bcl-2 基因修飾神經干細胞移植修復大鼠脊髓損傷

張　梅，王躍新*，侯曉華，洪　軍，殷勝春，李　巖，劉慶陽

(1.唐山市工人醫院，河北 唐山　063000；2. 煤炭總醫院，北京　100028)

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bcl-2 基因修飾神經干細胞移植修復大鼠脊髓損傷

張梅1，王躍新1*，侯曉華1，洪軍1，殷勝春1，李巖1，劉慶陽2

(1.唐山市工人醫院，河北 唐山063000；2. 煤炭總醫院，北京100028)

目的探討bcl-2 基因修飾神經干細胞移植對脊髓損傷大鼠損傷神經功能恢復的影響。方法體外培養大鼠神經干細胞， 經Ad-EGFP為載體介導端B淋巴細胞瘤-2基因(bcl-2)基因轉染神經干細胞，分為3組：對照組、陰性轉染組、bcl-2轉染組。Western-blot檢測神經干細胞在轉染前后bcl-2蛋白的表達。成年雌性SD大鼠85只，造模成功72只,隨機分為對照組，NSCs組，bcl-2-NSCs組, 24只/組，按照改良的Allen打擊法建立大鼠急性脊髓損傷模型。通過BBB評分、斜板試驗進行運動功能評定。造模后7 d通過RT-PCR及Western-blot檢測檢測脊髓損傷區周圍HSP27、c-fos基因的表達，TUNEL法檢測細胞凋亡情況。造模后4周取材行病理切片HE染色及熒光顯微鏡觀測EGFP標記的NSC存活及分布情況，通過SEP和MEP觀察大鼠神經電生理恢復情況。結果bcl-2基因轉染大鼠神經干細胞后，bcl-2轉染組與對照組、陰性轉染組相比bcl-2基因和蛋白水平均有表達(P< 0.05)；大鼠下肢運動功能評價bcl-2-NSCs組優于NSCs組，NSCs組優于對照組。造模后72 h，bcl-2-NSCs組細胞凋亡數均明顯低于對照組和NSCs組(P< 0.05)。造模后7 d，與對照組和NSCs組相比，bcl-2-NSCs組HSP27基因和蛋白的表達均較顯著升高(P< 0.05)，bcl-2-NSCs組c-fos基因和蛋白的表達較顯著降低(P< 0.05)。造模后4周，HE染色對照組可見脊髓組織缺失及脊髓空洞形成，無神經軸索通過。NSCs組損傷區可見少量神經軸索樣結構，脊髓空洞較小，bcl-2-NSCs組可見較多神經軸索樣結構，未見脊髓空洞。EGFP標記的陽性細胞數：bcl-2-NSCs組最多，NSCs組次之，對照組未見，且各組之間差異有顯著性(P< 0.05)。造模后4周，SEP和MEP的潛伏期：bcl-2-NSCs組NSCs組>對照組，且各組之間差異有顯著性意義(P< 0.05)。結論通過Ad-EGFP為載體介導端B淋巴細胞瘤-2基因(bcl-2)基因轉染使神經干細胞能夠促進體外培養的大鼠神經干細胞增殖。 bcl-2 基因修飾神經干細胞移植可促進脊髓損傷大鼠神經突觸的再生，升高脊髓損傷區HSP27表達，降低脊髓損傷區bcl-2基因的表達和神經細胞凋亡，改善大鼠的肢體運動功能和電生理功能。

脊髓損傷；bcl-2 基因；修飾；神經干細胞；移植；修復；大鼠；神經功能

脊髓損傷(spinal cord injury，SCI)是一種常見的嚴重創傷，可導致創傷部位以下區域感覺和運動功能的不可逆損傷，且缺乏有效的治療方法。在創傷區內抑制細胞凋亡對脊髓保護是非常重要的[1]。然而，由于SCI的病理生理機制的復雜性及多變性，還沒有令人滿意的藥物或外科手術來治愈SCI[2]，因此，對SCI潛在治療方法的發掘仍迫在眉睫。

神經干細胞(NSC)是指具有分化為神經元，少突膠質細胞和星型膠質細胞能力，且能夠自我更新并形成神經組織的細胞[3]。NSC具有的定向遷移、組織融合及免疫豁免性，使其在損傷移植后可以很好的存活。且研究已證實NSC移植安全有效，對小鼠的正常生長發育無明顯影響。

