c-FLIP 在不同宮頸組織中的表達及臨床意義

陳　聃，凌　文，陳　賽（長沙市第三醫院婦產科，湖南長沙410015）

·論著·

c-FLIP 在不同宮頸組織中的表達及臨床意義

陳聃，凌文，陳賽（長沙市第三醫院婦產科，湖南長沙410015）

目的研究c-FLIP在宮頸癌、宮頸上皮內瘤變（CIN）、正常宮頸的表達情況。方法選取2010～2014年該院病理科存檔且臨床資料完整的婦產科門診及住院患者的宮頸組織蠟塊共118例，其中正常宮頸18例，宮頸上皮內瘤變Ⅰ級（CINⅠ級）17例，宮頸上皮內瘤變Ⅱ～Ⅲ級（CINⅡ～Ⅲ級）16例，宮頸癌67例，采用免疫組化SP方法檢測c-FLIP在正常宮頸、CIN、宮頸癌中的表達，并對宮頸癌的FIGO分期、有無淋巴結轉移、分化程度和病理類型等進行相關性分析。結果c-Flip在正常宮頸、CINⅠ級、CINⅡ～Ⅲ級以及宮頸癌組中的陽性表達率分別為11.1%、23.5%、62.5%、85.1%，CINⅡ～Ⅲ級組、宮頸癌組與正常宮頸組、CINⅠ級組比較，差異均有統計學意義（P＜0.05），而宮頸癌組與CINⅡ～Ⅲ級組、CINⅠ級組與正常宮頸組比較，差異均無統計學意義（P＞0.05）。c-FLIP蛋白在宮頸癌低分化組陽性表達率均高于高、中分化組（P＜0.05），而與患者的FIGO分期、淋巴結轉移及病理類型無關（P＞0.05）。結論c-FLIP與宮頸癌的發生、發展密切相關，對宮頸癌病變程度的評估有一定參考價值，可能成為治療宮頸癌的潛在靶點。

c-FLIP；宮頸腫瘤；宮頸上皮內瘤樣病變；子宮頸；免疫組織化學

宮頸癌是目前全世界最為常見的婦科惡性腫瘤之一，在全世界女性中的發病率僅次于乳腺癌，也是發展中國家女性最主要的死亡原因之一。近年來，宮頸癌的發病率明顯增加，而且其發病率還有年輕化的趨勢。宮頸癌的發生、發展是一個復雜而且漫長的過程，并且由多種基因參與，隨著分子生物學技術的逐漸發展，研究者發現無論是腫瘤增殖還是凋亡，都與腫瘤相關基因的表達與調控有關。近幾年新發現，c-FLIP蛋白也屬于一類天然存在的凋亡抑制蛋白，具有死亡效應結構［1］。有研究表明，在多種人類腫瘤組織中c-FLIP蛋白呈高表達狀態，且與許多人類腫瘤的發生、發展關系密切［2］，

本研究旨在初步探討c-FLIP蛋白在宮頸不同組織中表達的臨床意義，具體報道如下。

1　資料與方法

1.1一般資料選取2010～2014年本科手術或者活檢患者，經本院病理科閱片證實的宮頸組織蠟塊共118例，其中正常宮頸18例，宮頸上皮內瘤變Ⅰ級（CINⅠ級）17例，宮頸上皮內瘤變Ⅱ～Ⅲ級（CINⅡ～Ⅲ級）16例，宮頸癌67例，67例宮頸癌患者年齡25～73歲，平均（47.22± 9.71）歲，其中鱗癌50例，腺癌17例；根據分化程度分，高中分化16例，低分化51例；＞40歲49例，≤40歲18例；FIGO臨床分期，Ⅰ期27例，Ⅱa～Ⅱb期40例；有無淋巴結轉移，淋巴結轉移陰性49例，陽性18例；16例CINⅡ～Ⅲ級患者年齡27～57歲，平均（41.44±8.33）歲。17例CINⅠ級患者，年齡23～47歲，平均（34.88±7.38）歲。18例正常宮頸患者，年齡29～51歲，平均（38.94± 6.47）歲。所選病例臨床資料完整。

