產(chǎn)細(xì)菌纖維素菌培養(yǎng)基的研究探討

應(yīng)以堅(jiān)，周丹丹，王雪奇（.臺(tái)州市環(huán)境監(jiān)測(cè)中心站； .臺(tái)州市環(huán)境科學(xué)設(shè)計(jì)研究院，浙江 臺(tái)州 8000；.杭州友源環(huán)保科技有限公司，杭州 0000）

產(chǎn)細(xì)菌纖維素菌培養(yǎng)基的研究探討

應(yīng)以堅(jiān)1，周丹丹2，王雪奇3
（1.臺(tái)州市環(huán)境監(jiān)測(cè)中心站； 2.臺(tái)州市環(huán)境科學(xué)設(shè)計(jì)研究院，浙江 臺(tái)州 318000；3.杭州友源環(huán)保科技有限公司，杭州 310000）

本文研究產(chǎn)了纖維素菌培養(yǎng)基的優(yōu)化，選取葡萄糖為碳源，蛋白胨、酵母膏、牛肉膏、硫酸銨、脲、磷酸氫二銨、硝酸鉀為不同氮源，選擇最佳pH值。通過(guò)分析培養(yǎng)基的纖維素膜重、pH值、總酸、殘?zhí)恰D值，發(fā)現(xiàn)以葡萄糖為碳源，以牛肉膏為氮源，pH值為5時(shí)，纖維素菌生長(zhǎng)情況比較好，而且纖維素產(chǎn)量也比較高。

纖維素菌；培養(yǎng)基；研究探討

0　引言

細(xì)菌纖維素的生物合成是一個(gè)復(fù)雜的過(guò)程，為了提高其產(chǎn)量可以從多方面人手，找尋其它適合的菌株和比較合適的有利于菌體生長(zhǎng)的條件以及發(fā)酵方式是一個(gè)比較可行的途徑。在發(fā)件培養(yǎng)基培養(yǎng)條件的優(yōu)化方面，我們采取了Placket.Burrnan試驗(yàn)設(shè)計(jì)和響應(yīng)面分析方法。在本次試驗(yàn)中通過(guò)培養(yǎng)基條件的優(yōu)化，來(lái)提高細(xì)菌纖維素的產(chǎn)量。在培養(yǎng)基條件優(yōu)化方面選取了幾個(gè)不同的因素，以葡萄糖為碳源時(shí)，分別選取氮源、培養(yǎng)基的PH值。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

1.1.1材料

菌種：木醋桿菌，為本實(shí)驗(yàn)室的保藏菌種。

1.1.2試劑

葡萄糖、蛋白胨、酵母浸膏、磷酸氫二鈉、檸檬酸、硫酸鎂、氫氧化鈉、生理鹽水、冰醋酸、醋酸鈉、硫酸銅、酒石酸鉀鈉、亞鐵氰化鈉、濃鹽酸、亞甲基藍(lán)、甲基紅、酚酞、蒸餾水、酵母膏、牛肉膏、蛋白胨、硫酸銨、脲、磷酸氫二銨、硝酸鉀。

1.1.3儀器

MJX型生化培養(yǎng)箱、恒溫恒濕培養(yǎng)箱、無(wú)菌操作臺(tái)、立式高壓蒸汽滅菌鍋、搖床、烘箱、水浴鍋、UV752型紫外分光光度計(jì)、pHS-3CA型pH計(jì)、PB303-N型電子精密天平等。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

種子培養(yǎng)基的配制：用分析天平準(zhǔn)確稱取葡萄糖3g，蛋白胨0.75g，酵母浸膏0.75g，十二水合磷酸氫二鈉1.022g，一水檸檬酸0.189g，硫酸鎂0.0375g，配制成150ml的種子培養(yǎng)基，PH調(diào)至5，配置后放入滅菌鍋，在120℃下滅菌20min。

菌體接種培養(yǎng)：在150ml種子培養(yǎng)基中接入少量紅茶菌，在28℃的搖床中震蕩培養(yǎng)，待種子培養(yǎng)液出現(xiàn)少量渾濁情況即可進(jìn)行種子液的接種。

配制不同氮源培養(yǎng)基：用分析天平準(zhǔn)確稱取葡萄糖1g，酵母浸膏0.250g，十二水合磷酸氫二鈉0.341g，一水合檸檬酸0.062g，硫酸鎂0.0124g，以不同的氮源為變量，分別加入酵母膏、牛肉膏、蛋白胨、硫酸銨、脲、磷酸氫二銨、硝酸鉀各0.250g，配制成50ml的培養(yǎng)基，并把pH調(diào)至5，平行三組。

