阿托伐他汀對(duì)小鼠腎毒血清性腎炎保護(hù)作用的研究

屠海燕（浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第二醫(yī)院腎臟內(nèi)科，浙江杭州321000）

阿托伐他汀對(duì)小鼠腎毒血清性腎炎保護(hù)作用的研究

屠海燕（浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第二醫(yī)院腎臟內(nèi)科，浙江杭州321000）

目的探討他汀類藥物對(duì)小鼠腎毒血清性腎炎的干預(yù)治療作用。方法建立小鼠腎毒血清性腎炎模型，治療組小鼠于注射腎毒血清（NTS）造模成功24 h內(nèi)腹腔注射劑量分別為1、10、25 mg/kg阿托伐他汀。聯(lián)合注射NTS+阿托伐他汀治療7 d后處死所有小鼠，取血并收集24 h尿液，測(cè)定血清尿素氮（BUN）水平，尿蛋白含量，檢查腎臟病理組織學(xué)變化。結(jié)果阿托伐他汀治療組與模型組比較，實(shí)驗(yàn)小鼠體質(zhì)量增加不明顯，尿蛋白含量降低（P＜0.01），血清BUN含量減少（P＜0.01），腎炎病理改變程度輕。阿托伐他汀的保護(hù)作用呈劑量依賴性，10 mg/kg治療組的保護(hù)作用最強(qiáng)。結(jié)論阿托伐他汀可有效地減輕實(shí)驗(yàn)動(dòng)物尿蛋白，改善腎小球?yàn)V過功能，對(duì)小鼠免疫性腎炎具有保護(hù)作用。

腎小球腎炎/血液；血尿素氮；免疫活性；炎癥；吡咯類

腎毒血清性腎小球腎炎，又稱抗基底膜腎炎，是異體抗基底膜（glomerular basement membrane，GBM）抗體直接與腎小球上的GBM抗原相結(jié)合而誘導(dǎo)形成的一種免疫介導(dǎo)的炎癥性疾病［1］。目前，免疫調(diào)節(jié)治療是有效治療免疫介導(dǎo)性腎小球疾病的重要手段之一。阿托伐他汀是目前國(guó)內(nèi)最新一代他汀類藥物（3-羥基-3-甲基輔酶A還原酶抑制劑）。研究證實(shí)，他汀類藥物除降低血清膽固醇和三酰甘油，防治動(dòng)脈粥樣硬化的形成，預(yù)防和減少冠心病不良事件的發(fā)生外，同時(shí)還具有抗炎，免疫調(diào)節(jié)等獨(dú)立于降脂的作用，有證據(jù)支持其對(duì)腎臟疾病具有保護(hù)作用［2-4］。由腎毒血清（NTS）誘導(dǎo)的腎毒血清性腎炎是發(fā)病機(jī)制、病理改變唯一類似于人抗GBM病的腎小球性腎炎實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型。本研究通過注射含抗GBM抗體的兔血清制備小鼠腎毒血清性腎炎模型，探討新型他汀類藥物阿托伐他汀對(duì)腎毒血清性腎炎的治療效果，并且尋求最佳注射劑量，從而為汀類藥物治療免疫性腎炎提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1　材料與方法

1.1動(dòng)物與試劑雌性C57BL/6小鼠購(gòu)于浙江大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，均為8～12周齡，體質(zhì)量17～22 g阿托伐他汀購(gòu)自輝瑞公司，兔抗鼠腎小球基底NTS由本實(shí)驗(yàn)室制。

1.2方法

1.2.1檢測(cè)指標(biāo)24 h尿蛋白，血清尿素氮（BUN）含量由全自動(dòng)生化分析儀測(cè)定。病理學(xué)檢查：取小塊腎皮質(zhì)用多聚甲醛固定后，石蠟包埋，制成切片后行蘇木精-伊紅（HE）染色。觀察腎小球體積大小，腎小球內(nèi)細(xì)胞數(shù)，新月體形成及腎小管內(nèi)蛋白管型等變化情況。

