腫節(jié)風(fēng)對(duì)豬放射性肺損傷的防護(hù)作用及機(jī)制

胡凱，劉文其，岳海英，梁菲菲，王仁生

(廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院，南寧530021)

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腫節(jié)風(fēng)對(duì)豬放射性肺損傷的防護(hù)作用及機(jī)制

胡凱，劉文其，岳海英，梁菲菲，王仁生

(廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院，南寧530021)

目的觀察腫節(jié)風(fēng)對(duì)放射性肺損傷小型豬模型肺纖維化及肺組織中肺泡表面活性物質(zhì)相關(guān)蛋白A(SP-A)、α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-SMA)表達(dá)的影響。方法將75頭小型豬隨機(jī)分為正常對(duì)照組、單純照射組及腫節(jié)風(fēng)干預(yù)組各25頭。腫節(jié)風(fēng)干預(yù)組于照射前1周開始給予0.3 g/(kg·d)腫節(jié)風(fēng)配方顆粒灌胃，直至處死日；其他兩組給予等量生理鹽水。動(dòng)物麻醉，單純照射組和腫節(jié)風(fēng)干預(yù)組給予15 Gy/次γ射線照射右肺，正常對(duì)照組只麻醉不照射。三組分別于照射后2、4、8、12、24周隨機(jī)取5頭動(dòng)物處死，取右肺，用HE染色及Masson染色觀察肺組織病理改變，免疫組化方法檢測(cè)肺組織內(nèi)SP-A、α-SMA表達(dá)。結(jié)果單純照射組照射后2周開始出現(xiàn)肺間質(zhì)炎癥改變，肺泡腔及肺間質(zhì)內(nèi)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，小血管及毛細(xì)血管擴(kuò)張充血；照射后4周肺組織大血管及氣管周邊開始出現(xiàn)膠原纖維分布，隨時(shí)間延長(zhǎng)，膠原纖維沉積和纖維細(xì)胞增生明顯增多，肺纖維化病灶明顯。腫節(jié)風(fēng)干預(yù)組各時(shí)間點(diǎn)上述炎癥及纖維化程度均較單純照射組減輕。與正常對(duì)照組比較，單純照射組肺組織SP-A和α-SMA分別于第4周和第8周起表達(dá)下降和升高(P均<0.05)，腫節(jié)風(fēng)干預(yù)組肺組織SP-A和α-SMA均從第12周起分別表達(dá)下降和上升(P均<0.05)；與單純照射組比較時(shí)，腫節(jié)風(fēng)干預(yù)組肺組織內(nèi)SP-A和α-SMA分別從第4周和第12周起表達(dá)相對(duì)升高和下降(P均<0.05)。結(jié)論腫節(jié)風(fēng)能顯著減輕小型豬放射性肺損傷的炎癥表現(xiàn)及纖維化程度，其可能通過減少肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞損傷、抑制肌成纖維細(xì)胞的轉(zhuǎn)化和增殖來阻止或延緩放射性肺損傷的發(fā)生發(fā)展。

腫節(jié)風(fēng)；放射性肺損傷；肺泡表面活性物質(zhì)相關(guān)蛋白A；α-平滑肌肌動(dòng)蛋白；豬

放射性肺損傷的關(guān)鍵靶細(xì)胞包括肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞及巨噬細(xì)胞等[1]，其中肺泡表面活性物質(zhì)相關(guān)蛋白A(SP-A)是肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞的分子標(biāo)記物，α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-SMA)[2]是肌成纖維細(xì)胞的特異性標(biāo)記物，二者常被用來監(jiān)測(cè)放射性肺損傷的發(fā)生發(fā)展過程。腫節(jié)風(fēng)為金粟蘭科植物草珊瑚的干燥全草，具有抗菌、消炎、抗腫瘤、改善免疫功能等作用[3～5]。我們的前期研究發(fā)現(xiàn)，腫節(jié)風(fēng)具有清除自由基、還原活性氧簇、改善氧化應(yīng)激狀況、減輕炎癥反應(yīng)等作用，對(duì)射線所致的小型豬腮腺放射性損傷具有顯著的防護(hù)作用[6～8]。2012年9月～2013年9月，我們采用小型豬作為實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?，?dòng)態(tài)觀察中藥腫節(jié)風(fēng)配方顆粒對(duì)放射性肺損傷的肺組織病理學(xué)及SP-A、α-SMA表達(dá)的影響，探討腫節(jié)風(fēng)的放射防護(hù)作用。

