條斑紫菜水通道蛋白PyAQP1基因的克隆及功能分析*

楊俊卿， 孔凡娜， 李　超， 畢桂萁， 孫美娟， 趙海龍， 李　娜， 茅云翔

(1.中國海洋大學海洋生命學院海洋生物遺傳學與育種教育部重點實驗室，山東 青島 266003；2.青島大學附屬醫院藥學部，山東 青島 266021)

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條斑紫菜水通道蛋白PyAQP1基因的克隆及功能分析*

楊俊卿1， 孔凡娜1**， 李超1， 畢桂萁1， 孫美娟2， 趙海龍1， 李娜1， 茅云翔1

(1.中國海洋大學海洋生命學院海洋生物遺傳學與育種教育部重點實驗室，山東 青島 266003；2.青島大學附屬醫院藥學部，山東 青島 266021)

本研究從條斑紫菜中克隆了一個水通道蛋白(Aquaporin，簡稱AQP)基因PyAQP，命名為PyAQP1 (登錄號為KT735045)。序列分析表明，PyAQP1基因cDNA全長為1 151bp，開放閱讀框(ORF)為1 002bp，編碼333個氨基酸，含有200bp的內含子。氨基酸序列比對分析表明，PyAQP1具有水通道蛋白的保守結構域NPA和6個跨膜區域。MEGA5.0構建的系統發生樹表明，該基因屬于Glps類。采用基因槍介導的洋蔥瞬時表達定位結果顯示，PyAQP1基因定位于細胞質膜上。運用實時熒光定量PCR技術對PyAQP1基因在干旱、鹽度和溫度處理條件下在轉錄水平進行分析。在干旱處理條件下，PyAQP1基因隨著失水率的增加，表達量逐漸降低，失水率達到80%后復水處理，隨著復水時間的延長，表達量增加。在山梨醇和鹽度脅迫處理下，PyAQP1基因的表達趨勢基本一致，隨著鹽度的增加，表達量降低。溫度處理條件下，在-8 ℃時，基因的表達量顯著增加，0 ℃時，基因的表達量略高于正常處理條件。當溫度高于正常生長溫度時，基因的表達量隨著溫度的升高，呈現逐漸升高的趨勢。本研究為深入了解條斑紫菜逆境適應機制中水通道蛋白的作用奠定了基礎，同時為后續條斑紫菜抗逆品系的選育提供了理論指導。

條斑紫菜；水通道蛋白；亞細胞定位；Realtime-PCR；非生物脅迫

引用格式：楊俊卿， 孔凡娜， 李超， 等. 條斑紫菜水通道蛋白PyAQP1基因的克隆及功能分析[J]. 中國海洋大學學報(自然科學版), 2016, 46(8): 79-86.

YANGJun-Qing,KONGFan-Na,LIChao,etal.CloningandexpressionanalysisofPyAQP1inPyropia yezoensis [J].PeriodicalofOceanUniversityofChina, 2016, 46(8): 79-86.

條斑紫菜(Pyropia yezoensis (Ueda)M.S.HwangetH.G.Choi)隸屬于紅藻門(Rhodophyta)、原紅藻綱(Rhodophyceae)、紅毛菜目(Bangiales)、紅毛菜科(Bangiaceae)、紫菜屬(Pyropia)[1]，是中國北方沿岸常見的種類。條斑紫菜由于其重要的經濟價值被大規模栽培，為長江以北的主要栽培藻類之一。在長期的進化過程中，條斑紫菜形成了適應潮間帶環境的抗逆基因和生理生化機制，被認為是潮間帶藻類研究的模式物種，更是開展抗逆相關分子機理研究的理想材料[2-4]。自然條件下，條斑紫菜的葉狀體生活在海水中，能在0～10 ℃的低溫下正常生長，-20 ℃冷藏長達數月后，下海仍能復活并正常生長；能忍耐長達2～3d的缺水狀態，即使被太陽曬干后發脆，漲潮后仍能正常生活[5]。

