左苯丙胺在多巴胺第三受體分子通道中傳輸分子動力學模擬

謝　煒　徐澤人　王　明　徐四川(云南大學化學科學與工程學院，自然資源藥物化學教育部重點實驗室，昆明650091)

左苯丙胺在多巴胺第三受體分子通道中傳輸分子動力學模擬

謝煒徐澤人王明徐四川*
(云南大學化學科學與工程學院，自然資源藥物化學教育部重點實驗室，昆明650091)

左旋苯丙胺(又稱左苯丙胺，RAT)在臨床上被用于治療多種病癥，作用在中樞神經細胞多巴胺受體上，同時它具有依賴性和成癮性。為了探討RAT被用作藥物的藥理和成癮機制，本文用分子模擬獲得RAT與多巴胺第三受體(D3R)復合蛋白優化結構，并且采用傘形樣本平均力勢(PMF)方法和卵磷脂脂質分子模擬生物膜，采用分子動力學模擬獲得RAT在D3R結構中分子通道運動軌跡和自由能變化。RAT通過D3R結構中的功能分子通道，朝細胞外方向傳輸運動的自由能變化為91.4 kJ?mol－1。RAT通過D3R結構中的保護分子通道，朝細胞雙層膜方向傳輸運動的自由能變化為117.7 kJ?mol－1。自由能數值表明RAT分子更容易通過D3R結構中的功能分子通道，發揮其功能作用，增大功能多巴胺分子的釋放，導致包括依賴性和成癮性多種功能效果。研究結果證明RAT被用作藥物的藥理和成癮機制與它在多巴胺受體中的分子通道上傳輸動力學和機制有密切關聯。

左苯丙胺；多巴胺第三受體；1-棕櫚酰基-2-油酰基卵磷脂；分子動力學模擬；自由能

[Article]

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1　引言

左旋苯丙胺(又稱左苯丙胺，RAT)，分子結構顯示在圖1中，是一種中樞興奮藥，作用在中樞神經細胞多巴胺受體上。在臨床上，左苯丙胺被用于治療發作性睡病、麻醉及其它中樞抑制藥中毒、精神抑郁癥等。同時，左苯丙胺具有精神愉快的作用，濫用可引起依賴性和成癮。

中樞神經細胞中的多巴胺受體膜蛋白有5種亞型，都是由七個跨膜區域(7-GM,or TM)組成的G蛋白偶聯受體家族。20世紀90年代初，隨著生物學克隆技術的發展，相繼克隆了5種亞型多巴胺受體分子，分別為D1R、D2R、D3R、D4R和D5R1－5。其中，D2R、D3R、D4R屬于D2樣受體，而D1樣受體包括D1R和D5R。D1R、D2R腦內含量豐富，研究比較多，對其生理功能意義的了解也比較多6。而腦內含量遠低于前兩者的亞型受體D3R、D4R和D5R，目前對于它們的結構、功能和藥物是研究的重點7－9。因為不同亞型多巴胺受體調控多巴胺，與生物體的運動功能、認知活動和藥物成癮等生理、病理過程有關，因此精神分裂癥、帕金森病的病理以及成癮機制都與多巴胺系統密切相關10－13。

圖1　左苯丙胺分子結構Fig.1　Molecular structure of L-benzedrine(RAT)

在人腦組織中，存在著數千億個神經細胞，左苯丙胺分子通過細胞膜滲透進入神經細胞內，類似于在神經細胞里生產的多巴胺分子，只有通過定向跨膜傳遞，才能發揮其功能作用。由于神經細胞與神經細胞之間存在間隙，左苯丙胺分子通過神經細胞上突出的小山崖名叫突觸(synapse)，就像兩道山崖中的一道縫，跳過這道縫傳遞過去才能發揮功能作用。突觸主體成分包括各種亞類型的多巴胺受體。而在多巴胺受體蛋白結構內部中存在分子通道14－16。分子通道分為兩類，分別是：(1)功能分子通道，起著傳遞分子，發揮功能作用的通道；(2)保護分子通道，防止過量分子發揮功能，免遭分子破壞作用，起著保護機體功能作用的通道14－16。既然左苯丙胺作用在中樞神經細胞多巴胺受體上，它也應該通過多巴胺受體功能分子通道發揮功能作用，或者通過保護分子通道，防止過量分子發揮功能作用。因此，研究左苯丙胺在多巴胺受體分子通道上的傳輸運動，有助于理解左苯丙胺作用在中樞神經細胞多巴胺受體中的藥理機制和動力學。