1　材料與方法

1.1材料實(shí)驗(yàn)用雄性巴馬小型豬75頭，2～3月齡，體質(zhì)量6.0～7.0 kg。腫節(jié)風(fēng)配方顆粒由廣西培力藥業(yè)有限公司提供。Masson染色試劑盒及DAB顯色試劑盒購(gòu)自武漢博士德生物科技有限公司，SP-A及α-SMA多克隆抗體免疫組化試劑盒購(gòu)自北京中杉金橋生物工程有限公司)。

1.2分組給藥與照射處理將小型豬隨機(jī)分為正常對(duì)照組、單純照射組、腫節(jié)風(fēng)干預(yù)組各25頭。腫節(jié)風(fēng)干預(yù)組于照射前1周開始給予0.3 g/(kg·d)腫節(jié)風(fēng)配方顆粒灌胃，其他兩組給予等量生理鹽水，持續(xù)至處死日。將動(dòng)物用3%戊巴比妥鈉腹腔麻醉，俯臥位固定。常規(guī)X線機(jī)模擬定位，用記號(hào)筆勾畫需要照射的右肺區(qū)域。將定位好的右肺暴露在照射野中，用60Co源γ射線放射治療儀，射線從豬的背面單野垂直照射右肺，照射野面積9 cm×10 cm，源皮距80 cm，吸收劑量率3 Gy/min。單純照射組和腫節(jié)風(fēng)干預(yù)組右肺照射劑量均為15 Gy，空白組只麻醉不照射。

1.3肺組織病理檢查照射后2、4、8、12、24周三組分別取5頭動(dòng)物處死，取右肺組織4%多聚甲醛溶液固定，脫水、浸蠟包埋，切片，每張石蠟切片包含肺組織上、中、下三個(gè)部分的截面。切片常規(guī)脫蠟至水，然后分別用蘇木素染液和Masson染色試劑盒對(duì)石蠟切片進(jìn)行染色，再依次完成常規(guī)梯度乙醇脫水、二甲苯透明、中性樹膠封固，顯微鏡下觀察。

1.4肺組織SP-A、α-SMA表達(dá)檢測(cè)制作肺組織石蠟切片，免疫組化法檢測(cè)SP-A、α-SMA表達(dá)，按試劑盒說明書操作。DAB顯色，鏡下見胞質(zhì)呈棕黃褐色為陽(yáng)性。選擇切片陽(yáng)性表達(dá)最明顯的區(qū)域(避開大血管和大氣管)，在20×10倍視野下，應(yīng)用圖像分析軟件Image-Pro Plus6.0計(jì)算視野內(nèi)陽(yáng)性細(xì)胞的平均光密度(OD)值。

2　結(jié)果

2.1三組肺組織病理改變

2.1.1HE染色正常對(duì)照組肺組織結(jié)構(gòu)清晰，肺泡腔、肺泡壁完整，無(wú)毛細(xì)血管充血及炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，無(wú)纖維化表現(xiàn)。單純照射組照射后2周開始出現(xiàn)肺間質(zhì)炎癥改變，毛細(xì)血管擴(kuò)張充血，可見少量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)；4周肺泡間隔水腫增寬，肺泡腔及肺間質(zhì)內(nèi)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)增多；8周肺泡間隔明顯增寬，肺泡壁明顯增厚，肺泡腔內(nèi)可見少量出血和纖維素樣滲出；12周肺組織炎癥逐漸加重，局部肺泡塌陷，肺泡間隔增寬伴融合，并可見大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，小血管及毛細(xì)血管擴(kuò)張充血，局部肺實(shí)變；24周肺組織滲出減少，病變以增生為主，肺間質(zhì)內(nèi)可見大量單核細(xì)胞浸潤(rùn)，局部可見散在分布條索狀、旋渦狀淡紅染色的纖維素樣病灶，肺部病變比較嚴(yán)重。腫節(jié)風(fēng)干預(yù)組各時(shí)間點(diǎn)肺組織病理改變均較單純照射組減輕。