干旱、鹽度與溫度對植物體產生脅迫作用，并導致一系列滲透脅迫、離子脅迫及刺激傷害。各種非生物脅迫都會造成植物體細胞的水分失衡，而水通道蛋白可以有效控制逆境環境下植物體內以及細胞內部水分的運輸。水通道蛋白通過影響水分子、小分子物質和部分重金屬在植物體內的運輸有效地提高植物的抗逆性[6]。

水通道蛋白，又稱水孔蛋白，相對分子質量大約在24～34kD[7]。它廣泛存在于各種生物膜上，在組織和器官的發育進程以及中性分子的跨膜運輸等過程中發揮著重要作用[8]。到目前為止，水通道蛋白已在古生菌、真細菌、真菌、動物和植物等幾乎所有的生物中均有發現[9]。在植物中MIP家族(常簡稱水孔蛋白)，包括7大類，其中常見的有以下4類：質膜內在蛋白(PIPs,Plasmamembraneintrinsicproteins)，液泡膜內在蛋白(TIPs,Tonoplastintrinsicproteins)，類Nod26 膜內在蛋白 (NIPs,Nodulin26-likeintrinsicproteins)與小分子堿性膜內在蛋白(SIPs,Smallandbasicintrinsicproteins)[10]，另外3類分別是GlpF(Glycerolfacilitator) 膜 內 在 蛋 白(存在于低等生物細菌、藻類與苔蘚類中)[11]，混合內在蛋白(HIP)和未被分類的XIP內在蛋白[12]。植物水通道蛋白已經被證實在維持體內水平衡和響應鹽度、干旱脅迫有重要作用，此外，有些亞類除了運輸水分子外，還能夠運輸氨、硅、二氧化碳和硼等[10,13]。Marinela等人首次從萊茵衣藻中克隆了MIP基因(命名為CrMIP)，并對該基因進行了進化分析，發現該基因與其他物種的MIP同源性較低。通過酵母突變體功能互補實驗與同位素14C標記甘油實驗，證明該基因能夠促進細胞對甘油的攝取[14]。Anderberg等人從已經測序完成的9種綠藻基因組中獲得了22條MIPs基因，將22條MIPs基因分為7亞類：MIPA、MIPB、MIPC、MIPD、MIPE、PIPs和GlpF-like。認為MIPA到MIPE5類基因與其他物種中的差異較大，PIP、GlpF-like類與陸地植物中的PIP、GlpF-like類基因相似。推測陸地植物中的PIP、GlpF-like類基因與藻類中的PIP、GlpF-like具有相同的起源[15]。但是，目前關于水通道蛋白在海洋藻類中的功能研究較少，在紅藻中尚未發現有關的報道。因此本研究希望能夠為海洋藻類的逆境脅迫機制提供依據。

1　材料和方法

1.1 材料

實驗材料為實驗室培養的條斑紫菜葉狀體RZ品系，該品系是通過單細胞酶解后培養所得。亞細胞定位所用洋蔥(Allium cepa)為“紫星”品種。

1.2 方法

1.2.1 材料培養與干旱、鹽度、溫度脅迫處理以新鮮的條斑紫菜葉狀體RZ為材料，待葉狀體生長長度為10cm左右時，選取葉片完整光滑、色深有光澤且處于旺盛生長期的健康藻體于同一通氣瓶中馴化培養。培養條件：鹽度為33的過濾海水加PES[16]營養鹽，10 ℃，50μmolphotons·m-2·s1，12L∶12D，通氣處理。取其中少部分材料進行DNA的提取，部分材料進行干旱、鹽度和溫度的處理。不同的處理條件見表1(每個處理設置3個平行)。失水率計算公式為：失水率(%)=(鮮重-失水后藻體重)/(鮮重-干重)×100。將處理完的材料迅速收集置于液氮中保存。

1.2.2 條斑紫菜葉狀體總RNA的提取、cDNA的合成利用E.Z.N.A.totalRNAKitⅠ(OMEGA)試劑盒提取不同處理條件下RZ葉狀體的總RNA，經DNaseⅠ消化后，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測其完整性，然后用NaNoDrop檢測濃度與質量，將A260/A230=2.0～2.2,A260/A280=1.8～2.0的RNA放-80℃保存備用。cDNA的合成采用RocheTranscriptorFirstStrandcDNASynthesisKit。DNA的提取使用植物基因組DNA提取試劑盒(TIANGEN)。具體實驗步驟參照說明書進行。