1.2.2腎炎模型制造參照文獻(xiàn)［5-6］介紹的方法，結(jié)合本實(shí)驗(yàn)室實(shí)際情況制備兔抗鼠腎小球基底膜NTS。所有的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物應(yīng)用正常兔IgG（每只5 mg）加完全弗氏佐劑皮下注射進(jìn)行預(yù)免疫，5 d后應(yīng)用兔抗鼠腎小球基底膜的腎毒性血清10 mL/kg體質(zhì)量經(jīng)尾靜脈注射。

1.2.3實(shí)驗(yàn)分組設(shè)計(jì)雌性小鼠40只，隨機(jī)分為四組：模型組（n=10）：尾靜脈注射兔抗鼠腎小球基底膜NTS10 mL/kg，不給予任何治療；低劑量阿托伐他汀干預(yù)組（n=10）：注射NTS后24 h內(nèi)給予阿托伐他汀1 mg/kg每天腹腔注射，連續(xù)注射7 d；中劑量阿托伐他汀干預(yù)組（n=10）：注射NTS后24 h內(nèi)給予阿托伐他汀10 mg/kg每天腹腔注射，連續(xù)注射7 d；高劑量阿托伐他汀干預(yù)組（n=10）：注射NTS后24 h內(nèi)給予阿托伐他汀25 mg/kg每天腹腔注射，連續(xù)注射7 d；所有小鼠于第7天斷頭處死，留取24 h尿檢測(cè)尿蛋白，取血測(cè)BUN，處死后取腎組織病理檢查。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理應(yīng)用SPSS18.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，所有數(shù)據(jù)均以表示，組間差異顯著性采用t檢驗(yàn)判定。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)　果

2.1阿托伐他汀治療有效抑制了小鼠腎毒血清性腎炎C57BL/6小鼠注射NTS后出現(xiàn)了嚴(yán)重的腎炎表現(xiàn)：嚴(yán)重蛋白尿，少尿型急性腎功能衰竭，同時(shí)組織學(xué)證據(jù)證實(shí)為急性腎小球腎炎。相比之下，給予阿托伐他汀治療后腎炎癥狀明顯改善。同時(shí)因液體滯留導(dǎo)致的體質(zhì)量增加得到改善，尿蛋白，BUN水平下降，但各組小鼠血清總膽固醇及三酰甘油水平差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。此外，阿托伐他汀對(duì)腎臟保護(hù)呈劑量依賴性，阿托伐他汀劑量為25、10 mg/kg，有效地防止腎炎發(fā)展，而1 mg/kg的劑量不具有保護(hù)作用（圖1～4）。

2.2體質(zhì)量改變?nèi)鐖D1所示，模型組小鼠在注射NTS后造模成功，小鼠出現(xiàn)嚴(yán)重的少尿型急性腎功能衰竭，水分潴留，體質(zhì)量增加明顯。對(duì)于3個(gè)治療組，1 mg/kg阿托伐他汀治療組小鼠水分潴留明顯，而10、25 mg/kg治療小鼠，體質(zhì)量未顯著增加。由此推斷分析，1 mg/kg治療劑量可能未達(dá)到治療效果，需加大劑量，且此結(jié)論與病理結(jié)果顯示相一致。

圖1　各組小鼠實(shí)驗(yàn)前后體質(zhì)量變化情況

2.3尿蛋白測(cè)定尿蛋白的測(cè)定是在腎炎時(shí)反映腎小球?yàn)V過功能的常用指標(biāo)。蛋白尿的出現(xiàn)主要是因?yàn)槊庖邠p傷所致的腎小球基底膜的分子結(jié)構(gòu)改變，濾過孔孔徑變大及基底膜陰離子屏障的破壞，使帶陰電荷的清蛋白自由通過，所以蛋白尿的輕重反映了腎小球基底膜的病變程度。實(shí)驗(yàn)證實(shí)，阿托伐他汀能有效地減輕NTS所致尿毒血清性腎炎的蛋白尿，改善腎功能，見圖2。

圖2　各組小鼠實(shí)驗(yàn)前后24 h尿蛋白變化情況

2.4BUN水平測(cè)定實(shí)驗(yàn)證明了，阿托伐他汀可有效地降低BUN含量，尤其是高劑量（25 mg/kg），中劑量（10 mg/kg）干預(yù)組，其對(duì)BUN含量抑制作用更加明顯，見圖3。