2.1.2Masson染色單純照射組照射后4周肺泡間隔內(nèi)可見散在點(diǎn)梭狀膠原纖維分布，主要分布于大血管及氣管周邊，未見明顯的纖維化病灶形成；隨時(shí)間延長(zhǎng)，肺泡間隔內(nèi)膠原纖維聚集區(qū)域逐漸增加；12周肺泡間隔內(nèi)膠原纖維沉積和纖維細(xì)胞增生明顯增多，局部可見明顯的條索狀藍(lán)染聚集區(qū)，提示出現(xiàn)肺纖維化病灶；24周肺組織內(nèi)可見廣泛分布的層狀或旋渦狀膠原纖維聚集區(qū)，肺纖維化病灶非常明顯。腫節(jié)風(fēng)干預(yù)組與單純照射組相比，各時(shí)間點(diǎn)肺組織纖維化程度均減輕。

2.2三組照射后不同時(shí)點(diǎn)肺組織SP-A、α-SMA表達(dá)變化見表1。

表1　三組照射后不同時(shí)點(diǎn)肺組織SP-A、α-SMA表達(dá)變化

注：與正常對(duì)照組同時(shí)點(diǎn)比較，*P<0.05；與單純照射組同時(shí)點(diǎn)比較，#P<0.05。

3　討論

中醫(yī)理論認(rèn)為，放射線屬“熱毒”之邪，其強(qiáng)大的穿透力不僅直接損傷肺臟血絡(luò)，而且熱毒襲肺，肺熱內(nèi)壅，脈絡(luò)瘀阻，導(dǎo)致熱傷肺絡(luò)，治以補(bǔ)氣養(yǎng)血、扶正活血為主[9]。中草藥用于治療放射性肺損傷已取得一定效果。奚蕾等[10]發(fā)現(xiàn)，黃芪能抑制中晚期胸部腫瘤患者放療后腫瘤壞死因子α和內(nèi)皮素的血漿濃度過度升高，降低放射治療后彌散功能的惡化，有效防治放射性肺損傷。王素玲等[11]報(bào)道，接受3D-CRT放療的Ⅲ期非小細(xì)胞肺癌患者，應(yīng)用川芎嗪注射液能有效預(yù)防放射性肺炎的發(fā)生，且有放療增敏作用，并能在一定程度上改善患者的生活質(zhì)量。鄭海紅等[12]應(yīng)用由紅景天、生黃芪、黨參、當(dāng)歸等14味中藥組成扶正活血方劑給放射性肺損傷的大鼠灌胃，發(fā)現(xiàn)扶正活血方劑可抑制TGF-β1分泌，減輕放射性肺損傷的嚴(yán)重程度，阻止或延緩肺纖維化的形成。

本研究顯示，腫節(jié)風(fēng)干預(yù)組各時(shí)間點(diǎn)肺組織的炎癥及纖維化程度均較單純照射組明顯減輕。與正常對(duì)照組比較，單純照射組肺組織SP-A表達(dá)從放療后第4周開始顯著下降，α-SMA表達(dá)從放療后第8周開始顯著升高，并持續(xù)到研究終點(diǎn)；而腫節(jié)風(fēng)干預(yù)組SP-A和α-SMA表達(dá)的變化趨勢(shì)均不及單照組明顯，照射后第12周開始才有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。提示肺組織經(jīng)γ射線照射損傷后，以SP-A為分子標(biāo)記的肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞數(shù)目減少，以α-SMA為標(biāo)記的肌成纖維細(xì)胞數(shù)目增加。表明γ射線所產(chǎn)生的電磁輻射導(dǎo)致肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞凋亡，數(shù)目減少，正常肺泡結(jié)構(gòu)遭到破壞，取而代之的是肌成纖維細(xì)胞的出現(xiàn)和纖維結(jié)締組織的大量生成，從而發(fā)生肺組織纖維化。腫節(jié)風(fēng)干預(yù)組肺組織SP-A表達(dá)明顯高于單純照射組，而α-SMA表達(dá)低于單純照射組。說明腫節(jié)風(fēng)可能通過減少由輻射所導(dǎo)致的肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞損傷、抑制肌成纖維細(xì)胞的轉(zhuǎn)化增殖來阻止和延緩放射性肺損傷的發(fā)生發(fā)展，減輕其嚴(yán)重程度，從而發(fā)揮放射防護(hù)作用。由于腫節(jié)風(fēng)成分復(fù)雜，其確切作用機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。