1.2.3 PyAQP1基因克隆與生物信息學分析根據實驗室已有條斑紫菜轉錄組數據(IDPRJNA235353)，通過功能注釋結果，從中篩選出水通道蛋白Unigene基因。利用本地blast方法將篩選出的Unigene與條斑紫菜的EST數據庫、CDS數據庫、基因組數據庫進行比對，比對上后進行拼接延伸。將拼接后的序列，在NCBI的ORFFinder上進行預測。

表1　條斑紫菜不同的處理條件

注：a低山梨醇與高滲，產生的滲透壓是相同的;b高山梨醇與超高滲，產生的滲透壓是相同的。

Note:aTheosmoticpressureoflowsorbitolandhighpermeabilityissame;bTheosmoticpressureofhighsorbitolandultra-highpermeabilityissame.

根據上述拼接序列，利用primer5設計上、下游引物AQPF1、AQPR1 (見表2)，分別以cDNA和DNA為模板進行擴增。擴增程序設置為：94 ℃預變性5min；94 ℃變性45s，58 ℃退火1min，72 ℃延伸1min35s，35個循環；72 ℃延伸10min；4 ℃保存。PCR產物與pMD18-T(TaKaRa)連接后進行亞克隆，藍白斑篩選，挑選白色菌落，經PCR驗證后，將陽性重組質粒送至Invitrogen公司測序。

利用NCBI的ORFFinder(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/orfig.cgi)網站預測基因的開放閱讀框。DNAMAN軟件進行氨基酸序列比對，運用在線的軟件Protparam(http://web.expasy.org/protparam/)預測PyAQP1基因編碼蛋白的等電點與分子量；Predictprotein中的PhD(http://www.predictprotein.org/submit-meta.html)預測蛋白的二級結構；TMHMM軟件(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)預測該蛋白的跨膜結構區域；NetPhos軟件(http://www.cbs.dtu.dk/services/NetPhosK/)預測蛋白的磷酸化位點。PSORTⅡPrediction軟件(http://psort.hgc.jp/form2.html)預測細胞中基因編碼蛋白的位置。采用MEGA6.0，以鄰位連接(NJ)法構建系統進化樹(1 000runs)，進行分子系統學分析。

表2　PCR擴增所用引物及其序列

1.2.4 PyAQP1的亞細胞定位分析

1.2.4.1 瞬時表達載體的構建瞬時表達載體p35S:PyAQP1-GFP的構建采用pBI121載體，利用限制性內切酶XbaⅠ和BamHI將其雙酶切，將兩端帶有XbaⅠ和BamHI酶切位點的目的基因PyAQP1與線性化載體PBI121進行連接。依據In-Fusion引物設計原則，設計PyAQP1F2、PyAQP1R2擴增PyAQP1基因(見表2)。具體操作見clontech的說明書。將連接產物轉化DH5α大腸桿菌，挑取陽性克隆進行測序驗證。

1.2.4.2 基因槍介導的亞細胞定位切取2cm×2cm的洋蔥內表皮組織，將其放置在固體MS培養基上，28 ℃弱光下預培養4h待用。利用基因槍介導的瞬時轉化法將PBI121-PyAQP1-GFP和空載體PBI121-GFP分別導入洋蔥表皮細胞中，各做3個重復。基因槍轉化步驟參照參考文獻[17]。將轟擊后的洋蔥表皮放入23 ℃暗培養16h后，放入0.6mol/L蔗糖溶液中，使其發生質壁分離，然后用DAPI進行染色處理，制備臨時裝片，通過尼康熒光顯微鏡(Eclipse80i,Nikon)分別在白光、綠光(450～490nm)和藍光(330～380nm)下觀察。

