型組分為TASa組、TASa聯(lián)合異搏定（維拉帕米）組、TASa聯(lián)合酚妥拉明組、TASa聯(lián)合苯海拉明組、TASa聯(lián)合消炎痛（吲哚美辛）組和TASa聯(lián)合阿托品組，各12份。探討TASa對DCP逼尿肌自發(fā)收縮的影響。結(jié)果TASa能增強DCP膀胱逼尿肌自發(fā)收縮的振幅，并具有量效依賴性（r=0.89，t=3.39，P＜0.05）；用線性回歸法計算半數(shù)有效濃度為23.79 mg/L；但對頻率［DCP模型組為（4.48±0.17）次/分，TASa組為（4.50±0.09）次/分］無明顯影響，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；異搏定能明顯抑制TASa收縮膀胱逼尿肌的作用，而阿托品、酚妥拉明、苯海拉明和消炎痛無影響。結(jié)論TASa可能是激活鈣離子通道而增加DCP大鼠膀胱逼尿肌的收縮。

苦豆子；生物堿類；膀胱疾病；糖尿病并發(fā)癥；尿動力學(xué)；逼尿肌

糖尿病性膀胱病（diabeticcystopathy，DCP）是糖尿病（diabetes mellitus，DM）常見慢性并發(fā)癥之一，發(fā)病率為40%～80%，有膀胱充盈的感覺障礙、膀胱容量增大、逼尿肌收縮無力和殘余尿量增加及尿急、尿失禁等相應(yīng)癥狀［1-3］。目前認(rèn)為，可能是支配膀胱的神經(jīng)、逼尿肌細(xì)胞、膀胱上皮功能障礙及由腺苷二磷酸-核糖聚合酶（adp-ribose-polymerase，ADP）參與逼尿肌細(xì)胞凋亡等多因素共同作用的結(jié)果［4］。臨床對DCP仍缺乏有效的治療方法，且對DM的治療也未減少其發(fā)病率。苦豆子總堿（total alkaloids of sophora alopecuroids，TASa）是從中藥苦豆子干燥全草和種子提取的總生物堿，具有清熱解毒、祛風(fēng)燥濕作用［5］，能增加正常膀胱逼尿肌、子宮、膽囊和胃腸平滑肌的收縮［6-9］。但對DCP模型大鼠膀胱逼尿肌的影響尚鮮見文獻報道。本研究將DCP逼尿肌離體肌條置于灌流浴槽，觀察TASa對DCP膀胱逼尿肌活動的影響。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1動物選取清潔級健康成年Wistar大鼠40只，體質(zhì)量200～250 g，雌雄不拘，由蘭州大學(xué)實驗動物中心提供，合格證號：醫(yī)動字第14-006號。

1.1.2藥品與試劑TASa購于蘭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院，批號20040301，TASa≥95%，用生理鹽水配制成5、10、20、40、80 mg/L備用，用碳酸氫鈉配制為pH 7.4；異搏定（verapamil，Vera，維拉帕米）和阿托品（atropine，A-tro）均購于上海禾豐制藥有限公司，批號分別為00701、000916；苯海拉明（benzhydramine，Denz）購于江蘇興化制藥廠，批號 00032331；酚妥拉明（phetolamine，Phet）、消炎痛（indomethacin，Indo，吲哚美辛）和鏈脲佐菌素（streptozotocin，STZ）均購于Sigma公司，批號分別為20000502、01595、S0130；Krebs-Henseleit（K-H）液等其他試劑均為化學(xué)分析純。

1.1.3儀器6套離體恒溫灌流肌槽（蘭州大學(xué)化學(xué)系玻璃儀器廠）、2臺IBM電腦［內(nèi)置Biolap410（BL-410）智能型生物信號處理系統(tǒng)（成都泰盟電子有限公司）］、張力傳感器（JH-2，中國北京航天醫(yī)學(xué)工程研究所）、One Touch Horion血糖儀、血糖紙（深圳強生醫(yī)療器材有限公司）、721分光光度儀（上海天普分析儀器有限公司）、PX359-300A5V型生理壓力傳感器（美國Omega公司）、WZ-50C6型微量灌注泵（美國Smith公司）等。

1.2方法

1.2.1建立DM動物模型將40只Wistar大鼠隨機分為對照組（正常大鼠10只）和模型組（DM大鼠30只），實驗前禁食18～24 h，飲水不限。對照組一次性腹腔注射0.1 mmol/L檸檬酸緩沖液2 mL/kg；模型組一次性腹腔注射用0.1 mmol/L檸檬酸緩沖液配置的2%STZ 60 mg/kg。3 d后禁食，不禁飲6 h，采尾血測空腹血糖，以血糖持續(xù)1周大于或等于16.9 mmol/L為DM模型造模成功［10-12］。