配制不同pH值的培養(yǎng)基：用分析天平準(zhǔn)確稱取葡萄糖1g，蛋白胨0.250g，酵母浸膏0.250g，十二水合磷酸氫二鈉0.341g，一水合檸檬酸0.062g，硫酸鎂0.012g，配制成50ml的培養(yǎng)基，并把pH分別調(diào)至3，4，5，6，平行三組。

把配制好的培養(yǎng)基放入滅菌鍋，在120℃下滅菌20min。滅完菌后在無(wú)菌操作臺(tái)進(jìn)行種子液的接入，接種量為培養(yǎng)基含量的8%，即4ml。全部接好后，統(tǒng)一放入28℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7天。

2　纖維素菌各理化指標(biāo)測(cè)定

纖維素膜干重的測(cè)定：將平行組前兩組的纖維素膜從培養(yǎng)基中挑出然后用蒸餾水洗凈放進(jìn)平板中用4.0%的NaOH浸末，在82℃下浸泡2h。用蒸餾水將纖維素膜洗至pH為7，放進(jìn)烘箱干燥用差重法測(cè)干重。

pH的測(cè)定：用pH計(jì)測(cè)定培養(yǎng)液的pH值并記錄。

OD值的測(cè)定：平行組第三組的纖維素膜用蒸餾水洗凈，放入錐形瓶中加50ml醋酸鈉-醋酸緩沖液，再加2ml纖維素酶液放進(jìn)搖床內(nèi)振蕩，待纖維素膜全部溶解后過(guò)濾取濾液用紫外分光度計(jì)在600nm波長(zhǎng)下測(cè)其吸光度并記錄。

總酸的測(cè)定：用10ml移液管取10ml培養(yǎng)液于100ml錐形瓶中，然后加50ml無(wú)二氧化碳水再加兩滴酚酞作指示劑，用NaOH標(biāo)準(zhǔn)液滴定至出現(xiàn)微紅色且30s內(nèi)不褪色即為滴定終點(diǎn)，記錄堿式滴定管的始末讀數(shù)。

總糖的測(cè)定：用亞鐵氰化鉀法測(cè)定總糖的含量。分別配制好斐林甲液、好斐林乙液以及1g/L葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液。先做空白試驗(yàn)。

3　結(jié)果與分析

3.1不同氮源對(duì)產(chǎn)纖維素菌的影響

表1　不同氮類(lèi)對(duì)培養(yǎng)基總酸的影響

從圖可以看出以酵母膏為氮源的培養(yǎng)基，產(chǎn)纖維素菌生長(zhǎng)比較出色，但是產(chǎn)生的膜并沒(méi)有以牛肉膏為氮源的重，說(shuō)明菌體長(zhǎng)得越出色并不能代表它所產(chǎn)生的菌膜越多。培養(yǎng)基的pH值相差不多，總體來(lái)說(shuō)，以牛肉膏為氮源的培養(yǎng)基更有利于產(chǎn)纖維素菌產(chǎn)膜。

3.2不同pH值對(duì)產(chǎn)纖維素菌的影響

表2　不同pH值對(duì)培養(yǎng)基總酸的影響

當(dāng)培養(yǎng)基pH值為3時(shí)，產(chǎn)纖維素菌沒(méi)有生長(zhǎng)，所以也沒(méi)有產(chǎn)膜，當(dāng)pH值逐漸上升至5時(shí)，產(chǎn)纖維素菌生長(zhǎng)最為旺盛，產(chǎn)生的膜也最多，消耗的糖也最多，pH升到6時(shí)，產(chǎn)纖維素菌生長(zhǎng)情況開(kāi)始下降。說(shuō)明適合產(chǎn)纖維素菌生長(zhǎng)的最佳pH是5。

4　結(jié)論

以葡萄糖為碳源時(shí)，以不同氮源，培養(yǎng)基pH值的條件為變量，培養(yǎng)產(chǎn)纖維素菌，通過(guò)測(cè)量分析各培養(yǎng)基的理化指標(biāo)：膜干重，菌體濃度，總酸，殘?zhí)牵琾H值。綜上所述，以葡萄糖為碳源時(shí)，產(chǎn)纖維素菌最適生長(zhǎng)和產(chǎn)膜的最適氮源是牛肉膏，最適pH值是5。

［1］茍金霞.醋酸菌生產(chǎn)細(xì)菌纖維素的研究［C］.陜西科技大學(xué)，2005：1-2.

［2］王淑芳，馬桂珍，石桐磊，暴增海.接種量和酸堿度對(duì)滑菇菌絲生長(zhǎng)量的影響［J］.2011（21）：152-154.

10.16640/j.cnki.37-1222/t.2016.14.209