不同年份生產帝泊洱茶珍HPLC指紋圖譜研究

劉順航,徐詠全,李長文,何忠榮,王 超

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不同年份生產帝泊洱茶珍HPLC指紋圖譜研究

劉順航,徐詠全,李長文,何忠榮,王 超*

(云南天士力帝泊洱生物茶集團有限公司,云南 普洱 665000)

本研究對2011～2014年生產的20個帝泊洱茶珍樣品進行分析,建立了帝泊洱茶珍高效液相色譜指紋圖譜,同時結合化學計量學對帝泊洱茶珍和競品茶珍進行區分.結果表明:指紋圖譜相似性分析,帝泊洱茶珍相似系數均大于0.995,而10個競品茶珍相似度均小于0.970.通過系統聚類和偏最小二乘判別分析,可明顯區分帝泊洱茶珍和競品茶珍.變量投影重要性準則研究顯示,沒食子酸(GA)、3號峰(未知物)、沒食子兒茶素(GC)、兒茶素(C)和表沒食子兒茶素沒食子酸酯(EGCG)等5種化合物相對含量的不同是區分帝泊洱茶珍與競品茶珍主要因素.

帝泊洱茶珍;高效液相色譜;指紋圖譜;化學計量學

普洱茶是一種獨特的后發酵茶,主要產自中國云南省,它的制作和運輸銷售已有上千年的歷史[1].近年來,由于其抗氧化、抗腫瘤、抑菌、降血糖、減肥等功效[2],以及其獨特的口感,越來越受到國內外消費者的青睞.普洱茶珍,是一種為迎合大眾健康快節奏生活方式應運而生的經浸提、濃縮、噴粉和冷凍干燥制成的普洱茶速溶茶.

茶一直以感官審評作為其品質評價的主要方式,但由于評價環境、審評設備、審評人員工作經驗、審評人員身體狀況等不穩定因素的影響,不可避免地導致審評結果有時會出現較大的個體偏差.因此,尋找科學、全面、可量化的茶品質評價和質量監控方法,已成為茶領域研究的重點和熱點.

1976年,Hoefler等人首次應用中藥指紋圖譜技術研究了茶葉組成成分,為茶葉高效液相色譜分析方法首開先例[3].近年,針對普洱茶指紋圖譜的研究已有相關報道.寧井銘等[4-6]針對普洱曬青毛茶和普洱生茶指紋圖譜作了大量工作,從指紋圖譜的整體性出發,利用相關系數,夾角余弦、重疊率、系統聚類和主成分分析等識別模式,對普洱茶曬青毛茶和綠茶、不同等級普洱生茶進行了分析和區分.李揚等[7]發現景邁茶區不同曬青毛茶樣品的指紋圖譜具有極高的相似度,但景邁茶區曬青毛茶的標準圖譜與其他地區茶樣間的相似度差異較大.張梁等[8]又進行了不同產地普洱生茶和普洱熟茶指紋圖譜的建立,為兩者的質量評價提供了依據.

本研究采用高效液相(HPLC)建立不同年份帝泊洱茶珍指紋圖譜,并結合化學計量學方法對帝泊洱茶珍和競品進行區分,旨在為帝泊洱茶珍質量控制和競品判別提供可量化的手段.

1　材料與方法

1.1材料與儀器

20個批次帝泊洱普洱茶珍(表1),云南帝泊洱生物茶集團有限公司;10個競品茶珍(表1),購于普洱市場;乙腈(色譜純)(美國TEDIA公司);磷酸(色譜純)(Aladdin,中國,上海).Waters e2695-2489高效液相色譜儀(美國waters公司);電子分析天平(梅特勒公司); Mill-Q超純水凈化系統(美國 Millipore公司).

表1　普洱茶珍樣品信息Table 1 The information on the samples of Pu-erh tea extract

1.2實驗方法

1.2.1供試液的制備

稱取茶珍樣品0.1500±0.0002 g,至50 mL燒杯中,加入30 mL超純水,30℃水浴超聲5 min,使茶粉充分溶解.超聲后轉移至50 mL容量瓶中,加水定容至刻度,過0.45 μm尼龍濾膜后備用.