本文采用左苯丙胺在多巴胺受體分子通道上運動自由能變化來表征其傳輸運動。多巴胺受體分子通道上運動自由能改變值可以通過實驗測定和分子動力學模擬獲得。我們基于多巴胺第三受體蛋白結構和POPC磷脂雙層膜，采用最新的分子動力學模擬技術，研究獲得左苯丙胺在多巴胺第三受體蛋白結構中的分子通道上運動過程中自由能變化數值，探討左苯丙胺在分子通道上傳輸運動機制和動力學。

圖2　(A)多巴胺第三受體突變體復合蛋白晶體結構圖; (B)人體生物型多巴胺與多巴胺第三受體復合蛋白結構Fig.2　(A)Original graph of mutated protein crystal structure of dopamine third receptor;(B)human′s dopamine third receptor complex structure with dopamine

2　材料與方法

由于多巴胺膜蛋白穩定性和結晶性問題，目前只有多巴胺第三受體(D3R)膜蛋白晶體結構被報道，蛋白晶體編號為3PBL17－21。事實上，3PBL蛋白晶體只能被認為是一個D3R突變體蛋白晶體，因為在該蛋白中，存在著多點突變，是為了獲得穩定的D3R蛋白晶體，另外還外聯一些基團，如圖2 (A)中右下角部分所示，并且添加了拮抗試劑分子，進一步穩定D3R膜蛋白晶體。

為了獲得人體生物原型的D3R蛋白結構，在我們先前的研究工作22中，基于3PBL晶體的D3R突變體蛋白結構，采用對接技術和分子動力學模擬研究獲得多巴胺(DA)與D3R復合蛋白結構，結構圖顯示在圖2(B)中。由于5種亞型多巴胺受體具有很高的同源性，D3R蛋白結構可以作為多巴胺受體的代表，用于研究左苯丙胺在多巴胺受體蛋白結構中的分子通道上運動過程中自由能變化。因此，先前我們報道的多巴胺與D3R復合蛋白結構22，作為本文研究的初始結構材料。

生物膜是膜蛋白結構穩定性的重要外部條件。類似于以前我們的研究工作22，本文也是采取含量最多的一種磷脂酰膽堿分子，1-棕櫚酰基-2-油酰基卵磷脂(POPC)分子，構建生物雙層膜。在POPC尾端中含有未飽和的C＝C雙鍵，與飽和尾端磷脂脂質分子相比，被優先選用于模擬生物細胞膜23－38。我們選用POPC磷脂質分子構建POPC膜-水模型是文獻39,40報道的，內含128個POPC分子23，水分子是SPC模型水。

2.1RAT分子與D3R對接

分子對接類似于文獻報道的方法和步驟，采用MP2/6-31G(d,p)優化了RAT分子結構41，應用Dock6程序將其對接到D3R蛋白中取代其中的多巴胺分子42。

2.2D3R-RAT復合蛋白結構分子動力學模擬

通過對接獲得的D3R-RAT復合蛋白，采用相同于文獻已經報道的步驟鑲嵌到POPC膜-水模型中22。采用Gromacs 4.5.3程序結合VMD程序分析D3R-RAT-POPC-H2O系統43－50。分子動力學模擬步驟也類似于我們先前的工作43－46,51。RAT分子力場參數采用Gromos 96力場格式自己設定(設定的參數附在Supporting Information里)52,53，POPC分子力場參數源自文獻23。用鈉離子中和體系電荷，因此體系含有2個Na+，10255個H2O，85個POPC分子，279個殘基和1個RAT分子，共37936個原子。先用最陡下降法進行40000步(Fmax<100 kJ?mol－1?nm－1)能量優化來排除體系原子坐標重疊問題，然后在允許水分子移動的情況下，采用LINCS算法約束進行200 ps的模擬。應用周期邊界條件于體系，分子動力學模擬時間是10 ns，每步2 fs時長，每2000步(4 ps)輸出一個體系文件，用于計算體系的各種能量和分析結構變化。