1.2.5 PyAQP1基因的qRT-PCR分析利用熒光定量PCR方法檢測PyAQP1基因在不同脅迫下(見表1)mRNA水平的表達差異。PCR反應體系如下：單鏈cDNA模板1μL，上、下游引物各0.2μmol/L，2×SYBRGreenⅠReal-timePCRMasterMix(Roche)10μL，加水補足至20μL。擴增所用引物為PyAQP1F5和PyAQP1R5，內參基因選擇為eIF4A和Tubulin，引物分別為eIF4AF3、eIF4AR3和TubulinF4、TubulinR4。每對引物分別做標準曲線和熔解曲線，以排除引物二聚體和非特異性擴增產物對基因的相對表達量造成影響的可能性。利用RocheLightCycler? 480II儀器進行PCR擴增，設置3個生物學重復、2個技術重復，相對表達量的計算利用2-△△ct法[18]。應用Excel和SPSS19.0軟件對試驗數據進行統計分析，并采用單因素方差分析(One-WayANOVA)和最小差異顯著法(LSD)比較不同數據組間的差異，P<0.05表示差異顯著，P<0.01表示極顯著差異。

2　結果與分析

2.1 條斑紫菜PyAQP1基因的克隆

將電子克隆所得序列，設計引物進行PCR測序驗證，同時在NCBI(http: //www.ncbi.nlm.nih.gov/blast)網站對核苷酸序列進行BLASTX分析，以確定ORF的正確性，獲得1 151bp堿基序列(GenBank注冊號：KT735045)，含1 002bp開放閱讀框，編碼333個氨基酸(見圖1)。根據PyAQP1基因的cDNA序列在閱讀框兩端設計引物在cDNA和DNA中進行擴增，所得序列進行進一步分析，發現擴增序列含有預期的開放閱讀框，基因組序列中含有一個200bp內含子(見圖1)。

2.2 條斑紫菜PyAQP1基因蛋白結構分析

Protparam軟件預測PyAQP1基因編碼蛋白分子量為34.597KD，等電點為6.43。利用Predictprotein中的PhD軟件預測蛋白的二級結構顯示，PyAQP1由α螺旋(34.53%)、β折疊(10.51%)、無規則卷曲(54.95%)組成。TMHMM軟件預測該蛋白有6個跨膜結構區域，跨膜區域的氨基酸位置為65～87、99～118、146～168、220～241、254～276、308～330(見圖2)。氨基酸序列分析表明該蛋白含有MIP(Majorintrinsicprotein)家族中典型的保守NPA結構域，由Asn-Pro-Ala3個氨基酸組成的，它們直接參與水通道的形成(見圖2)。運用NetPhos軟件預測發現，PyAQP1蛋白氨基酸序列包含13個可能的磷酸化位點，其中8個位于絲氨酸(S)上，4個位于蘇氨酸(T)上，1個位于酪氨酸(Y)上(見圖1)，推測這些磷酸化修飾位點可能與PyAQP1基因蛋白通道的開啟與閉合有關。PSORTⅡPrediction分析顯示該基因編碼的蛋白位于質膜上。

(星號為終止密碼子，加粗下劃線為磷酸化位點，內含子位置用倒三角標出。Stopcodonismarkedwithanasterisk,thebondwithunderlinespredictedphosphorylationsites,theblackarrowheadsmarkthelocationsofintrons.)

圖1PyAQP1基因DNA序列及氨基酸序列

Fig.1DNAsequenceandaminoacidsequenceofPyAQP1

利用MEGA6.0軟件，進行分子系統學分析(見圖3)。由圖中可見，Glps進化樹主要分成2大支，萊茵衣藻的Glps和單針藻的Glps(XP013897215.1)聚為一小支，其余的包括假單胞桿菌屬的Glps、金色藻的Glps、紅藻門的Glps、小球藻屬的Glps和小立碗蘚的Glps聚為一大支。其中，PyAQP1與龍須菜的親緣關系最近聚為一小支，再與角叉菜的聚為一支，然后與單細胞紅藻、小球藻、小立碗蘚的Glps聚在一起。

2.3 PyAQP1基因編碼蛋白的亞細胞定位分析

利用基因槍介導的瞬時轉化法將PBI121-PyAQP1-GFP和空載體PBI121-GFP分別導入新鮮的洋蔥內表皮細胞中，通過在熒光顯微鏡下觀察綠色熒光蛋白信號在細胞內的分布，分析PyAQP1在洋蔥亞細胞結構中的分布。結果顯示，轉化融合表達載體PBI121-PyAQP1-GFP的洋蔥表皮細胞中，綠色熒光僅在質膜上表達。轉化空載體PBI121-GFP的洋蔥表皮細胞中，綠色熒光在細胞質、細胞核和細胞膜上都有表達(見圖4)，表明PyAQP1基因編碼蛋白定位在質膜上，這與亞細胞定位預測的位置是一致的。