1.2.2色譜條件

色譜柱:Synergi 4u Hydro-RP 80AC18柱(250 mm X 4.6 mm ID, 美國菲羅門公司);流動相A:乙腈(含0.05%磷酸),流動相B:水(含0.05%磷酸);進樣量10 μL;柱溫30 oC;檢測波長210 nm;流速為1.0 mL.min-1;梯度洗脫程序為0～50 min,2% A、98% B → 25% A、75% B; 50～55 min,25% A、75% B→2% A、98% B;進下一樣品之前2% A、98% B平衡色譜柱15 min.

1.2.3數據處理

采用《中藥指紋圖譜相似度評價系統2004A版》軟件(中國,北京)分析茶珍HPLC指紋圖譜數據,確定共有峰,生成對照指紋圖譜并進行相似度計算.采用IBM SPSS Statistics 20進行系統聚類(HCA).SIMCA-P+12.0進行帝泊洱茶珍和競品茶珍差異計算.

2　結果與分析

2.1指紋圖譜的構建和解析

2.1.1共有峰的標記

對20批茶珍進行指紋圖譜分析,以咖啡因作為參考峰,標定了13個共有峰,分別為1號(11.621 min)、2號(13.209 min)、3號(14.304 min)、4號(17.762 min)、5號(18.403 min)、6號(25.006 min)、7號(27.243 min)、8號(29.120 min)、9號(32.608 min)、10號(34.546 min)、11號(37.199 min)、12號(43.428 min)和13號(44.882 min),其中8號峰為咖啡因(圖1).

2.1.2 相似度計算

將20批帝泊洱茶珍的指紋圖譜導入國家藥典委員會《中藥指紋圖譜相似度評價系統2004A版》軟件,經多點校正,色譜峰匹配及生成對照圖譜,以中位數生成茶珍對照指紋圖譜,將該對照指紋圖譜的相似度定為1,計算得出20批次茶珍的相似度均在0.996～0.999(表2),表明茶珍在長期的存放過程中,化學成分和其含量變化較小,茶珍產品穩定性較高(圖2).以20批帝泊洱茶珍的對照指紋圖譜為參照,計算得出10個競品茶珍的相似度在0.938～0.963 (表2).表明了競品茶珍與帝泊洱茶珍之間存在差別.

圖1　20批茶珍對照色譜圖(8號為咖啡因)Fig. 1 The chromatomap of 20 tea extract samples (No.8 caffeine)

表2　帝泊洱茶珍和競品茶珍相似度Table 2 The similarity of 20 tea extract samples between Deepure and Pu-erh tea

圖2　20批茶珍HPLC色譜圖Fig. 2 The HPLC chromatomap of 20 Pu-erh tea extract

2.2帝泊洱茶珍與競品茶珍系統聚類分析

應用SPSS軟件對帝泊洱的20批茶珍和10個競品茶珍中13個共有峰的相對峰面積進行系統聚類分析.從圖3中可以看到聚類的趨勢, 30個茶珍樣品系統聚類的結果可分為兩大類(線II):帝泊洱茶珍聚為一大類,競品茶珍聚為一大類.在帝泊洱茶珍樣品中,閾值最低層(線I)被劃分一類的樣品來自同一年份,能夠較好的聚集在一起成為一類.10個競品茶珍與帝泊洱茶珍差異性較大,聚為一大類;同時從競品茶珍聚類看,10個廠家的茶珍之間也能很好的聚為小類.

圖3　30個茶珍樣品系統聚類分析圖Fig. 3 The Systematic Assembling Analytical Map of 30 pu-erh tea extract samples

2.3帝泊洱茶珍與競品茶珍差異分析

以30個茶珍樣品中13個共有峰的相對峰面積為變量進行偏最小二乘判別分析,建立PLS-DA模型(圖4)研究帝泊洱茶珍與競品茶珍的差異.結果顯示,帝泊洱茶珍與競品茶珍呈現明顯的分離趨勢,帝泊洱不同年份茶珍聚集同樣出現分離趨勢,說明茶珍在長期存放過程中基礎物質仍有細微的變化.為了進一步探究引起茶珍之間差異的重要化學信息,按照PLS-DA結果對30批茶珍指紋圖譜中13個共有色譜峰VIP值大小進行排序,其中5個色譜峰(峰2-GA、峰3-unknow、峰5-GC、峰7-C和峰10-EGCG)VIP值>1(圖5),這5種化合物含量的不同是區分帝泊洱茶珍與競品茶珍的主要因素.