2.3RAT分子在D3R結構中運動軌跡和自由能勢能面

基于分子動力學模擬優化的D3R-RAT-POPCH2O系統，采用gromacs 4.5中的傘形樣本(umbrella sampling)方法54，計算RAT分子在D3R結構中運動軌跡和自由能勢能面。傘形樣本模擬方法的原理基于公式?G=－RTlnK，其中?G是自由能，而K是平衡常數，通過分子模擬計算獲得16,55,56。采用分子動力學模擬優化之后的體系結構文件為軌跡動力學起始結構體系的輸入文件，所需要的RAT動力學模擬體系的拓撲文件與其分子動力學模擬的拓撲文件相同。310 K時，在x、z和y正負方向，分別進行步長為2 fs的500000步軌跡動力學模擬。設定RAT為運動組，施加不超過2000 kJ?mol－1的外力，并限制RAT最大運動速度為10 nm?ns－1，其他力場參數與體系模擬參數相同。選取與運動方向相反的合適殘基作為參考系。根據0.05 nm規則，從軌跡數據文件中挑選合適的傘形樣本計算。由于生成RAT在D3R結構的運動軌跡過程中，通過外界給力使RAT分子運動，造成RAT分子結構變形，RAT分子和D3R結構體系偏離了平衡；因此，需要做傘形樣本模擬計算，在限定的運動組和參考系質心距離上，使RAT分子和體系重新實現平衡。傘形樣本模擬計算輸入的文件分別是挑選出來的傘形樣本文件、拓撲文件和指針文件，以及設定另外一個傘形樣本模擬參數文件。傘形樣本模擬參數與軌跡模擬參數基本上相同，只是運動速度設定為0 nm?ns－1，表明RAT分子不在軌跡上運動，而是在給定的兩個組結構質心距離上，做分子動力學模擬達到再平衡，模擬步數設定為40萬步(800 ps)，每步步長2 fs，采用均方根偏差(RMSD)測定體系平衡性。最后，采用gromacs 4.5程序中的加權柱狀圖分析法(WHAM)57，把有偏采樣的結果轉換為無偏采樣的統計結果，從系列傘形樣本模擬計算的結果中抽出平均力勢(PMF)，計算誤差偏差為10－6kJ?mol－1(收斂計算標準)。PMF面即為自由能勢能面，基于該自由能勢能面，就可以計算出自由結合能的變化(ΔGbind)。g_wham計算輸出另外一個文件是柱狀圖型數據。柱狀圖型結果可以顯示傘形樣本重疊程度，較好的重疊說明WHAM方法計算ΔG的可靠性。

3　結果與討論

3.1RAT分子與D3R對接

圖3是分子對接結果。正視圖和俯視圖都顯示RAT分子被對接到由7個跨膜螺旋區包圍的空腔中間靠近外細胞區域。這個部位與多巴胺在D3R蛋白中的內部位置相似22。RAT分子與受體蛋白最低能量構象對接能量為－27.9 kJ?mol－1。如果采用RAT正離子分子與D3R對接，獲得的最低能量構象對接能量為11.8×103kJ?mol－1，是一個正能量，一個排斥能。分子對接研究結果指出，D3R蛋白內的通道不適合離子分子，不是離子分子通道，而是分子通道。因此，本文采用電荷中性RAT的分子態，而在跨雙層膜非蛋白研究體系中，采用RAT的離子分子態58。

圖3　RAT與D3R蛋白分子對接的復合結構Fig.3　Complex structure of RAT docked into D3R

3.2D3R-RAT復合蛋白結構分子動力學模擬

圖4是研究體系的RMSD數值隨分子動力學模擬時間變化曲線。從6 ns開始，D3R蛋白的RMSD數值在(0.45±0.02)nm范圍，體系RMSD數值在(5.11±0.02)nm范圍，都在本值±0.02 nm范圍內波動。從分子動力學模擬角度來看，這些RMSD數值表明該體系達到了平衡，可以作為研究RAT在D3R蛋白內運動軌跡的起始結構。在類似的研究體系中，先前我們報道的，采用牛視紫紅質蛋白同源模建的D3R與DA復合膜蛋白，以及基于3PBL晶體蛋白結構構建的D3R與DA復合膜蛋白結構，經過10 ns分子動力學模擬研究體系都達到了平衡22。本體系平衡后D3R的疏水核厚度為2.32 nm。

圖4(A)RMSD隨模擬時間變化曲線，(B)研究體系(包括D3R、POPC膜、水和RAT分子)示意圖Fig.4　(A)Curves of RMSD vs simulation time,(B)scheme of the studied system including D3R,POPC membrane,H2O,and RAT RMSD:root mean square deviation