2.4 PyAQP1基因干旱、鹽度、溫度脅迫響應的qRT-PCR分析

為了探究PyAQP1基因在干露、鹽度與溫度等不同環境因子脅迫下的表達模式，采用熒光定量PCR方法檢測了PyAQP1在轉錄水平的表達規律。結果表明(見圖5)，在失水脅迫下，當失水率達到20%時基因相對表達量最大，達到對照組的9倍左右。隨著失水率的增加，基因表達量逐漸降低，當失水率達到80%時，基因的相對表達量約為對照組的4倍。在失水處理的3個階段，PyAQP1表達水平顯著上調(P<0.05)。復水處理是將失水率達到80%后將其放在正常培養海水中復水處理15、30min。隨著紫菜細胞逐漸的恢復到原來的狀態，基因的相對表達量逐漸上升。復水處理時，PyAQP1表達水平顯著上調(P<0.05)。

(星號表示2個保守的NPA；上劃線表示6個跨膜區域。TwoconservedNPAmotifsaremarkedwithasterisks;theoverlinesshowsixtransmembrancedomain.條斑紫菜P.yezoensis PyAQP1(KT735045)，假單胞桿菌Pseudomonas deceptionensisGlps(WP048359036.1)，擬南芥Arabidopsis thalianaNIP1-1(NP_567572.1)，玉米Zea maysPIP2-1 (NP_001105024.1)，水稻Oryza sativa SIP2-1(NP_001049950.1)，擬南芥AtTIP2-3(NP_199556.1).)

圖2PyAQP1與其他物種中的AQP家族基因的氨基酸序列比對

Fig.2ComparisonoftheaminoacidsequencesofPyAQP1andotherAQPproteins

(小球藻Auxenochlorella protothecoides (Glps)XP011400931.1, 小球藻A.protothecoides (Glps)XP011400934.1, 小立碗蘚 Physcomitrella patens (Glps)AAU43833.1, 單細胞紅藻 Cyanidioschyzon merolaestrain10D(Glps)XP005536496.1, 角叉菜 Chondrus crispus (Glps)CDF37343.1, 龍須菜 Gracilaria lemaneiformis (Glps)comp50806c0seq1 1-300, 條斑紫菜P.y (PyAQP1)KT735045, 單針藻 Monoraphidium neglectum (Glps)XP13897527.1, 溫泉紅藻Galdieria sulphuraria (Glps)XP005705771.1, 溫泉紅藻G.sulphuraria (Glps)EME29251.1, 金色藻ChrysochromulinaspCCMP291 (Glps)KOO24120.1, 假單胞菌Pseudomonas (Glps)WP018614182.1, 南極假單胞桿菌 P.deceptionensis (Glps)WP048359036.1, 熒光假單胞桿菌P. fluorescens (Glps)WP039765828.1, 土壤假單胞菌P.kilonensis (Glps)WP046062607.1, 萊茵衣藻Chlamydomonas reinhardtii (Glps)XP001694120.1, 單針藻 Mn (Glps)XP013897215.1, 甲烷熱桿菌 Methanothermobacter thermautotrophicus (AQPM)WP_010875742.1)

圖3PyAQP1水通道蛋白氨基酸序列系統發生分析

Fig.3ThephylogenetictreeofPyAQP1gene.

(a、d.洋蔥內表皮細胞外觀圖；b、e.熒光顯微鏡下的綠色熒光信號圖；c、f.DAPI染色圖。a,d.Out-lookofonionepidermalcells;b,e.GreenfluorescentsignalunderFluo;c,f.DAPIstainingfigure.)