B淋巴細胞瘤-2在神經系統及其他多種組織均有表達。SCI后，Bcl-2蛋白在幸存神經元中表達量明顯增加，提示它是一種神經系統重要的保護性因子。有學者發現， Bcl-2的過表達能夠使中樞神經繼發性損傷減輕，改善預后，但是有關機制尚未闡明。本文將Bcl-2基因轉染NSC細胞，檢測NSC細胞的生物學特性，并進一步探討Bcl-2-NSC對大鼠SCI功能恢復的影響。

1　材料和方法

1.1實驗動物

清潔級SD大鼠85只，1月齡，體重(230～270)g。購自唐山恒安生物工程有限公司【SCXK(冀)2010-0-055】，唐山工人醫院SPF 級實驗動物室常規飼養【SYXK(冀)2011-0012】。

1.2主要試劑與儀器

胰蛋白酶(美國Santa Cruz 公司)；PBS 緩沖液粉劑(福州邁新)；Western-blot蛋白檢測試劑盒(美國 Santa Cruz 公司)；BCA 蛋白濃度測定試劑盒(Beyotime 公司)；細胞培養箱(美國Thermo Forma 公司)；化學發光檢測試劑盒(美國Pierce)；Bcl-2單克隆抗體(北京中山試劑公司)；TUNEL染色試劑盒(Promega)；Trizol試劑(美國Invitrogen公司)；QuantiTect逆轉錄試劑盒(德國QIAGEN公司)；HSP-27(美國Abcam公司)；KEYPOINT 4誘發電位儀(北京市康泰醫療器械有限公司)；掃描分析軟件系統(Labworks Analysis Software，美國)。1.3實驗方法

1.3.1神經干細胞培養、鑒定標記、NSC及bcl-2-NSC懸液的制備

取孕14 d的SD大鼠處死，75%的酒精浸泡消毒。切取胎鼠大腦，浸泡在DMEM/F12液中，去除腦膜和血管。將去除腦膜和血管的胎腦浸泡于DMEM/F12液中，用吸管反復吹打成懸液，過100目孔篩網，過濾的懸液接種于培養瓶中，加EGF, bFGF，N2添加劑，37℃，5%CO2培養箱中培養。72 h后換液。培養神經干細胞3 d后接種到涂布多聚賴氨酸的蓋玻片上，以一抗Brdu 1:400的比例，進行免疫細胞化學染色，并用DAB 顯色。對形成的神經球行nestin免疫組織化學染色，進行鑒定。 將移植前2 d呈對數生長期的NSC進行離心，添加培養液，反復吹打至單細胞懸液并進行計數，將種植密度調整為1×106/mL。在培養瓶中加入感染復數(MOI)為200PFU/細胞漿含bcl-2-Ad-EGFP顆粒的儲存液，于培養箱中溫育48 h后離心，并棄去上清液，再次吹打至單細胞懸液并進行計數，將種植密度調整為2×107個/μL。同時制備單純NSC懸液(濃度為2×107個/μL)。1.3.2Western-blot檢測Bcl-2蛋白表達

轉染后48 h，按照3組細胞,提取總蛋白，5%濃縮膠40 V衡壓1 h，10%分離膠60 V恒壓3.5 h，濕轉14 V恒壓14 h，37℃搖床封閉2 h， 洗膜10 min，3次，兔抗鼠抗體Bax或BCL-2(1∶800)4℃ 過夜；抗鼠β-actin(1∶1 000)4℃過夜。TBST洗膜5 min×4次，山羊抗兔抗體1∶700，37℃搖床孵育1.5 h，TBST 洗膜5 min×4 次。再次運用TBS洗膜10 min后DAB顯色，BCL-2與β-actin的灰度積分的比值進行分析，作為BCL-2 蛋白表達的量。