3.3RAT分子在D3R結構中運動軌跡和自由能勢能面

3.3.1RAT在D3R結構中功能分子通道上運動軌跡和自由能勢能面

對于外源分子，通常都是依賴于分子自身對細胞膜滲透能力，通過細胞膜到達細胞內，所以通常情況下首先具有較強滲透細胞膜能力的分子才具有作為藥物的潛質58。例如，左旋多巴是緩解帕金森病的主要藥物，但是透過細胞膜能力低，只有吸入量的1%能夠滲透細胞膜進入細胞膜內，其余部分被細胞外的脫羧酶分解。所以，左旋多巴配上芐絲肼能抑制外周多巴脫羧酶活性(商品藥名：美多芭)，使得吸入量的10%左旋多巴能夠滲透細胞膜進入細胞膜內。具有手性性質的RAT分子進入細胞，需要通過受體蛋白內部分子通道(類似起著手性分離柱的作用)，被識別和發揮功能作用。基于分子對接和分子動力學模擬獲得D3R與RAT復合蛋白優化結構基礎上，我們要研究RAT分子在D3R內部結構六個方向運動軌跡(圖5)。+y軸方向設定是RAT分子從D3R內部結構往細胞外運動方向，－y軸方向設置為RAT分子從D3R內部結構往細胞里運動方向。+x、－x、+z、－z軸方向是RAT分子從D3R內部結構往細胞膜運動方向，進入到細胞雙層膜中間。考慮了四個方向，基本覆蓋RAT分子運動進入到細胞雙層膜空間最可能的運動方向。

在+y軸方向，選定了Leu129作為運動參考組。參考組的選定是基于反運動方向盡量靠近RAT分子的氨基酸殘基基團。由于在該體系中水分子和磷脂分子有相對較大的運動空間，故不適合作為參考組。設定一個外力，最大值是2000 kJ?mol－1，推動運動組RAT分子沿著+y軸方向，往細胞外方向運動。在實際模擬計算過程中，模擬程序則根據體系情況，提供小于2000 kJ?mol－1合適的外力，使RAT運動，產生軌跡坐標，顯示在圖5中。在－y軸方向，選定了Ser242作為運動參考組，在外力作用下，使RAT分子沿著－y軸方向，即往細胞里模擬運動方向，產生運動軌跡坐標，也顯示在圖5中。

圖5　RAT在D3R內部結構的六個運動方向Fig.5　Six orientations for RAT to move within D3Rthe tracks to move toward the outside of cell supposed along the+y axis and toward the inside of cell along the－y axis

在+y軸方向，從RAT分子運動軌跡坐標文件中，挑選了78個樣本，用于樣本體系再平衡分子動力學模擬和計算RAT分子運動自由能變化。在RAT運動軌跡文件中，不同方向上都保存了1001個軌跡點構象數據，無需全部用來做傘形樣本分子模擬計算。1001個軌跡點構象數據對應于1000 ps分子模擬時長，每1 ps取出一個軌跡點構象數據。所以樣本編號與分子模擬時長(ps單位)相對應。采用軌跡點體系構象數據，可以計算出不同編號樣本中，參考系質心與運動組質心距離。按照RAT運動組與參考系質心距離等間隔增加約0.05 nm規則挑選傘形樣本。在不同區域，由于給外力變化，RAT除了平移運動還有轉動現象，參考系與運動組質心距離變化大，即使相鄰的傘形樣本，質心距離變化也會大于0.05 nm。而且在分子運動過程中，體系的參考系與運動組質心位置都會改變，實際間隔距離不會嚴格按照0.05 nm整數倍出現，因此增加0.05 nm間隔距離選擇樣本是一個總體規則。