圖4PyAQP1亞細胞定位結果

Fig.4SubcellularlocalizationofPyAQP1fusedwithGFP

在鹽度處理條件下(見圖6)，低于正常海水鹽度下的超低滲(鹽度為8)與低滲(鹽度為16)，隨著鹽度的降低表達量增加，處理條件低于正常海水鹽度33時，PyAQP1表達水平顯著上調(P<0.05)。當高于正常海水鹽度的高滲(鹽度為47)與超高滲(鹽度為60)時，隨著鹽度的增加表達量也降低。當海水鹽度為47時，PyAQP1表達水平顯著上調(P<0.05)。當海水鹽度為60時，PyAQP1的表達水平沒有發生顯著變化(P>0.05)。在滲透壓處理的條件中，增加了山梨醇的處理。低山梨醇處理條件的滲透壓與高滲處理條件下的滲透壓是一樣的，高山梨醇處理條件的滲透壓與超高滲滲透壓是一樣的。山梨醇處理后基因的表達情況與海水鹽度為47、海水鹽度為60處理條件下的表達趨勢是一樣的，隨著山梨醇濃度的增加，基因的表達量逐漸降低。在低山梨醇處理條件下，PyAQP1表達水平顯著上調(P<0.05)，在高山梨醇處理的條件下，PyAQP1的表達水平沒有發生顯著變化(P>0.05)。

溫度處理條件下，在-8℃時，基因的表達量顯著增加，約為正常處理條件下的30倍。在0 ℃時，基因的表達量略高于正常處理條件。當溫度高于條斑紫菜生長的正常溫度時，基因的表達量隨著溫度的升高，呈現逐漸升高的趨勢，且溫度處理20 ℃后，增加的趨勢較小(見圖7)。在溫度處理的各個節點處，PyAQP1表達水平顯著上調(P<0.05)。

3　討論

近年來，AQP家族基因的功能已被廣泛的報道，但是在條斑紫菜中相關家族基因的功能研究尚未報道。本研究從條斑紫菜中克隆了一個AQP基因(PyAQP1)，其全長為1 351bp，含有1個內含子，編碼蛋白氨基酸序列含有典型的MIP(Majorintrinsicprotein)家族中保守NPA結構域，它們可能直接參與水通道蛋白通道的形成[13]。磷酸化是AQP活性調節的一種重要方式，研究表明植物AQP中的PIP、TIP和NIP等亞類都能夠被磷酸化，其磷酸化主要是發生于N端或C端的絲氨酸位點[10]。Nyblom等對菠菜水通道蛋白SoPIP2;1的研究發現，水通道蛋白中絲氨酸的磷酸化可以明顯提高SoPIP2;1的水分轉運活性[19]。本研究中 PyAQP1蛋白氨基酸序列包含13個可能的磷酸化位點，其中8個位于絲氨酸(S)上，4個位于蘇氨酸(T)上，1個位于酪氨酸(Y)上(見圖1)，多個磷酸化位點的存在可能與PyAQP1功能的發揮有關，可增強AQP調控途徑的多樣性[20]。生物信息學預測與亞細胞定位均顯示，PyAQP1編碼蛋白主要定位于質膜上，這與小立碗蘚中的Glps定位在質膜上的結果是一致的[21]。Federico等指出Glps一般存在于低等生物藻類、苔蘚類中，Glps起源于細菌的水平基因轉移(HGT)[22]。系統發生分析顯示，PyAQP1與紅藻中除溫泉紅藻的Glps聚為一支，而溫泉紅藻與綠藻中的小球藻(XP_013897527.1)聚為一支，并進一步與假單胞菌聚在一起。同時綠藻的Glps也并未聚為明顯的獨立支，推測Glps在進化上具有多重起源進一步的研究需要證實Glps的系統發生關系。

