恩諾沙星納米乳的體外抗菌活性及治療仔豬大腸桿菌性腹瀉的效果觀察

楊雪峰,柳東陽,王自良,齊永華,韓慶功,孫亞偉(河南科技學(xué)院動物科學(xué)學(xué)院,河南新鄉(xiāng)453003)

恩諾沙星納米乳的體外抗菌活性及治療仔豬大腸桿菌性腹瀉的效果觀察

楊雪峰,柳東陽,王自良,齊永華,韓慶功,孫亞偉
(河南科技學(xué)院動物科學(xué)學(xué)院,河南新鄉(xiāng)453003)

利用試管二倍稀釋法研究了恩諾沙星納米乳的體外抗菌活性,并對恩諾沙星納米乳治療仔豬大腸桿菌性腹瀉的效果進行了觀察.結(jié)果表明,恩諾沙星納米乳對標準菌株的抗菌活性為恩諾沙星原料藥的2倍,是其常規(guī)制劑抗菌活性的2～8倍;對臨床分離菌株的抗菌活性是其常規(guī)制劑的4～8倍;恩諾沙星納米乳對仔豬大腸桿菌性腹瀉的治愈率為93.3%,說明恩諾沙星納米乳具有較強的體外抗菌活性,且對仔豬大腸桿菌性腹瀉的臨床治療效果較好.

恩諾沙星;納米乳;最小抑菌濃度;腹瀉

恩諾沙星是第一個被批準允許使用的喹諾酮類動物專用抗菌藥[1],為廣譜殺菌藥,在獸醫(yī)臨床中應(yīng)用非常廣泛,主要用于治療各種動物由革蘭陰性菌和革蘭陽性菌引起的消化、呼吸和泌尿系統(tǒng)等感染,但水溶性差一直是影響恩諾沙星制劑發(fā)展和臨床應(yīng)用的一個關(guān)鍵因素.為此,楊雪峰等利用納米乳作為藥物載體,研制出一種恩諾沙星納米乳[2-3],并就其制備方法申請了國家發(fā)明專利.本試驗初步研究了恩諾沙星納米乳的體外抗菌活性及臨床治療仔豬大腸桿菌性腹瀉的效果,以期為其在獸醫(yī)臨床中的推廣應(yīng)用提供參考.

1　材料與方法

1.1標準菌株大腸桿菌ATCC25922(批號:44113-10)和金黃色葡萄球菌ATCC25923(批號:26112-8),均購自中國藥品生物制品檢定所.

1.2臨床分離菌株3種主要病原菌的臨床分離株:金黃色葡萄球菌、沙門菌和大腸桿菌,均由河南科技學(xué)院微生物教研室提供.

1.3實驗動物通過臨床診斷和實驗室檢驗確診為大腸桿菌性腹瀉的仔豬(35±2)日齡,60頭.

1.4試驗藥品恩諾沙星原料藥,鄭州凡盛生物技術(shù)有限公司,批號20090930;恩諾沙星納米乳,參照文獻[2-3]制備;恩諾沙星注射液,吉林省五星動物保健藥廠,批號20100201;恩諾沙星可溶性粉劑,河南伯樂獸藥有限公司,批號20100712;恩諾沙星混懸液,參照文獻[4]制備.

1.5方法

1.5.1體外抗菌活性測定最小抑菌濃度(MIC)的測定:采用試管二倍稀釋法[5],用pH值6.0的PBS無菌配制各抗菌藥物原液,使其濃度為1 280 μg/mL.然后將濁度為9.0X108個CFU/mL的菌液用MHB培養(yǎng)液做1∶10 000稀釋,除第1管加入1.8 mL稀釋后的菌液外,其余各管均加1 mL.在第1管內(nèi)加入0.2 mL抗菌藥物原液,混合后吸取1 m L加入第2管中,同法依次稀釋至倒數(shù)第3管,棄去1 mL,倒數(shù)第2管為生長對照管(陽性對照管,即只加菌液不加藥液),倒數(shù)第1管為抗菌藥物原液和MHB培養(yǎng)液的混合物(陰性對照管).上述各管37℃培養(yǎng)24 h后觀察結(jié)果,以無細菌生長的最低濃度為MIC.重復(fù)5次,取眾數(shù)為MIC值[6].