在－y軸方向，從RAT分子運動軌跡坐標文件中，挑選了52個樣本。運動組和參考組被分別限定在固定質心距離上，通過分子動力學模擬，使RAT分子和體系重新實現平衡。采用體系RMSD數值表征體系重新實現平衡。每一個軸方向，我們選擇了四個樣本作為代表做體系RMSD數值分析。這四個樣本體系就是在圖5中的o、a、b、c四個點軌跡體系，或者是表1和表2中，用粗體顯示四個樣本體系。這些樣本的RMSD數值分析圖附在Supporting Information圖S1中。在+y和－y軸方向，從700到800 ps之間，各自四個代表性樣本體系的RMSD數值都保持在本值±0.02 nm范圍內變化。數值說明通過40萬步分子動力學模擬，實現了樣本體系重新平衡。其它樣本分子動力學模擬的RMSD值隨模擬時間變化類似，但是它們的數據沒有給出。由于做軌跡時候給予外力，造成體系稍微偏離平衡，但是這種偏離與原先的體系差別不大，所以很快就能達到再平衡。

盡管兩個軌跡上挑選了很多傘形樣本，通過分子動力學模擬實現樣本再平衡，但是還是屬于有偏采樣的結果。圖6是通過加權柱狀圖分析法獲得的自由能勢能面及其對應的反應坐標上的傘形樣本加權柱狀圖，分別是RAT分子沿著+y軸方向通過D3R內部結構往細胞外運動，和沿著－y軸方向往細胞內運動。傘形樣本加權柱狀圖顯示樣本窗口有比較好的重疊性，從而說明自由能勢能面數據的可靠性。

表1　RAT分子沿著+y軸方向通過D3R內分子通道軌跡上的傘形樣本Table 1　Umbrella samplings for RAT to pass molecular channel within D3R along the+y axis

采用VMD程序顯現和分析RAT運動軌跡，并且結合考慮RAT在軌跡坐標上的自由能變化，確定和分辨出RAT在D3R內部結構運動不同的部位。為了分析簡便起見，在每個軌跡圖中只給出四個RAT運動關鍵位置的圖像，樣本編號和質心距離列在表1和表2。而在圖6中是通過WHAM分析方法獲得的質心距離，與通過gromacs工具計算的質心距離，它們之間有一些偏差。在+y軸方向，圖6中通過WHAM分析方法獲得最小質心距離是0.77 nm，對應最小質心距離0.89 nm為樣本3 (表1)。在軌跡圖5中，+y軸方向，RAT從起點O點(0.77 nm)開始，經過a點(1.53 nm)和b點(2.50 nm)到達c點(3.87 nm)位置，離開了D3R內部結構。圖6中顯示RAT軌跡過程的自由能變化為91.4 kJ?mol－1。在軌跡圖5中，－y軸方向，RAT從起點O點(1.77 nm)開始，經過a點(3.15 nm)和b點(3.95 nm)到達c點(4.52 nm)位置，基本上離開了D3R內部結構。圖6中顯示在－y軸方向RAT軌跡過程的自由能變化為348.0 kJ?mol－1。+y、－y軸方向自由能數值差異原因之一，可能源自于最初始的D3R晶體蛋白結構構象，因為該蛋白細胞外端結合了氯氮平分子造成了一種開狀態的蛋白結構。另外原因可能是該分子通道本身更有利于從細胞內往細胞外輸送分子。

表2　RAT分子沿著－y坐標方向通過D3R內分子通道軌跡上的傘形樣本Table 2　Umbrella samplings for RAT to pass molecular channel within D3R along the－y axis

3.3.2RAT在D3R結構中保護分子通道上的運動軌跡和自由能勢能面

RAT在D3R結構中保護分子通道上的運動軌跡和自由能勢能面，通過+x、－x、+z、－z軸四個方向進行研究。從這四個方向，RAT分子都有可能從D3R內部結構往細胞膜方向運動，進入到細胞雙層膜空間。

圖6　RAT沿著+y和－y軸方向，通過D3R內部結構分別往細胞外和往細胞內運動自由能勢能面(A,B)及其對應的反應坐標上的傘形樣本加權柱狀圖(C,D)Fig.6　Potential of mean force(PMF)for RAT to move toward the outside of cell along the+y axis and toward the inside of cell along the－y axis(A,B)with their histograms of umbrella samplings(C,D)

圖7是RAT分子沿著+x軸方向運動進入細胞雙層膜空間運動軌跡圖，參考組是Trp24殘基。圖8是RAT分子沿著－x軸方向運動進入細胞雙層膜空間運動軌跡圖，參考組是Ala137殘基。圖9是RAT分子沿著+z軸方向運動進入細胞雙層膜空間運動軌跡圖，參考組是Cys172殘基。圖10是RAT分子沿著－z軸方向運動進入細胞雙層膜空間運動軌跡圖，參考組是Val56殘基。