1.2.2確立DCP動物模型DM造模10周后測兩組大鼠尿流動力學(xué)和膀胱濕質(zhì)量。用戊巴比妥鈉（35 mg/kg）腹腔麻醉，仰臥固定，下腹正中切開暴露膀胱；用6號注射針頭經(jīng)膀胱頂部穿刺置入PE-50導(dǎo)管。膀胱內(nèi)導(dǎo)管經(jīng)三通閥分別與PX359-300A5V型生理壓力傳感器和WZ-50C6型微量灌注泵相連，近膀胱入口處切斷雙側(cè)輸尿管并結(jié)扎遠(yuǎn)端。平衡30 min吸盡膀胱內(nèi)尿液后再緩慢灌注無菌生理鹽水（0.08 mL/min）。記錄膀胱容量、順應(yīng)性、膀胱內(nèi)最大壓力和殘余尿量。參照大鼠不穩(wěn)定膀胱判定標(biāo)準(zhǔn)，在膀胱低壓充盈期出現(xiàn)膀胱內(nèi)壓升高超過15 cm H2O（1 cm H2O=0.098 kPa）即為不穩(wěn)定膀胱［13-14］。根據(jù)尿流動力學(xué)檢測結(jié)果，若逼尿肌順應(yīng)性增大、殘余尿增多、最大膀胱容量增大、逼尿肌收縮減弱則確立為DCP造模成功。

1.2.3離體肌條的制備測完尿流動力學(xué)指標(biāo)和稱質(zhì)量后切取縱行肌條（6 mm×2 mm）標(biāo)本36份，置于37℃恒溫灌流浴槽，并通入95%氧和5%二氧化碳?xì)怏w，記錄肌條的活動［6-9］。

1.2.4離體肌條標(biāo)本的分組及處理

1.2.4.1TASa對DCP逼尿肌肌條收縮的影響取正常肌條標(biāo)本12份作為對照組，DCP肌條標(biāo)本24份分別作為DCP模型組和TASa組，各12份。對照組、DCP模型組加等量生理鹽水，TASa組每2分鐘累積加入TASa使其終質(zhì)量濃度為（5、10、20、40、80 mg/L），測量肌條的活動。

1.2.4.2阻斷劑對TASa增強DCP肌條收縮的影響取DCP肌條標(biāo)本72份，分為TASa組、TASa聯(lián)合Vera （10-7mg/L）組、TASa聯(lián)合Phet（10-6mg/L）組、TASa聯(lián)合Denz（10-6mg/L）組、TASa聯(lián)合Indo（10-6mg/L）組和TASa聯(lián)合Atro（10-6mg/L）組，各12份。向浴槽分別加入阻斷劑溫育2min后，再依次加入TASa（20mg/L），測量其變化。

1.2.5觀測指標(biāo)采用One Touch Horion血糖儀測大鼠尾血空腹血糖。記錄膀胱容量（至排尿時所灌注的生理鹽水量）、膀胱內(nèi)最大壓力（排尿時膀胱內(nèi)最大壓力的峰值）、殘余尿量（排尿后經(jīng)膀胱內(nèi)導(dǎo)管吸出的剩余生理鹽水量）、逼尿肌順應(yīng)性（膀胱容量改變與壓力改變比值（△V/△P）等。測量給藥后2 min離體肌條收縮振幅（g）和頻率（次/分），計算每分鐘收縮波的次數(shù)。

1.3統(tǒng)計學(xué)處理應(yīng)用SPSS11.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析，計量資料以x±s表示，采用t檢驗，多組之間比較采用方差分析；采用線性回歸法計算半數(shù)有效濃度（EC50）。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2　結(jié)　果

2.1DM動物模型造模3 d后DM組大鼠空腹血糖為（30.50±0.76）mmo/L，始終維持在16.7 mmol/L以上，對照組大鼠血糖為（5.54±0.27）mmo/L，低于7.0 mmo/L，兩組大鼠空腹血糖比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=24.18，P＜0.01）。10周后DM組大鼠體質(zhì)量［（216±4）g］明顯低于對照組［（473±9）g］，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=22.78，P＜0.01）。

2.2DCP動物模型DCP組大鼠膀胱質(zhì)量、容量、最大壓力、剩余尿量和順應(yīng)性明顯高于對照組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01），見表1。