1.3.3大鼠SCI模型的制備及干預

將SD大鼠進行麻醉、固定并剃毛，暴露大鼠棘突和椎板，將T8-9的棘突及部分椎板切除，并將黃韌帶切除，顯露出硬腦膜。按照改良Allen法操作方法依次設計打擊錘重量為10 g，打擊高度為2.5 cm進行脊髓打擊，鼠尾及雙后肢可見痙攣性伸直片刻后又松弛表示造模成功,參考Zlokovic等[4]的方法將造模成功后3 d動物再次麻醉后進行細胞移植，隨機分為3組，每組24只，單獨放于3個籠子里。保持動物良好的衛生條件，允許其自由采食，并給與供水。其中，對照組：SCI后注入5 μL生理鹽水溶液；NSCs組：注入等量NSC懸液；bcl-2-NSCs組：注入等量bcl-2-NSC懸液(細胞數均為2×107個/μL)。

1.3.4運動功能評價

3組大鼠均于SCI后的不同時期采用BBB評分、斜板試驗評價運動功能。BBB評分[5]：共22級，0級：后肢完全癱瘓，21級：功能正常，主要觀察指標包括關節活動次數，運動負荷、范圍，前肢、后肢及前爪、后爪、尾巴的協調程度。斜板試驗：大鼠放置在光滑的木板上，體軸垂直于板的垂直軸，每個試驗斜板的角度增加5度，當最大角度時大鼠可停留5秒，則認為有功能價值。

1.3.5RT-PCR及Western-blot 檢測HSP-27、c-fos基因的表達

取各組大鼠損傷區的脊髓組織50 mg，Trizol 法提取總RNA，用RT-PCR兩步法試劑盒將mRNA逆轉錄成cDNA，將cDNA行PCR擴增。HSP27的引物序列：上游5’-GGCGCTCAACCGGCAACTCA-3’,下游5’-CTCAGGGACAGGGAAGAG-3’,GAPDH：上游5’-ACCTGACCTGCCGTCTAGAA-3’,下游：5’-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3’,c-fos：上游5’- GAC AGC CTT TCC TAC TAC CAT TTC C-3’,下游5’-CCA TCT TAT TCC TTT CCC TTC-3’反應條件：94℃ 5 min之后，94℃變性30 s，56℃退火30 s，72℃延伸45 s，23個循環后再72℃延伸10 min。PCR產物采用瓊脂糖凝膠電泳。RT-PCR提取后的剩余物經1500 r/min 離心30 min后，取上清為粗體蛋白， Bradford法測定總的蛋白濃度。5%濃縮膠40 V衡壓1 h，10%分離膠60 V恒壓3.5 h，濕轉14 V恒壓14 h，37℃搖床封閉2 h， 洗膜10 min，3次，兔抗鼠抗體HSP-27或c-fos(1∶800)4℃ 過夜；抗鼠GAPDH(1∶1000)4℃過夜。TBST洗膜5 min×4 次，山羊抗兔抗體1∶700，37℃搖床孵育1.5 h，TBST 洗膜5 min×4 次。再次運用TBS洗膜10 min后DAB顯色，HSP-27、c-fos與GAPDH的灰度積分的比值進行分析，為HSP-27、c-fos 蛋白表達的量。1.3.6TUNEL法檢測細胞凋亡率

取脊髓組織進行石蠟切片處理。TUNEL法檢測按德國Roche公司試劑盒購操作。待水化、37℃條件下蛋白酶K消化10 min，進行標記液標記后， 37℃下，經生物素化的地高辛反應30 min，加SABC，DAB顯色。封片后對胞核含棕黃色顆粒的細胞計數。

1.3.7HE染色及熒光顯微鏡觀察EGFP標記的NSC存活及分布

3組各隨機取5只大鼠，取脊髓組織，固定用4%多聚甲醛，沖洗用生理鹽水。從病變部位取長約1 cm的完整脊髓，經分級系列酒精脫水，縱向切片，厚約20 μm，進行HE染色。隨機取10個視野，用高倍熒光顯微鏡(×20)觀察EGFP標記的NSC的存活及分布情況。

1.3.8檢測運動誘發電位和體感誘發電位

每組隨機取5只大鼠，用KEYPOINT 4誘發電位儀檢測后肢體感及運動誘發電位。將大鼠進行麻醉、固定，并準確安放參考及記錄電極。直流波電脈沖刺激參數設計：3 Hz的頻率，0.2 ms的波寬，5～15 mA的電流強度，50～60倍的疊加次數，后肢有輕微抽搐為參數設計良好。觀察并記錄數值變化。同樣的方法檢測運動誘發電位并記錄。