圖3　各組小鼠實(shí)驗(yàn)前后BUN變化

2.5病理學(xué)改變A圖為模型組腎臟病理，表現(xiàn)為腎小球體積較正常對(duì)照組增大，細(xì)胞數(shù)明顯增多，腎小球間質(zhì)中可見炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。B圖為聯(lián)合阿托伐他汀治療后腎臟病理，腎炎表現(xiàn)明顯改善。

圖4　兩組小鼠腎臟病理表現(xiàn)比較（HE，×40）

3　討　論

在本研究中，注射含抗小鼠GBM抗體的兔血清后尿蛋白含量逐漸升高，BUN也明顯增加，表明腎功能出現(xiàn)明顯損害，作者成功地復(fù)制了小鼠腎毒血清性腎小球腎炎動(dòng)物模型。

阿托伐他汀是3-羥基-3-甲基輔酶A還原酶抑制劑類降脂藥。近年的研究證明他汀類藥物除了降脂作用外，還發(fā)揮其他許多降脂外功能：可以有效預(yù)防心血管疾病、癌癥、腎臟病變、骨骼疾病、抗炎及器官排斥等的預(yù)防和輔助治療［7］。

本研究通過比較小鼠腎炎模型組和聯(lián)合阿托伐他汀干預(yù)組在臨床生化指標(biāo)及腎組織病理學(xué)方面的變化，證實(shí)了阿托伐他汀對(duì)腎毒血清性腎炎治療作用，而實(shí)驗(yàn)中各組小鼠血清總膽固醇及三酰甘油水平并無(wú)顯著性差異，這也進(jìn)一步提示了阿托伐他汀通過非降脂途徑來(lái)發(fā)揮該保護(hù)腎臟功能。

多項(xiàng)研究證實(shí)，他汀類藥物具有免疫調(diào)節(jié)或者免疫抑制作用，Palinski［8］指出，免疫調(diào)節(jié)作用是他汀藥物除降脂以外的新藥理作用。他汀藥物通過對(duì)炎癥途徑的影響，表現(xiàn)良好的免疫調(diào)節(jié)活性。他汀藥物主要通過抑制羥甲基戊二酸單酰輔酶A（HMG-CoA）還原酶活性，使其下游代謝產(chǎn)物甲羥戊酸（MVA）和異戊烯焦酸酯（GGPP）直接受抑制，從而影響蛋白的異戊烯化。異戊烯化蛋白包括GTP結(jié)合蛋白R(shí)as和Ras樣蛋白如Rho，Rab，Rac，Ra1和Rap，這些蛋白可影響細(xì)胞內(nèi)運(yùn)轉(zhuǎn)，膜交換，RNA穩(wěn)定性和基因轉(zhuǎn)錄等。除上述甲羥戊酸途徑，他汀藥物可直接與淋巴細(xì)胞功能性抗原1（LFA-1）結(jié)合，抑制LFA-1介導(dǎo)的淋巴細(xì)胞黏附和共刺激作用［9］，而后者在炎癥和自身免疫性疾病中發(fā)揮重要致病作用。Bagnato等［10］研究發(fā)現(xiàn)，在系統(tǒng)性硬化癥小鼠動(dòng)物模型實(shí)驗(yàn)中，辛伐他汀通過激活VEGF-ERK-Ras and Rho途徑，有效發(fā)揮抗炎及免疫調(diào)節(jié)作用從而抑制肺動(dòng)脈纖維化進(jìn)展。Graaf等［11］研究表明，他汀類藥物抑制急性炎癥反應(yīng)中ICAM-1表達(dá)，阻斷細(xì)胞間信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，同種異型應(yīng)答的T細(xì)胞繁殖明顯被抑制，從而移植物存活時(shí)間明顯延長(zhǎng)。

