Shh信號通路阻斷對人結腸癌細胞HT-29增殖、侵襲的影響及機制探討

梁新軍，魏少忠

(湖北省腫瘤醫院，武漢430079)

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Shh信號通路阻斷對人結腸癌細胞HT-29增殖、侵襲的影響及機制探討

梁新軍，魏少忠

(湖北省腫瘤醫院，武漢430079)

目的觀察阻斷Sonic Hedgehog(Shh)信號通路對人結腸癌細胞HT-29增殖和侵襲的影響，并探討其機制。方法取對數生長期HT-29細胞分為A、B、C、D組，分別置于含0、5、10、20 μmol/L Shh信號通路特異性抑制劑Cyclopamine的培養基中培養。采用MTT法檢測各組干預24、48、72 h時細胞增殖抑制率，采用Transwell法檢測各組干預48 h時體外侵襲能力，采用實時熒光定量PCR法檢測各組細胞Shh、下游轉錄因子GLI1 mRNA。結果干預24、48、72 h時各組細胞增殖抑制率為B組B組>C組>D組，P均<0.05。結論阻斷Shh信號通路可抑制HT-29細胞增殖、降低體外侵襲能力，可能與其降低Shh、GLI1表達有關。

結腸癌；Shh信號通路；下游轉錄因子；細胞增殖；細胞侵襲

結腸癌是臨床常見的惡性腫瘤之一，發病率已躍居全球惡性腫瘤的第3位，其發病機制目前尚不明確[1]。基因突變和表觀遺傳學改變等參與了結腸癌的發生、發展過程[2]。Sonic Hedgehog(Shh)信號通路是調控胚胎發育及細胞分化的重要通路，GLI1是其下游轉錄因子。研究發現，Shh信號通路在肺癌、乳腺癌、胃癌、結腸癌等多種惡性腫瘤中呈激活狀態，且與腫瘤的惡性程度和患者預后密切相關[3～5]。目前Shh信號通路在結腸癌中的具體作用機制的研究報道較少。2015年1～12月，我們觀察了阻斷Shh信號通路對人結腸癌細胞HT-29增殖和侵襲的影響，并探討其在結腸癌發生、發展中的意義。現報告如下。

1　材料與方法

1.1材料HT-29購自美國ATCC公司，置于含10%胎牛血清的RPMI 1640培養基中，于37 ℃、5%CO2、飽和濕度的培養箱內培養。胎牛血清、RPMI 1640培養基及TRIzol為美國Gibco公司產品；胰酶、DMSO、MTT、Shh信號通路特異性抑制劑Cyclopamine等購自Sigma公司；SYBR Premix EX Taq試劑盒購自Invitrogen公司；引物由上海吉瑪公司合成；Transwell小室購自Corning公司；Bio-Rad iQ5實時熒光定量PCR儀購自Bio-Rad公司；Multiskan MK3全自動酶標儀購自Thermo公司。

1.2細胞分組及處理取對數生長期HT-29細胞，胰酶消化、重懸后分為A、B、C、D組，分別置于含0、5、10、20 μmol/L Cyclopamine的培養基中培養，每組6個復孔，均置于37 ℃、5% CO2、飽和濕度的培養箱內培養。

1.3HT-29增殖情況觀察采用MTT法。分別于干預24、48、72 h取對數生長期各組細胞，調整細胞密度5×104/mL。每孔200 μL接種于96孔板，每組6個復孔。培養24 h，加入20 μL的MTT(5 g/L)行MTT檢測，所有操作均嚴格按照使用說明書進行。采用酶標儀檢測各組490 nm波長處的吸光度值，計算增殖抑制率。細胞增殖抑制率=(對照組吸光度值-實驗組吸光度值)/對照組吸光度值×100%。實驗重復3次。

1.4HT-29侵襲能力觀察采用Transwell法。干預48 h時取對數生長期各組細胞，1×105/mL培養在無血清的PRMI 1640培養基中，置于Transwell小室上室，下室每孔加入0.5 mL含10%胎牛血清的PRMI 1640培養基。置于37 ℃、5% CO2、飽和濕度的培養箱中，培養24 h。拭去上室表面剩余細胞，將遷移到下室的細胞用多聚甲醛固定30 min，Giemsa染色15 min；顯微鏡下計數，以穿膜細胞數表示細胞的侵襲能力。實驗重復3次。

1.5細胞Shh、GLI1 mRNA檢測采用實時熒光定量PCR法。干預48 h時取對數生長期各組細胞，照TRIzol試劑盒說明提取總RNA，逆轉錄合成cDNA。按照SYBR試劑盒說明進行實時熒光定量PCR，對Shh、GLI1的mRNA進行定量檢測。引物采用Primer 5.0軟件設計，具體如下：Shh上游引物5′-CCAACGTAGCCGAGAAGACC-3′，下游引物5′-TCC-CGTGTTTCCTCATCCT-3′；Gli1上游引物5′-TGAGGTGGGCAGGTTAGGA-3′，下游引物5′-CAGAGGGAGATGGGGTGTTTT-3′。內參GAPDH上游引物5′-TGTCCCCACCCCCAATGTATC-3′，下游引物5′-CTCCGATGC CTGCTTCACACCTT-3′。反應條件：94 ℃預變性5 min；94 ℃、30 s，58 ℃、30 s，72 ℃、30 s，共35個循環。以GAPDH為內參，采用2-ΔΔCt法計算目的基因的相對表達量。