1.4統計學方法

2　結果

2.1NSCs體外培養、鑒定及標記

腦組織單細胞懸液接種于培養瓶后1 h，大部分細胞沉積在瓶底，呈圓形、無突起，同時可以觀察到小的細胞團，其中NSCs細胞數量較少。1 d后NSCs增多、較小、形狀不規則，小部分細胞團貼壁；5 d后NSCs增多，為較大、形狀規則的球形。免疫組化染色顯示，NSCs球呈Nestin強陽性表達。

2.2Western-blot

基因在轉染3 d及14 d后，bcl-2轉染組的神經干細胞檢測到 bcl-2 蛋白表達明顯，而對照組和陰性轉染組 bcl-2蛋白無表達，說明了bcl-2基因已穩定整合入bcl-2轉染組神經干細胞中，且可以行目的蛋白的穩定表達，如圖2A-B所示。

2.3運動功能評定結果

造模前所有大鼠的BBB評分、斜板試驗評分差異均無顯著性意義(P< 0.05)。移植后4周，NSCs組，bcl-2-NSCs組兩項評分在損造模后2～4周較對照組都明顯增加，差異有顯著性意義(P< 0.05)。bcl-2-NSCs組兩項評分在損造模后2～4周較NSCs組明顯增加，差異有顯著性意義(P< 0.05)，見表1。

表1　各組大鼠運動功能評定結果(n=5)

注：與對照組相比，aP< 0.05；與NSCs組相比bP< 0.05。

Note.Compared with the control group,aP<0.05;Compared with NSCs groupbP<0.05.

注：(1A)倒置微鏡下觀察培養的原代神經干細胞形態(×40)；(1B)神經干細胞Nestin免疫熒光化學染色陽性(×40)；(1C)EGFP標記的NSCs(×100)。圖1　神經干細胞的培養、鑒定及標記Note.(1A)primary neural stem cell morphology was observed under inverted microscope cultured(×40)；(1B)neural stem cells Nestin immunofluorescence staining(×40)；(1C)EGFP-labeled NSCs(×100).Fig.1　Culture, identification and labeling of neural stem cells

注：(A)轉染3 d；(B)轉染14 d。圖2　bcl-2蛋白在神經干細胞中的穩定表達Note.(A)Transfection 3 days；(B)Transfection 14 days.Fig.2　Bcl-2 protein was stably expressed in neural stem cells

注：(3A)對照組；(3B)NSCs組；(3C)bcl-2-NSCs組。圖3　HE染色觀察各組神經細胞樣形態學(×40)Note.(3A)The control group；(3B)NSCs group；(3C)bcl-2-NSCs group.Fig.3　HE staining in each group of neural cell-like morphology

注：(4A)對照組；(4B)NSCs組；(4C)bcl-2-NSCs組。圖4　熒光顯微鏡觀察EGFP標記的綠色熒光細胞(×20)Note.(4A)The control group；(4B)NSCs group；(4C)bcl-2-NSCs group.Fig.4　Fluorescence microscopy of GFP-tagged green fluorescent cells

2.4HE染色和熒光顯微鏡觀察

傷后4周，HE染色對照組可見損傷處脊髓組織斷裂，為瘢痕連接，有明顯空洞形成 (圖3A)。NSCs組在移植部位組織空洞較對照組小，較bcl-2-NSCs組大(圖3B)。bcl-2-NSCs組空洞消失(圖3C)。NSCs組及bcl-2-NSCs組切片中均可見散在的EGFP標記的陽性的綠色熒光(圖4A-C)：對照組為(0±0.00)個/高倍視野，NSCs組為(12.15±3.24)個/高倍視野，bcl-2-NSCs組為(27.34±4.41)個/高倍視野，各組之間差異顯著(P<0.01)。

2.5HSP-27、c-fos基因和蛋白的表達

造模后7天，與對照組和NSCs組相比，bcl-2-NSCs組HSP27基因的表達顯著升高，P< 0.05，c-fos基因的表達顯著降低P< 0.05；與對照組比較，NSCs組GSP27蛋白的表達顯著升高，P< 0.05，c-fos蛋白的表達顯著降低P< 0.05，見圖5。