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Protective effect of Sarcandra glabra on radiation-induced lung injury in pigs

HUKai,LIUWenqi,YUEHaiying,LIANGFeifei,WANGRensheng

(TheFirstAffiliatedHospitalofGuangxiMedicalUniversity,Nanning530021,China)

ObjectiveTo observe the effects of Sarcandra glabra on pulmonary fibrosis and pulmonary surfactant-associated protein (SP-A) and α-smooth muscle actin (α-SMA) expression in miniature pig models with radiation-induced lung injury. MethodsSeventy-five miniature pigs were randomly divided into the control group, radiation group and radiation plus medication group, 25 in each group. From 1 week before exposure, the miniature pigs in the radiation plus medication group were given 0.3 g/(kg·d) Sarcandra glabra by gavage until to be executed, while those in the other groups received an equal amount of normal saline. After anesthesia, the right lungs of the miniature pigs in radiation group and radiation plus medication group were exposed to γ-ray (15 Gy/time). The right lungs were taken out (five in each group) on week 2, 4, 8, 12 and 24 after the irradiation. The pathological changes were observed by HE and Masson staining, and the expression of SP-A and α-SMA was detected by immunohistochemistry in lung tissues. ResultsAt the second week after irradiation, there were inflammatory infiltration in pulmonary interstitial and alveolar cavity, and small blood vessels and capillary vessels were dilated and had congestion in the radiation group. Another 2 weeks later, collagen fibers appeared in the periphery of large blood vessels and trachea in the lung tissues. The deposition of collagen fibers and the proliferation of fibrocytes were increased with the prolonged time. The degree of inflammation and fibrosis were decreased in the radiation plus medication group during the whole experiment. Compared with the control group, the expression of SP-A and α-SMA was significantly decreased from the fourth week and increased from the eighth week in the radiation group, respectively (allP<0.05). Similar changes were observed from the twelfth week in the radiation plus medication group (allP<0.05). Compared with the radiation group, the expression of SP-A and α-SMA was relatively increased and then decreased from the fourth and twelfth week in the radiation plus medication group, respectively (allP<0.05).ConclusionsSarcandra glabra can reduce the inflammation and fibrosis of lung tissue in miniature pigs after irradiation. It plays protective effect on radiation-induced lung injury in miniature pigs by reducing the injury of alveolar type II epithelial cells, suppressing the fibroblasts transformation and delaying the radiation-induced lung injury.

Sarcandra glabra; radiation-induced lung injury; pulmonary surfactant-associated protein; α-smooth muscle actin; swine

廣西科學(xué)研究與技術(shù)開發(fā)計(jì)劃項(xiàng)目(1140003A-24)。

胡凱(1982-)，男，博士，主治醫(yī)師，主要研究方向?yàn)樾馗共繍盒阅[瘤的放射治療。E-mail： hukaigxmu@163.com

簡(jiǎn)介：王仁生(1963-)，男，博士，主任醫(yī)師，博士研究生導(dǎo)師，主要研究方向?yàn)閻盒阅[瘤的放射治療及并發(fā)癥防治。E-mail：13807806008@163.com

10.3969/j.issn.1002-266X.2016.22.007

R818

A

1002-266X(2016)22-0021-03

2015-12-04)