表1　兩組大鼠膀胱質(zhì)量和尿流動力學(xué)檢測指標(biāo)比較（±s）

表1　兩組大鼠膀胱質(zhì)量和尿流動力學(xué)檢測指標(biāo)比較（±s）

注：與對照組比較，aP＜0.01。

組別n　膀胱質(zhì)量（m g）膀胱容量（m L）剩余尿量（m L）順應(yīng)性（m L / c m H2O）對照組D C P模型組1 0 3 0 9 1 . 5 0 ± 1 4 . 3 2 2 3 7 . 8 3 ± 3 2 . 0 7a膀胱最大壓力（c m H2O ）1 . 1 1 ± 0 . 2 1 3 . 1 5 ± 0 . 4 1a6 2 . 5 6 ± 1 0 . 8 2 7 3 . 8 6 ± 9 . 7 1a0 . 0 5 ± 0 . 0 1 0 . 4 8 ± 0 . 0 5a0 . 0 5 ± 0 . 0 1 0 . 1 5 ± 0 . 0 3a

2.3TASa、阻斷劑對DCP逼尿肌收縮的影響TASa能增加DCP大鼠逼尿肌收縮的振幅和頻率，且振幅具有量效依賴性（r=0.89，t=3.39，P＜0.05）；Vera能明顯抑制TASa收縮逼尿肌的作用，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）；Phet、Denz、Atro、Indo則對TASa收縮逼尿肌的興奮作用無影響，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），見圖1～3、表2。

圖1　對照組大鼠膀胱逼尿肌的活動

圖2　TASa對DCP大鼠膀胱逼尿肌活動的影響

圖3　TASa對DCP大鼠膀胱逼尿肌活動的影響

表2　阻斷劑對TASa增強DCP大鼠逼尿肌的影響（±s）

表2　阻斷劑對TASa增強DCP大鼠逼尿肌的影響（±s）

注：與對照組比較，aP＜0.01；與DCP模型組比較，bP＜0.01；與TASa組比較，cP＜0.01。

組別n 阻斷劑（m g / L ）T A S a （m g / L）　振幅（g）　頻率（次/分）對照組D C P模型組T A S a 組T A S a聯(lián)合V e r a 組T A S a聯(lián)合P h e t 組T A S a聯(lián)合I n d o 組T A S a聯(lián)合D e n z 組T A S a聯(lián)合A t r o 組1 2 1 2 1 2 1 2 1 2 1 2 1 2 1 2 0 0 0 1 0-71 0-61 0-61 0-61 0-60 . 0 0 . 0 2 0 . 0 2 0 . 0 2 0 . 0 2 0 . 0 2 0 . 0 2 0 . 0 1 . 0 6 ± 0 . 0 2 0 . 6 5 ± 0 . 0 3a0 . 8 9 ± 0 . 0 5b0 . 6 1 ± 0 . 0 3c0 . 9 2 ± 0 . 0 7 0 . 8 3 ± 0 . 0 4 0 . 8 9 ± 0 . 0 7 0 . 8 2 ± 0 . 0 6 5 . 1 4 ± 0 . 0 6 4 . 4 8 ± 0 . 1 7a4 . 5 0 ± 0 . 0 9 4 . 6 0 ± 0 . 1 1 4 . 7 7 ± 0 . 1 1 4 . 6 8 ± 0 . 1 2 4 . 5 2 ± 0 . 0 9 4 . 7 6 ± 0 . 1 2

3　討　論

DCP是DM常見慢性并發(fā)癥之一。其機制可能是支配膀胱的神經(jīng)、逼尿肌細(xì)胞、膀胱上皮功能障礙及由ADP參與逼尿肌細(xì)胞凋亡等多因素共同作用的結(jié)果［4］。本研究采用STZ法建立DM模型10周后測的膀胱質(zhì)量、膀胱容量、順應(yīng)性、膀胱內(nèi)最大壓力和殘余尿量尿流動力學(xué)指標(biāo)，與對照組比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），說明模型大鼠膀胱達到不穩(wěn)定膀胱標(biāo)準(zhǔn)，表明DCP造模成功。該法經(jīng)濟簡單、重復(fù)性好、成功率高，是值得推廣的造模法。

DCP患者尿急、尿失禁等癥狀主要是由于膀胱逼尿肌收縮功能不良所致，治療以改善逼尿肌收縮功能為主。鈣離子在促進平滑肌收縮中具有核心作用，即細(xì)胞內(nèi)游離鈣離子升高是啟動平滑肌興奮-收縮偶聯(lián)的關(guān)鍵，鈣離子通過受體依賴性鈣通道和電壓依賴性鈣通道進入細(xì)胞內(nèi)而升高細(xì)胞質(zhì)中游離鈣離子水平，鈣離子與鈣調(diào)蛋白（calmodulin，CaM）結(jié)合，生成鈣離子-CaM復(fù)合物，激活肌球蛋白輕鏈激酶，進而提高橫橋腺苷三磷酸酶活性而促進肌肉收縮。細(xì)胞外鈣離子主要通過L-型電壓依賴性鈣通道進入細(xì)胞內(nèi)，該通道常隨動作電位的發(fā)生而開放［15］。本研究應(yīng)用L-型電壓依賴性鈣通道阻斷劑——Vera后TASa增強逼尿肌的作用明顯減弱，說明TASa主要通過增強L-型電壓依賴性鈣通道活性，促使鈣離子內(nèi)流而提高逼尿肌收縮能力。有研究提示，TASa也可升高膽囊和胃竇平滑肌細(xì)胞內(nèi)鈣離子水平而加強平滑肌的收縮［6-9］，與本研究結(jié)果一致。