圖4　30個茶珍樣品PLS-DA分析得分散點圖Fig. 4　The distribution point map of 30 pu-erh tea extract samples

圖5　變量投影重要性準則圖Fig. 5 The Variable projection importance criterion

3　結論

系統聚類、偏最小二乘分析和變量投影重要性準則作為化學計量學方法,能夠找到隱藏在眾多共性下的差異.本文利用指紋圖譜技術建立了不同年份帝泊洱茶珍HPLC指紋圖譜,共標記了13個共有峰,帝泊洱不同年份的20個批次茶珍相似度均≥0.996;以帝泊洱20批次茶珍對照指紋圖譜為參照,10個競品茶珍的相似度均≤0.963.以13個共有峰的相對峰面積為變量,對帝泊洱20批茶珍和10個競品茶珍進行化學計量學分析,聚類分析結果顯示系統聚類可對帝泊洱茶競品茶珍進行區分;進一步進行偏最小二乘判別分析,結果與聚類分析相似,變量投影重要性準則分析顯示,5個化合物(峰2-GA,峰3-unknow,峰5-GC,峰7-C和峰10-EGCG)相對含量的差別是區分帝泊洱茶珍與競品茶珍的重要因素.

本實驗建立的HPLC指紋圖譜分析方法,能夠使帝泊洱茶珍共有成分在色譜中體現,所建立的指紋圖譜具有較好的穩定性與可控性,可進一步用于帝泊洱茶珍質量的控制,同時可作為帝泊洱茶珍與競品茶珍區分的一種手段.

[1] 陽耀芳. "茶馬古道" 的歷史研究與現實意義 [J]. 茶葉通訊, 2009, 36(1)∶ 44-47.

[2] 李晨晨, 呂杰, 楊瑞娟, 等. 普洱茶渥堆發酵過程中嗜熱細菌的分離和鑒定 [J]. 北京化工大學學報∶ 自然科學版, 2012, 39(2)∶ 74-78.

[3] Hoefler A. C, Coggon P. Reversed-phase high-performance liquid chromatography of tea constituents [J]. Journal of Chromatography A, 1976 (129)∶ 460-463.

[4] 寧井銘,張正竹,谷勛剛,等. 基于高效液相色譜的普洱曬青毛茶指紋圖譜識別方法 [J]. 農業工程學報, 2010, 26(3)∶243-248.

[5] 寧井銘,張正竹,谷勛剛,等. 云南曬青毛茶HPLC指紋圖譜的研究 [J]. 食品與發酵工業, 2009(9)∶36-40.

[6] 寧井銘, 顏玲,宛曉春,等. 基于HPLC技術的普洱生茶指紋圖譜研究 [J]. 食品與發酵工業, 2015, 41(2)∶200-206.

[7] 李揚, 周斌星, 楊超, 等. 建立景邁茶區春季曬青毛茶指紋圖譜的研究 [J]. 江西農業學報, 2012, 24(6)∶153-155.

[8] 張梁, 李寧, 車彥云, 等. 普洱熟茶和普洱生茶的指紋圖譜研究(英文) [J]. 中國藥學雜志, 2011, 20(4)∶ 352-359.

Study on Deepure Instant Pu-erh Tea from Different years by HPLC Fingerprint

LIU Shun-hang,XU Yong-quan,LI Chang-wen,HE Zhong-rong,WANG Chao*
(Yunnan Tasly Deepure Biological Tea Group Co., Ltd, Pu'er 665000, China)

In this study, 20 batches Deepure instant pu-erh tea samples from 2011-2014 were evaluated by using high liquid chromatography (HPLC) fingerprint. Meanwhile, the Deepure instant pu-erh tea samples were authenticated within different manufacturers by chemometrics method. The chemometrics method included hierarchical clustering analysis, partial least squares-discriminant analysis and variable importance for the project analysis. Results showed that the similarities of 20 batches of instant pu-erh tea samples were more than 0.995, and the 10 similar products were lower than 0.970. The Deepure instant pu-erh tea samples and similar products can be significantly distinguished by hierarchical clustering analysis, partial least squares-discriminant analysis. The results of variable importance for the study showed that five compounds were the important factors for discrimination of samples.

Deepure instant pu-erh tea, High liquid chromatography, Fingerprint, Chemometrics method

O657.72,TS272.7

A

1009-525X(2016)02-24-29

2016-04-29

2016-05-30

劉順航(1976-),男,福建仙游人,高級工程師,主要從事普洱茶提取和安全控制方面的研究.

王超,wangchao2809@126.com