水分脅迫是影響生物生長發育的重要脅迫因子。Alex等研究表明，擬南芥在自然干旱和250mmol/L甘露醇處理條件下，不同的AtPIP基因類型分別呈現出上調或者下調表達模式[23-24]。Lian等發現，20%PEG6000處理抗旱水稻“中旱3號”10h后，水通道蛋白PIP表達增加，而不抗旱水稻“秀水63”的水通道蛋白PIP表達下降[25]。Sarda等研究發現，向日葵葉子中SunTIP7在缺水的情況下表達增加，而其根部的SunTIP1;8表達受到抑制[26-27]。本研究中，條斑紫菜在受到干出脅迫時，表達量都高于正常處理條件下的，但是隨著失水量的增加，表達量逐漸降低；在失水率達到80%后進行復水，隨著復水時間的增加，表達量也呈現增加的趨勢。推測，條斑紫菜水分虧缺條件下，葉片中的水通道蛋白基因表達量升高，引起膜上的水通道蛋白密度增大，繼而增加了細胞-細胞途徑水分的運輸，促進藻體對水分的吸收。當失水率達到一定程度后，編碼水通道蛋白的轉錄本表達量下降，推測是由于此時葉片中水通道蛋白含量已經能滿足細胞-細胞途徑水分運輸的需要，且此時水通道蛋白活性的調控更為重要，從而促進細胞-細胞途徑的水分運輸。在復水處理過程中，紫菜細胞有原來的失水狀態變成正常生理狀態，基因表達量增加并高于正常條件，原因可能在于二者細胞所處的微環境不同。正常條件下，細胞水分運輸處于平衡失水后的復水恢復階段，細胞需水量瞬時增加，需要增加水通道蛋白量以增強細胞膜對水的通透能力。

鹽脅迫通過影響植物水通道蛋白的表達量和活性，來降低植物根系的吸水能力[28]。當大麥受到NaCl脅迫后根部的HvPIP2;1表達量下降，但HvPIP1;3和HvPIP1;5的表達量未受到影響。Li等用150mmol·L-1NaCl處理水稻后，研究結果表明葉中OsTIP1;1、OsTIP4;1和OsTIP4;2表達量均先下降后上升，而OsTIP1;2 表達升高，OsTIP4;1, OsTIP4;2則是先下降后上升[29]。條斑紫菜自然生長于潮間帶，退潮后藻體暴露在空氣中，水分蒸發掉后，鹽度會增加。Real-timePCR結果顯示，在低于正常海水鹽度下，基因的表達量是高于正常處理條件的，隨著鹽度逐漸的降低，表達量呈現增加的趨勢；在高于正常海水鹽度下，基因的表達量高于正常處理條件，隨著鹽度的升高，表達量呈現降低的趨勢。推測，在低于海水鹽度下的環境中，條斑紫菜細胞內的滲透勢高于外界環境，為維持細胞活性，紫菜細胞需要從外界吸收水分，水通道蛋白的表達量顯著增加。山梨醇處理對水通道蛋白的表達與鹽度處理的趨勢是一致的。

低溫脅迫會使植物細胞造成生理性缺水進而導致嚴重損傷[24]。研究表明，低溫脅迫下，植物水通道蛋白在轉錄水平呈現出比干旱和高鹽更為復雜的情況，其中涉及水通道蛋白的種類與干旱和高鹽度脅迫相比更為多樣化，PIP、NIP、TIP和SIP基因表達都受到脅迫條件的影響且表達模式相同[24]。Jang等對擬南芥中的PIP亞家族成員的表達情況進行分析，結果表明13個PIP基因對冷脅迫產生響應，除了AtPIP2;5表達呈上升趨勢外，其余的12個PIP基因表達都受到抑制[30]。Sakurai等發現水稻中多數水通道蛋白在受到低溫脅迫時表達受抑制，隨著溫度增加，表達逐漸增加[31]。條斑紫菜葉狀體的生長發育階段主要在冬季，最低溫度可達8 ℃，保持藻體水分平衡對其存活來說至關重要。本研究結果顯示低溫與高溫處理均使其表達量增加，推測在低溫與高溫處理時，藻體通過大量的表達水通道蛋白來維持葉片導水率以及體內水分運輸，減少植株所受溫度脅迫。

4　結語

本研究從條斑紫菜中克隆了一個水通道蛋白基因PyAQP1，開放閱讀框為1 002bp，編碼一個含333個氨基酸殘基的多肽，定位于細胞質膜上，進化分析結果顯示PyAQP1屬于Glps類。在失水、鹽度、溫度脅迫下該基因都上調表達。條斑紫菜作為一種研究潮間帶藻類生理生態以及逆境脅迫適應機制的代表性模式物種，本文對水通道蛋白的研究能夠為揭示條斑紫菜逆境適應機制奠定基礎。