從+x軸方向的RAT分子運動軌跡坐標文件中，挑選了55個樣本，列在表3中。在－x軸方向，從RAT分子運動軌跡坐標文件中，挑選了56個樣本，列在表4中。在+z軸方向，從RAT分子運動軌跡坐標文件中，挑選了62個樣本，列在表5中。在－z軸方向，從RAT分子運動軌跡坐標文件中，挑選了50個樣本，列在表6中。這些樣本體系中的運動組和參考組分別被限定在固定質心距離上，通過分子動力學模擬，使RAT分子和體系重新實現平衡。采用體系RMSD數值表征體系重新實現平衡。每一個軸方向，我們都選了四個樣本作為代表做體系RMSD數值分析。這各自四個樣本體系就是在圖7－10中的o、a、b、c四個點軌跡體系，或者是表3－6中，各自用粗體顯示的四個樣本體系。它們的RMSD數值分析圖，分別附在Supporting Information圖S2－S5中。在這些RMSD數值分析圖中，從700到800 ps之間，各自四個代表性樣本體系的RMSD數值都保持在本值±0.02 nm范圍內變化。數值說明通過40萬步分子動力學模擬，都實現了樣本體系重新平衡。類似的其它樣本分子動力學模擬獲得的RMSD隨模擬時間變化圖沒有給出。

從系列傘形樣本模擬計算結果中抽出各自自由能勢能面，分別顯示在圖7－圖10中。相對應的反應坐標上的傘形樣本加權柱狀圖，顯示樣本窗口都具有比較好的重疊性，從而顯示自由能勢能面數據的可靠性。

在圖7中，RAT沿著+x軸方向運動，從起點O點(0.60 nm)開始，經過a點(1.52 nm)和b點(2.51nm)到達c點(3.42 nm)位置，離開了D3R內部結構。從自由能變化曲線和RAT位置主視圖和俯視圖來看，RAT從TM2與TM3比較大的縫隙之間離開D3R內部結構。在圖中可以判斷b點(2.51 nm) RAT基本上脫離D3R蛋，其自由能數值為314.5 kJ?mol－1。從b點到達c點位置實際上是在磷脂雙層膜空間運動，其自由能數據50.9 kJ?mol－1，與RAT (離子分子狀態)在純磷脂雙層膜空間分子動力學模擬的結果(30.3 kJ?mol－1)具有可比性58。

圖7　RAT分子沿著+x軸方向從D3R內部結構往細胞雙層膜運動軌跡主視圖(A)和俯視圖(B)，和運動軌跡上的自由能勢能面(C)及其對應的反應坐標上的傘形樣本加權柱狀圖(D)Fig.7　Figures of tracks from main(A)and top(B)views for RAT to move along the+x axis from within D3R into the POPC phospholipid bilayer membrane,the PMF of the track(C),and the histograms of umbrella samplings for RAT to move(D)

在圖8中，RAT沿著－x軸方向運動，從起點o點(0.64 nm)開始，經過a點(1.80 nm)和b點(2.88 nm)到達c點(3.30 nm)位置，完全離開了D3R內部結構。從自由能變化曲線和RAT位置主視圖和俯視圖來看，RAT從TM6與TM7縫隙之間離開D3R內部結構，處在a點RAT基本上脫離D3R蛋白，其自由能數據為174.4 kJ?mol－1。從b點到達c點位置是處在磷脂雙層膜中間空間層波動運動，因此其自由能數據比較小。

表3　RAT分子沿著+x坐標方向通過D3R內分子通道軌跡上的傘形樣本Table 3　Umbrella samplings for RAT to move pass the D3R interior molecular channel along the+x axis

在圖9中，RAT沿著+z軸方向運動，從起點o點(0.61 nm)開始，經過a點(1.37 nm)和b點(2.07 nm)到達c點(3.23 nm)位置，完全離開了D3R內部結構。從RAT位置主視圖和俯視圖來看，RAT從TM1與TM7縫隙之間離開D3R內部結構。從自由能變化曲線來看，自由能基本上是均勻增大，直到c點(3.23 nm)位置，自由能數值達到最高點數值，數值為117.7 kJ?mol－1。