最小殺菌濃度(MBC)的測定:將MIC濃度以上的試管接種于不含藥物的MHA培養(yǎng)基平板上,繼續(xù)培養(yǎng)24 h,以菌落數(shù)不超過5個的培養(yǎng)基的最低藥物濃度為該藥物的MBC.重復(fù)5次,取眾數(shù)為MBC值[6].

1.5.2恩諾沙星納米乳治療仔豬大腸桿菌性腹瀉的效果觀察試驗分組:試驗分為4組:恩諾沙星納米乳組(以恩諾沙星計,5 mg/kg體重)、恩諾沙星可溶性粉劑組(以恩諾沙星計,5 mg/kg體重)、感染對照組(感染豬不投藥)和正常對照組(健康豬).每組15頭豬.

恩諾沙星納米乳和可溶性粉劑均用水配制成相同濃度的溶液,然后按每公斤體重5 mg,每日早晚各1次灌服給藥的方式,連續(xù)給藥5 d.治療期間,每天早晚兩次觀察各組豬的精神狀態(tài)、食欲、大便狀況、肛門紅腫情況及肛周的干濕度等臨床癥狀,并記錄死亡情況.

療效判定:(1)治愈率:豬的精神狀態(tài)、食欲、糞便完全恢復(fù)正常.試驗結(jié)束時計算治愈率; (2)有效率:完全治愈的豬和試驗豬的精神、食欲明顯好轉(zhuǎn),拉稀次數(shù)明顯減少,或臨床癥狀緩解的均為有效.試驗結(jié)束時計算有效率;(3)死亡率:試驗結(jié)束時計算各組的死亡率.

數(shù)據(jù)處理:試驗數(shù)據(jù)經(jīng)SPSS 11.5統(tǒng)計軟件處理,采用χ2檢驗差異顯著性.

2　結(jié)果與分析

2.1恩諾沙星納米乳對標準菌株的MIC和MBC見表1.

表1　恩諾沙星納米乳對標準菌株的MIC和MBC (μg/m L)

由表1可知,恩諾沙星納米乳液對標準菌株的抗菌活性均為恩諾沙星原料藥的2倍,是其常規(guī)制劑抗菌活性的2～8倍.結(jié)果表明,納米化處理增強了恩諾沙星原料藥的抗菌活性,與其常規(guī)制劑相比,恩諾沙星納米乳具有較強的抗菌作用.

2.2恩諾沙星納米乳對臨床分離菌株的MIC和MBC見表2.

由表2可知,恩諾沙星納米乳對臨床分離菌株的MIC是其常規(guī)制劑的1/4～1/8倍,MBC是常規(guī)制劑的1/4～1/16倍.結(jié)果表明,恩諾沙星納米乳對臨床分離菌株具有較強的抗菌活性.

2.3恩諾沙星納米乳治療仔豬大腸桿菌性腹瀉的臨床效果見表3.

表2　恩諾沙星納米乳對臨床分離菌株的MIC和MBC (μg/mL)

表3　恩諾沙星納米乳對仔豬大腸桿菌性腹瀉的臨床治療試驗

經(jīng)恩諾沙星納米乳灌服給藥治療1 d后,試驗豬的臨床癥狀明顯緩解;2 d后豬只臨床癥狀明顯減輕,食欲逐漸恢復(fù)正常;3 d后即恢復(fù)正常.經(jīng)恩諾沙星可溶性粉劑治療的仔豬上述臨床好轉(zhuǎn)癥狀推后0.5～2 d,治愈仔豬灌服給藥5 d恢復(fù)正常.在感染對照組,豬只腹瀉嚴重,死亡率高達46.7%,耐過仔豬生長緩慢,有成為僵豬的趨勢.統(tǒng)計學(xué)分析表明,恩諾沙星納米乳組與可溶性粉劑組對仔豬大腸桿菌性腹瀉的治愈率比較,差異顯著(P<0.05),見表3.與感染對照組相比,恩諾沙星納米乳可極顯著降低感染仔豬的死亡率(P<0.01).