1.2方法

1.2.1免疫組化兔抗人c-FLIP多克隆抗體購于北京博奧森生物技術有限公司，兔Streptavidin-HRP試劑盒購買于北京康為世紀生物科技有限公司。石蠟切片常規脫蠟水化，內源性過氧化物酶封閉，微波抗原修復，血清封閉，兔抗人c-FLIP多克隆抗體1∶150 4℃孵育過夜，再以生物素標記的羊抗兔IgG 37℃孵育15 min，HRP標記鏈霉素親和素37℃孵育10 min，最后用DAB顯色，蘇木素復染，乙醇逆度脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。每一步驟間均用pH7.4 PBS緩沖液漂洗3次，每次5 min。

1.2.2判斷標準用PBS代替一抗作為空白對照，用生物公司提供的陽性切片作為陽性對照。參照Axiotis等［3］的標準，陽性細胞所占比例和高倍鏡（×400）下綜合染色強度進行半定量測定。c-FLIP的陽性表達主要在細胞質中出現淡黃色至棕褐色顆粒，陰性者無此變化。鏡下取5個（400×）高倍鏡視野，每個視野計數200個左右細胞，判斷標準如下：（1）計數陽性細胞數占細胞總數的比例并評分：4分：＞75%；3分：＞50%～75%；2分：＞25%～50%；1分：＞5%～25%；0分：0%～5%。（2）根據著色細胞的著色強弱評分：3分：棕褐色；2分：棕黃色；1分：淡黃色；0分：無著色。（3）以上2項評分結果相加后判斷：5～7分：+++；3～4分：++；1～2分：+；0分：-。統計分析時（-）為陰性表達，（+）、（++）、（+++）均為陽性表達。

1.3統計學處理應用SPSS20.0統計軟件進行數據分析，計數資料以率或構成比表示，采用χ2檢驗，計量資料以表示，采用t檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2　結　果

2.1c-FLIP蛋白在CIN、宮頸癌中及正常宮頸中的表達在細胞質里面，主要是c-FLIP蛋白的陽性表達區，陽性細胞往往呈淡黃色至棕褐色顆粒，正常宮頸中未見明顯c-FLIP染色陽性細胞（圖1），CIN中c-FLIP染色陽性細胞呈彌散分布（圖2），而宮頸癌中c-FLIP染色陽性細胞成團分布（圖3）。

圖1　正常宮頸中c-FLIP呈陰性表達（左圖：×100；右圖：×400）

圖2　CINⅢ中c-FLIP呈陽性表達（左圖：×100；右圖：×400）。

圖3　宮頸癌中c-FLIP呈陽性表達（左圖：×100；右圖：×400）。

c-FLIP蛋白在正常宮頸、CINⅠ級、CINⅡ～Ⅲ級以及宮頸癌組中的陽性表達率分別為 11.1%（2/18）、23.5%（4/17）、62.5%（10/16）、85.1%（57/67），呈逐漸遞增的趨勢，見表1。除宮頸癌組與CINⅡ～Ⅲ級組、CINⅠ級組與正常宮頸組比較，差異無統計學意義（P＞0.05）外，其余各組間兩兩比較，差異均有統計學意義（P＜0.05）。

表1　c-FLIP蛋白在正常宮頸、CIN及宮頸癌組織中的表達情況

2.2c-FLIP蛋白的表達與宮頸癌臨床病理參數之間的關系FIGOⅠ期宮頸癌患者c-FLIP蛋白陽性表達率為77.8%（21/27），Ⅱa～Ⅱb期宮頸癌患者c-FLIP蛋白陽性表達率為90.0%（36/40），兩組間比較，差異無統計學意義（P=0.304）；c-FLIP蛋白在淋巴結轉移陽性組的陽性表達率為94.4%（17/18），在淋巴結轉移陰性組的陽性表達率為81.6%（40/49），兩組間比較，差異無統計學意義（P=0.359）；c-FLIP蛋白在低分化組的陽性表達率為92.2%（47/51），在高分化組的陽性表達率為62.5%（10/16），兩組比較，差異有統計學意義（P=0.012）；c-FLIP蛋白在宮頸鱗狀細胞癌組中的陽性表達率為84.0%（42/50），在宮頸腺癌組中的陽性表達率為88.2%（15/17），兩組間比較，差異無統計學意義（P=0.977）。見表2。

