豬流行性腹瀉疫苗免疫母豬后哺乳仔豬免疫效果ELlSPOT和ELlSA檢測

李凱航周鑫焱楊顯超吳秀娟王 建*

（1.上海市動物疫病預防控制中心，上海 201103；2.揚州大學生物科學與技術學院，江蘇揚州 225009）

豬流行性腹瀉疫苗免疫母豬后哺乳仔豬免疫效果ELlSPOT和ELlSA檢測

李凱航1周鑫焱2楊顯超1吳秀娟1王 建1*

（1.上海市動物疫病預防控制中心，上海 201103；2.揚州大學生物科學與技術學院，江蘇揚州 225009）

豬流行性腹瀉（porcjne epjdemjc djarrhea，PED）是由豬流行性腹瀉病毒（porcjne epjdemjc djarrhea vjrus，PEDV）引起的豬的一種急性接觸性腸道傳染病，以嘔吐、腹瀉、食欲下降和脫水為基本特征，各年齡段均易感染，尤以哺乳仔豬受害最重。本論文通過調查上海本地PED的流行情況，用市場上現有的主要PED疫苗免疫母豬，對窩產仔豬進行連續的免疫反應監測，觀察其體液免疫和細胞免疫的變化，結合之前監測結果對疫苗免疫效果進行評估，為豬場篩選合適疫苗，制定合理的免疫程序，預防與控制PED提供理論依據。

豬流行性腹瀉；體液免疫；細胞免疫；免疫評估

豬流行性腹瀉（porcine epidemic diarrhea，PED）是由豬流行性腹瀉病毒（Porcine epidemic diarrhea virus）PEDV所導致的，PEDV是屬于套式病毒目（Nidov hales）冠狀病毒科（Coronaviridae）冠狀病毒亞科（Coronav irinae）甲型冠狀病毒屬（Alphacoronavirus）b亞群的成員。感染豬主要臨床體現為水樣腹瀉、嘔吐和脫水，不同年齡、品種的豬均易感染，對哺乳仔豬的危害尤其嚴重。

在PED近年來的綜合防治措施中，母豬返飼和“換奶媽”，豬圈烘干等措施效果時好時壞，百家爭鳴，褒貶不一，當前，隨著國內PED變異株細胞培養難關的攻克，該病防治的焦點又重回疫苗的生產上，但因細胞培養產生的病毒濃度無法達到生產工藝要求，變異株疫苗尚無商品化疫苗供應。養殖戶迫于疫病防控壓力，從多種途徑采購美國進口苗、韓國進口苗、國內廠家正規疫苗甚至無批號的“白板苗”，免疫次數從二免到七免都有，但疫苗免疫效果缺少評價。本研究采集上海本市規模化豬場母豬、育肥豬和仔豬的血清作為實驗樣品，使用商品化的試劑盒檢測哺乳仔豬血清中的ELISA抗體和外周血細胞（PBMC）中的γ-干擾素水平，從體液免疫和細胞免疫兩方面對免疫效果加以評估，希望客觀反映疫苗免疫效果。

1 材料和方法

1.1樣品采集

首先對上海市規模豬場采集的血清樣品進行ELISA抗體摸底調查，樣品均采自本市各區縣豬場。對存欄母豬和育肥豬通過前腔靜脈無菌采集血液，側放靜置30min，待析出血清后，2000 rpm離心10min，分離血清裝入1.5 ml EP管凍存待檢。

隨后，選擇無流行性腹瀉感染史的豬場，挑選10只頭胎母豬，經PCR方法檢測無疫后分成2組。免疫組：6頭母豬產前按照免疫程序（產前2月和產前1周）進行兩次免疫，首免為ZY滅活疫苗，二免為DBN弱毒疫苗，2頭母豬為對照組，不免疫PED疫苗。母豬產仔后對窩產哺乳仔豬進行檢測，檢測時間為產后3 d、6 d、9 d、12d、16 d、19 d和26 d，仔豬每次隨機挑選5只同步采集血清和全血（肝素鈉為抗凝劑），分別進行ELISA和ELISPOT檢測。

1.2試劑及儀器

1.2.1ELISA試劑及儀器

ELISA檢測試劑盒購自Biovet公司，批號：153007，TECAN SUNRISE酶標儀。

1.2.2ELISPOT試劑及儀器

ELISPOT試劑盒購自MABTECH公司，批號：3130-4HPW-2。LSM（Lymphocyte Separation Medium）淋巴細胞分離液和植物血凝素（Phytohemagglutinin）購自MP公司，細胞培養的PEDV（2*105TCID50）由實驗室保存，CTL Analyzers LLC ELISPOT計數儀。

1.3實驗方法

1.3.1ELISA檢測

按照Biovet公司ELISA試劑盒說明書操作。

1.3.2ELISPOT檢測

淋巴細胞分離、孵育及檢測參照MABTECH試劑盒說明書操作。

2 結果

2.1規模豬場免疫效果調查

對2014-2015年本市5個區縣37個規模豬場的1100頭母豬和710頭育肥豬進行PED免疫效果ELISA檢測，全市PED免疫后，母豬的免疫平均合格率為50.1%，而育肥豬僅為36.4%，母豬的免疫水平明顯高于育肥豬。各區縣母豬免疫合格率介于26.7～63.3%，育肥豬免疫合格率介于18.3～42.5%，均未能達到70%的免疫合格線。2015年與2014年檢測結果類似，免疫整體水平母豬群高于育肥豬群，各區縣母豬免疫合格率介于30.0～48.8%，育肥豬合格率介于11.67～31.25%，整體免疫合格率母豬為38.73%，育肥豬為21.13%，整體免疫合格率與2014年同比降低。