G蛋白偶聯(lián)受體是形成膜信號蛋白的主要組成之一，其受體結(jié)構(gòu)和功能得到了充分證明，有助于進一步了解藥物的作用機制。細(xì)胞膜上M受體尤其是M2、3和α1受體均屬于G蛋白偶聯(lián)受體，前者主要屬于Gp/s，后者則主要為Gq/11，2種受體與激動劑結(jié)合后可激活G蛋白生成三磷酸肌醇與二酰甘油，進而使胞內(nèi)鈣離子增加，增強平滑肌收縮活動。本研究應(yīng)用M受體阻斷劑——Atro溫育肌條后對TASa增加DCP逼尿平滑肌的收縮作用無影響，說明TASa增加DCP逼尿平滑肌的收縮作用與M受體無關(guān)。

本研究還應(yīng)用Phet、Denz、Indo溫育肌條后對TASa增加收縮的作用也無影響，表明TASa作用與α、H受體和前列腺素受體無關(guān)。與文獻［6-9］報道的TASa加強膽囊和胃竇等平滑肌的收縮作用與M受體、H受體、壁內(nèi)神經(jīng)節(jié)受體、α受體和前列腺素受體可能無關(guān)的結(jié)果一致。

綜上所述，本研究表明，TASa能激活平滑肌細(xì)胞膜上鈣通道，升高細(xì)胞內(nèi)鈣離子水平，提高膀胱逼尿肌收縮功能，為許多膀胱逼尿肌功能失調(diào)性疾病的治療提供了理論指導(dǎo)。TASa可增加機體對氧自由基的清除［16］，從而促進膀胱逼尿肌功能的恢復(fù)，也可結(jié)合中醫(yī)辨證施治，以便找到更安全、有效、經(jīng)濟的改善膀胱逼尿肌功能的中藥。

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Effects of total alkaloid of sophora alopecuroids on bladder detrusor muscle activity in diabetic cystopathy rats*

Li Yan1，Sun An2，Niu Caiqin3△（1.Jingning County People′s Hospital，Pingliang，Gansu 743400，China；2.Department of Special Diagnosis，Institution Hospital of Lanzhou Military Region，Lanzhou，Gansu 730020，China；3.Department of Clinical Medicine of Integrated Chinese and Western Medicine，North Sichuan Medical College，Nanchong，Sichuan 637007，China）

ObjectiveTo observe the influence of the total alkaloid of sophora alopecuroids L（TASa）on bladder detrusor muscle activity in diabetic cystopathy（DCP）rats.Methods（1）The diabetic rat model was established by adopting streptozotocin（STZ）；（2）the urodynamic indicators were detected for establishing the DCP model；（3）the constant temperature perfusion bath tank was adopted to divide the isolated bladder detrusor muscle strips into the control group（normal muscle strip，12 samples）and DCP model group（DCP muscle strip，72 samples），then，the DCP group was subdivided into the TASa group，TASa combined verapamil group，TASa combined phentolamine group，TASa combined indometacin group and TASa combined with atropine group，12 samples in each group.The influence of TASa on the spontaneous contraction of DCP detrusor muscle was investigated. ResultsTASa could increase the contraction amplitude of bladder detrusor musclen with dose-effect dependence（r=0.89，t=3.39，P＜0.05）.The 50%effective concentration（EC50）calculated by using the linear regression method was 23.79 mg/L；but which had no influence on frequency［（4.48±0.17）times/min in DCP model group，（4.50±0.09）times/min in TASa group］，the difference was not statistically significant（P＞0.05）.Verapamil could significantly inhibit the TASa action for contracting bladder detrusor muscle，but atropine，phetolamine，benzhydramine and indomethacin had no influence.ConclusionTASa may activate calcium ion channel to increase contraction of bladder detrusor muscle.

Sophora alopecuroides；Alkaloids；Urinary bladder diseases；Diabetes complications；Urodynamics；Detrusor muscle

10.3969/j.issn.1009-5519.2016.06.004

A

1009-5519（2016）06-0811-03

四川省教育廳重點項目（14ZA0182）。

李妍（1971-），主管藥師，主要從事臨床藥理研究工作。

△，E-mail：niucaiqin@126.com。

（2015-12-02）