圖8　RAT分子沿著－x軸方向從D3R內部結構往細胞雙層膜運動軌跡主視圖(A)和俯視圖(B)，和運動軌跡上的自由能勢能面(C)及其對應的反應坐標上的傘形樣本加權柱狀圖(D)Fig.8　Figures of tracks from main(A)and top(B)views for RAT to move along the－x axis from the D3R interior space into the POPC phospholipid bilayer membrane,the PMF of the track(C),and the histograms of umbrella samplings for RAT to move(D)

在圖10中，RAT沿著－z軸方向運動，從起點o點(0.41 nm)開始，經過a點(1.50 nm)和b點(2.56 nm)到達c點(3.48 nm)位置，完全離開了D3R內部結構。從RAT位置主視圖和俯視圖來看，RAT從TM4與TM75縫隙之間離開D3R內部結構。從自由能變化曲線來看，自由能基本上是均勻增大，直到b點位置，自由能數值變化到達一個平臺，數值為327.8 kJ?mol－1。從RAT位置主視圖來看，b點位置，剛好處在TM4與TM75縫隙之間準備離開D3R內部結構。隨后從b點到達c點位置實際上也是在磷脂雙層膜空間運動，其自由能數據為51.4 kJ?mol－1，與純磷脂雙層膜分子動力學模擬的結果(30.3 kJ?mol－1)也具有可比性。

表4　RAT分子沿著－x坐標方向通過D3R內分子通道軌跡上的傘形樣本Table 4　Umbrella samplings for RAT to move pass the D3R interior molecular channel along the－x axis

RAT在D3R結構中的分子通道軌跡上運動，具有一定程度上的柔性，在一定范圍內RAT分子總是朝著能量比較小的軌跡上運動。RAT分子并不是沿某一個軸運動，而是以某一軸為初始方向，沿著最低能量方向運動，有斜著運動，這點從四個軌跡圖就可以看出。當前面有跨膜螺旋擋住，它就稍微改變方向，從跨膜螺旋柱間隙中運動，從最低能量方向運動。如果沿著y軸方向，那最可能方向是盡可能不要通過跨膜螺旋柱間隙中運動。所以我們通過+x、－x、+z、－z軸四個方向進行研究，就應該能覆蓋RAT運動進入到細胞雙層膜空間最可能的運動軌跡。因此，對于RAT在D3R結構中保護分子通道運動，RAT最可能的軌跡通道是從TM1與TM7縫隙之間離開D3R內部結構，其自由能變化數值是117.7 kJ?mol－1。

圖9　RAT分子沿著+z軸方向從D3R內部結構往細胞雙層膜運動軌跡主視圖(A)和俯視圖(B)，和運動軌跡上的自由能勢能面(C)及其對應的反應坐標上的傘形樣本加權柱狀圖(D)Fig.9　Figures of tracks from main(A)and top(B)views for RAT to move along the+z axis from the D3R interior space into the POPC phospholipid bilayer membrane,the PMF of the track(C)and the histograms of umbrella samplings for RAT to move(D)

表5　RAT分子沿著+z坐標方向通過D3R內分子通道軌跡上的傘形樣本Table 5　Umbrella samplings for RAT to move pass the D3R interior molecular channel along the+z axis

采用分子動力學模擬方法，我們甚至可以模擬出RAT分子從不同TM縫隙之間運動軌跡和自由能變化值。若用實驗測定方法，就不能實時看到RAT在D3R內部結構中分子通道上的運動軌跡。而且，分子動力學模擬方法獲得的RAT在D3R結構中分子通道上運動自由能變化與實驗測定數值應該相似，盡管沒有直接數值相比較，但是可以通過相關實驗數值比較獲得部分的支持。在文獻中報道，采用PMF方法，模擬計算水分子在卵磷脂脂質分子生物膜中透過自由能能壘是16.8－29.4 kJ?mol－159－63，而實驗測定水分子透過細胞膜自由能能壘是16.8－37.8 kJ?mol－164－68，分子模擬結果與實驗測定結果很好地保持一致。最近文獻報道，同樣采用PMF方法，計算Na+-Cl－離子對、Cl－離子和Na+離子透過卵磷脂脂質分子生物膜的自由能能壘分別是115.0、99.1和92.0 kJ?mol－169，而實驗測定Cl－離子和Na+離子透過磷脂酰絲氨酸生物膜的自由能能壘分別是(98.7±11.3)和(87.4±1.7)kJ?mol－170，數據顯示分子模擬結果與實驗測定結果也具有很好的一致性。既然在純的磷脂酰絲氨酸生物膜體系，分子模擬結果與實驗測定結果具有很好的一致性，對于目前只是增加了純蛋白與磷脂酰絲氨酸生物膜體系，分子模擬結果與實驗測定結果也應該具有很好的一致性。