2.2血清ELISA檢測結果

利用ELISA方法來檢測豬流行性腹瀉疫苗免疫母豬后窩產仔豬免疫效果，挑選了6頭實驗母豬，每頭母豬挑選5只仔豬進行母源抗體檢測，以同一母豬的窩產哺乳仔豬檢測后的S/P均值為線作圖1。

圖1　實驗仔豬PED母源抗體變化

從圖1中可以看出，仔豬在出生后母源抗體一直處于下降趨勢，免疫合格判定臨界值為S/P值等于0.5，而67%的窩產仔豬在第9 d時即抗體轉陰，16%的仔豬在9～16 d內抗體轉陰，所有仔豬在19 d后ELISA抗體均已轉陰。由此可知，豬流行性腹瀉疫苗免疫母豬后窩產仔豬免疫效果并不理想，仔豬依然面臨著PEDV感染風險。

2.3全血ELISOPT檢測結果

ELISPOT檢測實驗仔豬全血樣本，斑點數的多少代表的是仔豬細胞淋巴細胞的特異性免疫分泌的γ-干擾素多寡，窩產仔豬斑點數在0-40之間，陽性斑點在52-179之間。

圖2　ELISPOT陽性對照斑點圖

圖3　ELISPOT陰性對照斑點

不同日齡和對照組一共8組數據，為更準確的判斷出仔豬PED的免疫狀況，借助SPSS軟件對數據進行分析，將對照組數據作為分析對照，利用LSD法判斷顯著性。均值差的顯著性水平為0.05，置信區間95%的前提下，日齡為9、12、16d的窩產仔豬的ELISPOT斑點數均值差與對照組相比存在一定差異，差異不顯著，說明在細胞免疫水平上并沒有取得理想的免疫效果。

3 結論

運用ELISA方法對上海市規模化養豬場的生產母豬群和育肥豬群進行監測，從抗體免疫水平來看，2014-2015年所監測的37個規模豬場，場合格率僅為5.4%（2/37）。其中，2014年生產母豬群體免疫合格率為50.1 %，育肥豬群36.4 %；2015年生產母豬群群體免疫合格率為38.7%，育肥豬群為21.1 %。免疫合格率生產母豬高于育肥豬0.75 %-32.8 %不等。從本市PED總體免疫效果來看，連續兩年的監測均遠遠低于70%免疫合格線，對病毒無法起到阻斷傳播作用，容易造成病毒流行散播，一旦出現極端天氣、消毒不良、飼養不規范等誘因，極易造成發病，PED體液免疫效果亟待提升。2014年與2015年免疫效果相比較，2015年母豬和育肥豬群免疫合格率均出現顯著下降，這一方面可能是豬場未能按照正常的免疫程序免疫，免疫積極性下降，另一方面，是現有的疫苗無法對其起到應有的效果。

本實驗分析的樣本均采用了目前本市規模化豬場普遍采用的免疫形式，即對待產母豬進行兩次免疫，首免在母豬妊娠中期使用滅活苗，二免在母豬妊娠晚期使用弱毒苗的免疫方式，觀察新生仔豬體液免疫消長規律，以此來對疫苗免疫效果進行評估。對3-26d的窩產仔豬母源抗體進行了監測，結果顯示母源抗體會在仔豬在出生后迅速下降，所有仔豬在19天后ELISA抗體均已轉陰。PED多侵襲0-9日齡仔豬，在實驗中，67%的窩產仔豬在第9 d 時抗體轉陰，不再受到免疫保護，這對于仔豬來說是十分危險的。

在評價細胞免疫效價時，應當建立檢測評價細胞免疫的如ELISPOT等方法。IFN-γ是由Th1細胞亞群分泌的一類細胞因子，其ELISPOT 檢測方法可以作為檢測和評價疫苗細胞免疫的有效方法。為此，我們選定試驗母豬產前免疫疫苗，對新生仔豬開展了IFN-γ ELISPOT 方法檢測，檢測發現，仔豬IFN-γ實驗數據在9-16日齡的監測數據與對照組產生了一定差異，但差異不顯著，說明PED疫苗免疫后，新生仔豬在此階段不產生強烈的Th1細胞免疫反應，綜上所述，母豬產前免疫滅活+弱毒進行兩次免疫的疫苗注射方式無法產生強力的體液和細胞反應，這應與疫苗的毒力效價不足有關。

［1］杜曉莉.浙江省豬流行性腹瀉病毒S1基因變異及間接ELISA的建立［D］.甘肅農業大學，2014.

［2］郭璇.豬流行性腹瀉病毒的分離及間接ELISA的建立［D］.廣西大學，2013.

［3］衛龍興，成建忠.上海規模化豬場豬病毒性腹瀉的流行病學調查［J］.畜禽業，2010，（259）：60-61.

滬農科攻字（2013）第5-5號；滬農科產字（2016）第6號

王建

李凱航（1977—），男，高級獸醫師，主要從事動物疫病防治工作。