不少研究證實(shí)，他汀藥物的免疫調(diào)節(jié)作用使其在自身免疫性疾病中也存在應(yīng)用前景。Leung等［12］通過動(dòng)物模型研究表明：低于降脂劑量的辛伐他汀有明顯的預(yù)防和治療關(guān)節(jié)炎作用，在關(guān)節(jié)炎發(fā)病前應(yīng)用辛伐他汀，關(guān)節(jié)炎發(fā)病率和關(guān)節(jié)炎指數(shù)均下降，發(fā)病后應(yīng)用，關(guān)節(jié)腫脹數(shù)和關(guān)節(jié)炎指數(shù)亦較對(duì)照組顯著降低。組織學(xué)發(fā)現(xiàn)，受累關(guān)節(jié)滑膜增生、炎性細(xì)胞浸潤(rùn)和骨糜爛程度亦較對(duì)照組輕。對(duì)類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者外周血和滑膜液刺激試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，辛伐他汀呈劑量依賴性對(duì)干擾素（IFN-γ）的分泌產(chǎn)生抑制。2012年發(fā)表在Circulation雜志上的一項(xiàng)囊括24 278例患者的meta分析結(jié)果提示：阿托伐他汀能有效降低蛋白尿同時(shí)提高腎小球率過濾，恢復(fù)患者腎功能［13］。本研究結(jié)果基本與其相一致。Abud-Mendoza等［14］應(yīng)用他汀藥物嘗試治療某些難治性自身免疫疾病，結(jié)果3例SLE患者經(jīng)辛伐他汀80 mg/d，連續(xù)8 d后，其蛋白尿水平明顯下降，外周血淋巴細(xì)胞的自發(fā)性凋亡也顯著下調(diào)。這些提示，他汀藥物有可能成為治療自身免疫性疾病的一種重要用藥。

本研究觀察到阿托伐他汀對(duì)腎毒血清性腎炎具有明顯的保護(hù)作用。阿托伐他汀治療有效降低了尿蛋白水平，抑制血清尿素氮升高，保護(hù)腎臟功能［13］。為了探索阿托伐他汀腎臟保護(hù)作用的最佳劑量，本研究設(shè)置了1、10、25 mg/kg三個(gè)劑量組，實(shí)驗(yàn)證實(shí)10、25 mg/kg劑量組保護(hù)腎臟功能，且在治療效果上無(wú)明顯差異，而1 mg/kg治療組未能發(fā)揮作用，因此，10 mg/kg劑量是治療小鼠腎毒血清性腎炎的最佳劑量。關(guān)于他汀類藥物免疫調(diào)節(jié)作用，以及他汀類藥物對(duì)腎毒血清性腎炎保護(hù)作用的具體機(jī)制，本研究未提供直接證據(jù)，需要后續(xù)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步研究闡明。

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Study on protective effect of atorvastatin in mouse nephrotoxic serum nephritis

Tu Haiyan（Department of Nephrology，

Second Affiliated Hospital，Medical College of Zhejiang University，Hangzhou，Zhejiang 321000，China）

ObjectiveTo investigate the interventional treatment effect of statins in mouse nephrotoxic serum nephritis. MethodsThe mouse nephrotoxic serum nephritis model was established by nephrotoxic serum （NTS）injection.Then mice in the treatment group were intraperitoneally injected by 1，10，25 mg/kg atorvastatin at 24 h after the model construction.After NTS plus atorvastatin treatment for 7 d，all mice were killed，the blood and 24 h urine were collected for detecting serum urea nitrogen （BUN）and urinary protein level.Furthermore the renal histopathologic changes were detected.ResultsCompared with the model group，the body weight increase in the atorvastatin treatment group was not obvious，the urinary protein level was decreased （P＜0.01），serum BUN level was reduced（P＜0.01），and the degree of nephritis pathologica change was alleviated.The protective effect of atorvastatin showed the dose dependent manner，the protective effect tin the 10 mg/kg treatment group was strongest. ConclusionAtorvastatin can effectively alleviate urinary protein in the experimental animal，improves the glomerular filtration function，and has the protective effect for mouse immune nephritis.

Glomerulonephritis/blood；Blood urea nitrogen；Immunocompetence；Inflammation；Pyrroles

10.3969/j.issn.1009-5519.2016.03.011

A

1009-5519（2016）03-0352-03

屠海燕（1985-），碩士學(xué)歷，醫(yī)師，主要從事腎臟病相關(guān)疾病診治工作。

（2015-07-14）