表2　c-FLIP蛋白的表達與宮頸癌臨床病理參數之間的關系

3　討　論

隨著分子生物學的發展，人們逐漸認識到惡性腫瘤的發生、發展過程中存在多個功能不同的基因異常激活或者失活，即細胞的癌變是由多基因、多階段互相配合、共同作用的結果。不僅僅是細胞增殖失控、分化異常的結果，更重要的是與細胞凋亡調節失控（凋亡程序被抑制，細胞周期調控被破壞）有密切的關系。細胞凋亡（apoptosis）又稱程序性細胞死亡，是一種自主性細胞有序死亡的過程，并在復雜和嚴格的信號網絡調控下完成，而這些因素又是體外誘因，細胞凋亡受到死亡配體、化療藥、DNA損傷、紫外線、細胞因子等多種因素的影響，正常情況下，體內細胞凋亡平衡，維持著自身細胞增殖和死亡之間的動態平衡。與凋亡相關的信號通路有線粒體依賴的內源性凋亡通路和配體結合誘導的外源性凋亡通路。細胞通過影響內源性或者外源性的機制來逃避凋亡，從而導致腫瘤的發生。因此，為了更進一步了解腫瘤的發生，提高臨床腫瘤的診治率，加強細胞凋亡相關的因子研究無疑是一種有效的途徑。

FLIP是由Thome等［4］于1997年發現，病由所在研究的病毒中首次分離出來，并發現有皰疹病毒編碼，稱之為vFLIP（viral FLIP）。同年，Irmler等［5］推測FLIP也可能存在細胞中，隨后在研究惡性黑色素瘤時發現腫瘤細胞質內亦存在可以抑制細胞凋亡的高表達的FLIP，首先將其命名為c-FLIP（cellular FLIP，c-FLIP）。c-FLIP被認為是一種重要的細胞凋亡抑制蛋白，其過量表達能抑制Fas，TRAIL-R，DR3，TNFR-1等介導的凋亡途徑，使異常的腫瘤細胞凋亡減少，從而使腫瘤細胞數目增加，最終發展為癌變。c-FLIP在病毒、真核生物、哺乳動物等許多物種中廣泛存在，定位于人染色體2號染色體長臂3區3-4帶（2q33-34），目前已經鑒定出13個基因型，但僅有3個可轉錄出蛋白：長片段c-FLIPL、短片段c-FLIPS及來自淋巴瘤細胞c-FLIPR，其相對分子質量分別為55×103、26×103、24×103。三者在N端均存在2個串聯的與Fas的死亡結構域（death domain，DD）的功能相似的含40個氨基酸死亡效應結構域（DED），但是在C端則差異很大。c-FLIPL與c-FLIPS、c-FLIPR比較，C端多了Caspase蛋白水解酶區域，即一個與Caspase8相似的Caspase同源結構域，但由于組氨酸和半胱氨酸在Caspase8中主要起催化的作用，而這2個氨基酸殘基在c-FLIP中卻被精氨酸和酪氨酸替代，因而c-FLIP便喪失了蛋白水解酶的活性，可競爭性結合Fas相關死亡區（Fas-associated death domain，FADD）或Caspase8/10上的死亡效應區（DED），阻斷死亡信號復合體（DISC）形成和Caspase8/10的活化，使Caspase8的級聯反應不能繼續，從而抑制死亡受體Fas介導的細胞凋亡［1］。目前Fas-FasL介導的信號通路是研究較為清楚的細胞凋亡途徑。Fas 與FasL識別后被活化，形成聚合體，使Fas的DD聚集，Fas以DD為橋梁與FADD結合，形成死亡誘導信號復合體（death-inducing signaling complex，DISC），之后借其DED與Caspase8前體的DED結合，使Caspase8前體寡聚，并使其活化為Caspase-8，進而活化下游Caspase效應子（caspase-3，caspase-7），產生級聯反應，最終使細胞凋亡。