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責任編輯高蓓

CloningandExpressionAnalysisofPyAQP1inPyropia yezoensis

YANGJun-Qing1,KONGFan-Na1,LIChao1,BIGui-Qi1,SUNMei-Juan2，ZHAOHai-Long1,LINa1,MAOYun-Xiang1

(1.TheKeyLaboratoryofMarineGeneticsandBreeding,MinistryofEducation,OceanUniversityofChina,Qingdao266003,China;2.DepartmentofPharnacy,theAffiliatedHospitalofQingdaoUniversity,Qingdao266021,China)

Aquaporinsareancientchannelproteinslocalizedinbiologicalmembranesandfacilitatingwatertransportthroughcellmembranesrapidly.Aquaporinplaysanimportantroleinplantwaterhomeostasisthroughthefacilitationofwatertransportandsolutes.TheredmacroalgaeP. yezoensis,classifiedasBangiophyceae,isasuitablespeciesfortheelucidationofmolecularmechanismsregulatingenvironmentalstressesinmarineredalgae.However,currentlylittleisknownabouttheAQPgenesinP. yezoensis.APyAQP1gene(GINumberisKT735045)wasisolatedthroughtsilicoclone,basedonthetranscriptomicdatainthisresearch.ThefulllengthofPyAQP1containedoneintronwiththesizeof200bp,andanopenreadingframeof1 151bpencoding333aminoacids.Theisoelectricpoints(PI)andmolecularweights(MW)ofthePyAQP1aminoacidsequencewere35.4kDand6.43,respectively.TheanalysisofPyAQP1aminoacidsequencesshowedthatPyAQP1containedtheMIPfamilysignatureNPAmotifaswellassixtransmembraneregions.AnalysisofmultiplesequencealignmentandphylogenetictreeshowedthatPyAQP1sharedverylowsimilaritytoanyotherplantMIPbutasurprisinglyhighsimilaritytoasubclassofbacterialGlps.TheplasmidconstructencodingPyAQP1-GFPunderthecontrolofthe35Spromoterwastransformedintoonionepidermalcellsbyparticlebombardment.ThetransientexpressionanalysisinonionepidermalcellsshowedusthatthePyAQP1proteinwaslocalizedinthecellplasmamembrane,comparedtothecontrol35S::GFPinthenucleus,cytoplasmandplasmamembraneofthecells.Tobetterunderstandtheshort-termexpressionpatternsofPyAQP1inresponsetoabioticstress,qRT-PCRwasusedtoinvestigatetheexpressionpatternsofPyAQP1indifferenttreatmentconditions(salt,droughtandtemperature).Underdroughtstress,theexpressionlevelofPyAQP1decreasedwiththeincrementofthewaterlossrate.Itwasnotingthattheexpressionincreasedwhenrehydrationafterdehydrationreached80%.TheexpressionpatternsofPyAQP1undersorbitolandNacltreatmentwassimilarandtheexpressionlevelofPyAQP1decreasedwithsalinityincreasing.Undertemperaturestress,theexpressionofPyAQP1increasedsignificantlyat-8 ℃,andtheexpressionat0 ℃wasslightlyhigherthannormaltreatment.However,theexpressionofPyAQP1graduallyincreasedwiththetemperatureincreasing,whengrowthtemperatureincreasesby10 ℃.Inthiswork,wereportedtheisolationandexpressioncharacterizationofthePyAQP1geneintheP. yenozesis,whichprovidetheinsightsforunderstandingthemechanismsofPyAQP1respondingtoabioticstresses.

Pyropia yezoensis;aquaporin;subcellularlocalization;Realtime-PCR;abioticstress

國家高技術研究發展計劃項目(2012AA10A401；2012AA10A406)資助

2015-12-25；

2016-03-21

楊俊卿(1990-)，女，碩士生。E-mail:yjqouc@163.com

**通訊作者：E-mail:fnkong@ouc.edu.cn

Q945.78

A

1672-5174(2016)08-079-08

10.16441/j.cnki.hdxb.20150425

SupportedbytheNationalHighTechnologyResearchandDevelopmentProgramofChina(2012AA10A401;2012AA10A406)