2　結果

2.1各組細胞增殖抑制率比較見表1。

表1　干預24、48、72 h時各組細胞增殖抑制率比較

注：與B組同時點比較，#P<0.05；與C組同時點比較，*P<0.05；與本組前一時點比較，△P<0.05。

2.2各組穿膜細胞數比較干預48 h時，A、B、C、D組的穿膜細胞數分別為(55.670±6.506)、(35.330±7.371)、(28.330±4.041)、(23.330±2.309)個。B、C、D組穿膜細胞數均低于A組(P均<0.05)，但B、C、D組間比較差異無統計學意義。

2.3各組Shh、GLI1 mRNA表達比較各組Shh、GLI1 mRNA的相對表達量均為A組>B組>C組>D組，P均<0.05。見表2。

表2　各組HT-29組織Shh、GLI1 mRNA相對表達量比較

注：與A組比較，*P<0.05；與B組比較，#P<0.05；與C組比較，ΔP<0.05。

3　討論

目前認為結腸癌的發生是多因素、多步驟的復雜過程，基因突變和表觀遺傳學改變等均參與了結腸癌的侵襲與轉移過程，但其確切機制尚不明確[6～8]。國內外學者已發現多個與結腸癌轉移相關的基因，如VEGF、MMP-9等，并針對這些因子采取了包括藥物、基因轉染等多種方法進行調控，雖能取得部分抑制轉移的效果，但結果尚不滿意[9～11]。

Shh信號轉導通路不僅在胚胎發育過程中發揮重要作用，也參與了組織修復和細胞再生以及腫瘤發生和發展的過程。目前認為，Shh信號轉導通路主要由Hh信號肽、跨膜受體以及下游轉錄分子組成，通過復雜的信號轉導過程將上游信號傳遞到核內，進一步促進下游基因的表達而參與細胞的各項調控過程[12,13]。研究表明，Shh信號轉導通路的關鍵信號分子主要有Shh、跨膜蛋白受體Ptch、Smo及下游的轉錄因子Gli等。在Shh信號被激活后，Shh與跨膜蛋白受體Ptch(Ptch1、Ptch2)相結合，解除了其對Smo的抑制作用，繼而傳遞信號至下游的Gli(Gli1、Gli2、Gli3)，Gli蛋白進入核內后進一步激活下游NF-κB、Bmi-1等因子的表達，從而參與調控細胞的增殖與凋亡過程。Shh信號可能通過多種機制參與調控惡性腫瘤細胞的增殖與侵襲[14，15]。Sharma等[16]研究發現，Shh信號可能與PI3K/Akt/mTOR信號共同參與了胰腺癌干細胞增殖和分化的調控過程，繼而參與了胰腺癌的侵襲與轉移。Giakoustidis等[17]研究認為，Shh信號、WNT/β-catenin信號及Notch信號等可能共同參與了肝癌侵襲與轉移的過程。本研究前期研究發現，結腸癌中Shh信號通路呈異常激活狀態，本研究發現，干預24、48、72 h時各組細胞增殖抑制率均為B組B組>C組>D組，說明阻斷Shh信號通路可抑制HT-29細胞增殖，降低細胞體外侵襲能力，可能與其降低Shh、GLI1表達有關。今后應進一步深入探究Shh信號通路相關分子在結腸癌發生、發展中的具體作用機制。

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Effects of blocking Shh signaling pathway on proliferation and invasion of colon cancer cell line HT-29

LIANGXinjun,WEIShaozhong

(HubeiCancerHospital,Wuhan430079,China)

ObjectiveTo observe the effects of blocking Sonic Hedgehog (Shh) signaling pathway on the proliferation and invasion of colon cancer cell line HT-29 and to investigate the mechanism. MethodsHT-29 cells in the logarithmic phase were divided into groups A, B, C, and D and were cultured in the culture medium containing 0, 5, 10 and 20 mol/L Shh signaling pathway specific inhibitor Cyclopamine, respectively. The inhibitory rate of cell proliferation was detected by MTT method at 24, 48 and 72 h after the treatment of Cyclopamine. Transwell method was used to detect the invasive ability of each group at 48 h. The Shh and downstream transcription factor GLI1 mRNA in HT-29 cells was detected by real-time fluorescence quantitative PCR. ResultsThe proliferation inhibition rate at 24 h, 48 h and 72 h: group Bgroup B>group C>group D, allP<0.05. ConclusionBlocking Shh signaling pathway can inhibit the proliferation of HT-29 cells and decrease the invasion ability in vitro, which may be related to the decreased expression of Shh and GLI1.

colon carcinoma; Sonic Hedgehog signaling pathway; downstream transcription factor; cell proliferation; cell invasion

湖北省武漢市科技局科技計劃項目(2013062301010813)；湖北省武漢市晨光計劃(2015070404010204)。

梁新軍(1976-)，男，博士，副主任醫師，主要研究方向為腫瘤免疫。E-mail： doctorlxj@163.com。

10.3969/j.issn.1002-266X.2016.18.004

R735.3

A

1002-266X(2016)18-0012-03

2016-01-11)