c-FLIP蛋白在許多腫瘤中高表達，而在其對應的良性病變或正常組織中低表達或者不表達。相關研究發現在惡性黑色素瘤中c-FLIP蛋白表達率明顯高于良性病變。亦有研究表明c-FLIP蛋白在其他腫瘤組織中高表達［6-7］，而其對應的正常組織或者良性病變中不表達或者低表達。Wilkie-Grantham等［8］用42例子宮內膜癌和22例正常子宮內膜進行免疫組化，發現c-FLIP蛋白在前者中明顯強表達。陳立立等［9］在動物實驗中發現，卵巢癌動物血清中的c-FLIP蛋白表達明顯增多。本研究結果顯示c-FLIP蛋白表達陽性的細胞呈淡黃色至棕褐色顆粒，陽性著色主要位于細胞質中。c-FLIP蛋白的表達水平隨著宮頸病變級別的升高而有明顯增高趨勢，且宮頸癌組、CINⅡ～Ⅲ級組與正常組、CINⅠ級組比較，差異有統計學意義。提示檢測c-FLIP蛋白可能參與了宮頸癌的發病過程。

此外，本研究還探討了c-FLIP蛋白與宮頸癌臨床病理參數之間的關系，結果證實c-FLIP蛋白的表達與FIGO分期、有無淋巴結轉移及病理類型無關，僅與細胞分化程度相關，在低分化組高表達，在高分化組低表達。提示檢測c-FLIP蛋白可能有助于宮頸癌病變程度的評估。有研究報道，在乳腺癌中c-FLIP蛋白的表達與乳腺癌組織分級之間有顯著相關性，隨組織分級增高表達升高［10］，此與本研究結果相似。然而也有不少研究結果與本研究有差別，如c-FLIP蛋白的表達水平與子宮內膜癌的臨床分期及肌層浸潤深度呈顯著性相關，在臨床分期較晚和肌層浸潤較深組c-FLIP蛋白表達水平顯著增高［11］。其表達與胃癌的浸潤轉移密切相關［7］。而cFLIP蛋白在不同腫瘤中的作用有所不同，可能是因為cFLIP蛋白存在其他調節機制，從而使其對不同腫瘤的生物學行為有不同的影響，這值得進一步研究。

綜上所述，c-FLIP可能參與了宮頸癌的發病過程。c-FLIP蛋白在低分化組中的表達高于高中分化組，提示c-FLIP對宮頸癌病變程度的評估有一定參考價值。

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Expression and clinical significance of c-FLIP in different cervical tissues

Chen Dan，Ling Wen，Chen Sai（Department of

Obstetrics and Gynecology，Changsha Municipal Third Hospital，Changsha，Hunan 410015，China）

ObjectiveTo detect the expression situationof c-FLIP in cervical carcinoma，CIN and normal cervix.MethodsA total of 118 paraffin embedded cervical tissue samples in the pathology department of our hospital for keeping in the achieves and with intact data during 2010-2014 were selected，including 18 cases of normal cervix，17 cases of cervical intraepithelialneoplasia gradeⅠ（CINI），16cases of CINgradeⅡ-Ⅲ（CINⅡ-Ⅲ）and 67 cases of cervicalcancer.The immunohistochemical SP method was used to detect the expression of c-FLIP protein in normal cervix，CIN and cervical carcinoma.Then the correlation analysis of the cervical cancer clinical FIGO classification，lymph node metastasis，differentiation degree and pathological type was performed.ResultsThe positive expression rates of c-FLIP in normal cervix，CINⅠ，CINⅡ-Ⅲand cervical cancer tissues were 11.1%，23.5%，62.5%and 85.1%respectively，the differences between the CINⅡ-Ⅲgroup and cervical cancer group with the normal cervix group and CINⅠgroup were statistically significant（P＜0.05），but the differences between the cervical cancer group and CINⅡ-Ⅲgroup and between the CIN I group and normal cervix group were not statistically significant（P＞0.05）.The positive expression rate of c-FLIP in the low differentiation group of cervical cancer was higher than that in the high and middle differentiation groups（P＜0.05），while which had no relation with the FIGO classification，lymph node metastasis and pathological type（P＞0.05）.Conclusionc-FLIP is closely related with the occurrence and progression of cervical cancer，has certain reference value for evaluating the cervical cancer lesion and may become a potential target point for treatming cervical cancer.

c-FLIP；Uterine cervical neoplasms；Cervical intraepithelial neoplasia；Cervix uteri；Immunohistochemistry

·論著·

10.3969/j.issn.1009-5519.2016.03.009

A

1009-5519（2016）03-0346-03

陳聃（1981-），主治醫師，碩士研究生，主要從事婦產科臨床工作。

（2015-10-12）