圖10　RAT分子沿著－z軸方向從D3R內部結構往細胞雙層膜運動軌跡主視圖(A)和俯視圖(B)，和運動軌跡上的自由能勢能面(C)及其對應的反應坐標上的傘形樣本加權柱狀圖(D)Fig.10　Figures of tracks from main(A)and top(B)views for RAT to move along the－z axis from the D3R interior space into the POPC phospholipid bilayer membrane,the PMF of the track(C)and the histograms of umbrella samplings for RAT to move(D)

表6　RAT分子沿著－z坐標方向通過D3R內分子通道軌跡上的傘形樣本Table 6　Umbrella samplings for RAT to move pass the D3R interior molecular channel along the－z axis

4　結論

RAT通過D3R結構中的功能分子通道，朝細胞外方向傳輸運動的自由能變化數值為91.4 kJ?mol－1，朝細胞內方向傳輸運動的自由能變化數值為340.0 kJ?mol－1。RAT通過D3R結構中的保護分子通道，在+x、－x、+z、－z方向朝細胞雙層膜方向傳輸運動的自由能變化數值分別為314.5、174.4、117.7、327.8 kJ?mol－1，說明在保護分子通道上RAT更容易從TM1與TM7縫隙之間離開D3R內部結構，其自由能變化數值是117.7 kJ?mol－1。自由能變化數值表明RAT分子更容易通過D3R結構中的功能分子通道。RAT分子通過疏通D3R結構中的功能分子通道，可能改變蛋白結構構型構象，減少其它分子的堵塞，增大多巴胺分子的釋放并且成為功能分子，發揮其分子功能作用，導致依賴性和成癮性等多種功能效果。因此，RAT被用作藥物的藥理和成癮機制與它在多巴胺受體中的分子通道上傳輸動力學和機制有密切關聯。

Supporting Information:The values of RMSD from some samplings simulated with 800 ps have been included. This information is available free of charge via the internet at http://www.whxb.pku.edu.cn.

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Molecular Dynamics Simulation for Levo-Benzedrine to Transmit through Molecular Channels within D3R

XIE WeiXU Ze-RenWANG MingXU Si-Chuan*
(Key Laboratory of Education Ministry for Medicinal Chemistry of Natural Resource,College of Chemical Science and Technology,Yunnan University,Kunming 650091,P.R.China)

Levo-benzedrine(also known as L-benzedrine or RAT)acts in dopamine receptors of the central nerve cell.In a clinical setting,RAT is used to treat a variety of diseases;however,it can also result in physical dependence and addiction.To investigate the pharmacology and addiction mechanism of RAT as a medication, we have obtained the optimized structure of the dopamine III receptor(D3R)complex protein with RAT.On the basis of this structure,by using the method of potential mean force(PMF)with umbrella sampling and the simulated phospholipid bilayer membrane(also known as the POPC bilayer membrane),the molecular dynamics simulation was performed to obtain the trajectories with the changes of free energy on the structure for RAT to move along the molecular channels within D3R.The change of free energy for RAT to transfer toward the outside of the cell along the functioning molecular channel within D3R is 91.4 kJ?mol－1.The change of free energy for RAT to transfer into the POPC bilayer membrane along the protecting molecular channel within D3R is 117.7 kJ?mol－1.These results suggest that RAT is more likely to exert its molecular functions and to increase the release of functioning dopamine molecules by transferring along the functioning molecular channel within D3R, which result in a variety of functional effects by RAT including dependence and addiction.The obtained results show that the pharmacology and addiction mechanism of RAT as a medication are closely related to the molecular dynamics and mechanism for RAT to transfer along molecular channels within dopamine receptors.

November 4,2015;Revised:January 14,2016;Published on Web:January 14,2016.*Corresponding author.Email:sichuan@ynu.edu.cn;Tel:+86-871-65039937. The project was supported by the National Natural Science Foundation of China(21163024,21563032).

L-Benzedrine;D3R;POPC;Molecular dynamics simulation;Free energy

O641

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國家自然科學基金(21163024,21563032)資助項目