3　討論

近年來,獸藥制劑已由粉劑、注射劑、溶液劑、混懸劑、片劑、預(yù)混劑等常規(guī)劑型轉(zhuǎn)向緩釋、控釋、靶向等新型制劑方向發(fā)展.目前,納米乳已成為人用藥物藥劑學(xué)領(lǐng)域研究的一個熱點,并在多種給藥系統(tǒng)中呈現(xiàn)出廣闊的發(fā)展前景,但其在改造常規(guī)獸藥方面的研究報道較少.本課題組以納米乳為藥物載體,成功研制出水包油型(O/W)恩諾沙星納米乳制劑,解決了恩諾沙星水溶性差的問題,并具有制備工藝簡單、載藥量高、穩(wěn)定性好、方便群體飲水給藥、成本低廉等優(yōu)點[2].對其體外抗菌活性的研究結(jié)果表明,恩諾沙星研制成納米乳制劑后,對臨床常見病原菌的體外抗菌活性強,優(yōu)于其常規(guī)制劑.其抗菌活性較強的原因可能在于恩諾沙星被藥物載體包裹后,藥物粒徑小至納米級,易于透過細菌的細胞壁,且載藥納米乳的比表面積大,從而增加了菌體內(nèi)的藥物濃度,增強了抗菌作用.關(guān)于恩諾沙星納米乳的確切抗菌機理還有待于深入的研究.

斷奶仔豬大腸桿菌性腹瀉是由致病性大腸桿菌引起的一種仔豬常見病和多發(fā)病,主要表現(xiàn)為腸炎、腹瀉、排出白色或黃色稀糞等多種臨床癥狀[7].本病已成為規(guī)模化養(yǎng)豬場影響仔豬生長性能的重要疾病之一.盡管控制該病的方法較多,但目前還主要是以敏感性抗菌藥物的治療效果較好.恩諾沙星納米乳是一種新型抗菌制劑,常見病原菌對其敏感性較常規(guī)制劑高,因此其對感染性疾病的治療效果較好.本試驗中,恩諾沙星納米乳對仔豬大腸桿菌性腹瀉的治療效果好,與可溶性粉劑組比較,差異顯著(P<0.05),同時縮短治療時間0.5～2 d,說明恩諾沙星納米乳能有效治療仔豬大腸桿菌性腹瀉,縮短治療時間,減少用藥次數(shù),從而提高生產(chǎn)效益.建議臨床中應(yīng)用恩諾沙星納米乳治療仔豬大腸桿菌性腹瀉病時,按5 mg/kg體重劑量(以恩諾沙星計)灌服給藥,連用3～5 d,并可在病情嚴重時增大給藥劑量.

[1]Ribeiro C,Lopes S C,Gameiro P.New insights into the transloca?tion route of enrofloxacin and its metalloantibiotics[J].The Journal of Membrane Biology,2011,241(3):117-125.

[2]楊雪峰,齊永華,寧紅梅,等.恩諾沙星納米乳的制備及其質(zhì)量評價[J].浙江大學(xué)學(xué)報(農(nóng)業(yè)與生命科學(xué)版),2012,38 (6):693-699.

[3]楊雪峰,趙恒章,王自良,等.一種恩諾沙星納米乳液及其制備方法[P].中國發(fā)明專利,CN201010109707.8,20l0-06-23.

[4]吳海坤,方炳虎,時書寧.恩諾沙星混懸液的研制及其在雞組織中的殘留研究[J].動物醫(yī)學(xué)進展,2010,31(4):47-52.

[5]馬興樹.禽傳染病實驗診斷技術(shù)[M].北京:化學(xué)工業(yè)出版社, 2005:108-111.

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S859.79+6

B

0529-6005(2016)02-0105-02

2014-08-04

河南教育廳科學(xué)技術(shù)研究重點項目(13A230306);河南科技學(xué)院博士科研啟動經(jīng)費項目(09006)

楊雪峰(1973-),女,副教授,博士,研究方向為獸醫(yī)藥理學(xué),E-mail:yangxuefeng2003@126.com