2.6TUNEL檢測細胞凋亡

凋亡神經細胞的細胞核內可見特異性棕黃色顆粒，TUNEL法測定，NSCs組中，免疫組化呈棕黃色顆粒的凋亡細胞數(20.41±4.38)明顯少于對照組(30.12±3.44)(P< 0.05)，bcl-2-NSCs組凋亡細胞最少(9.57±2.31)。見圖6。

2.7體感誘發電位和運動誘發電位

移植后4周，對照組體感誘發電位和運動誘發電位少量恢復，bcl-2-NSCs組感誘發電位和運動誘發電位明顯恢復，波幅增高。各組大鼠體感誘發電位潛伏期和波幅，見表2。NSCs組與對照組比較差異有顯著性意義(P< 0.05)。bcl-2-NSCs組與對照組比較差異有非常顯著性意義(P< 0.01)。NSCs組與bcl-2-NSCs組比較差異有顯著性意義(P< 0.05)，表明bcl-2-NSCs組電信號從后肢到頭皮傳導時間比其他組都短，傳導通路已經暢通，恢復較好。

圖5　脊髓損傷區HSP-27、c-fos基因與蛋白的表達Fig.5　Expression of HSP-27、c-fos gene and protein in spinal cord injury

注：(6A)對照組；(6B)NSCs組；(6C)bcl-2-NSCs組。圖6　TUNEL檢測各組細胞凋亡(×20)Note.(6A)The control group；(6B)NSCs group；(6C)bcl-2-NSCs group.Fig.6　TUNEL staining of each group

組別(group)體感誘發電位(somatosensoryevokedpotential,SEP)運動誘發電位(motorevokedpotentials,MEP)潛伏期(ms)波幅(μV)潛伏期(ms)波幅(μV)對照組(comparisongroup)32.241±2.4571.236±0.11616.227±0.3471.635±0.121NSCs組(NSCsgroup)26.821±2.530a1.727±0.117a12.436±0.244a2.447±0.319abcl-2-NSCs組(bcl-2-NSCsgroup)17.237±1.418b2.231±0.125b8.741±0.329b3.738±0.445b

注：與對照組相比，aP< 0.05；與NSCs組相比bP< 0.05。

Note.Compared with the control group，aP<0.05;Compared with NSCs group，bP<0.05.

3　討論

SCI的病理損傷分為原發性SCI和繼發性SCI[5]。發生前者時，損傷的脊髓組織會經歷神經元凋亡、炎癥反應、氧自由基損傷等破壞性及軸突再生等修復性過程，屬于不可逆性損傷。后者則是由前者引發的一系列神經病理變化，給予積極的治療手段可減慢其發生、發展，屬于可控性損傷，所以目前將繼發性SCI作為研究的焦點[6]。近來，Bcl-2減輕繼發性SCI的作用越來越引起關注，除了抗凋亡功能外，一些研究提示，過表達的Bcl-2能夠阻止由中毒、缺氧、缺乏生長因子等誘發的神經元死亡[7]，提示Bcl-2對神經功能的保護作用是多方面的[8]。

Bcl-2基因家族包括促進(Bax)和抑制(Bcl-2)細胞凋亡的兩大類成員，是SCI后細胞凋亡的重要調控基因。研究認為，Bcl-2與Bax以二聚體的形式在體內發揮作用，二者的比例是決定細胞存亡的關鍵[9]。燕景峰等[10]研究發現，Bcl-2組表達在各個時間點上較SCI、NSC組明顯增多，凋亡率降低。本實驗運用多項技術，研究了Bcl-2-NSC治療小鼠SCI后機體的恢復情況。通過Ad-EGFP為載體介導Bcl-2基因轉染使神經干細胞能夠明顯抑制細胞凋亡、促進神經干細胞增殖及修復，與前人的研究結果一致。

HSP是其中重要的一員，主要參與穩定細胞骨架。路艷等[11]發現，HSP(heat shock proteins，熱休克蛋白，簡稱為HSP)可與APaf-1結合，阻止形成APaf-1/Cyt-c/casPase-9凋亡復合體，進而阻止細胞凋亡，起到保護神經系統損傷的作用。在實驗中我們觀察到，Bcl-2高表達小鼠的脊髓標本上HSP的表達明顯升高，對提高脊髓的應激性、耐受缺血缺氧等損傷明顯是有利的。

本實驗僅對部分內容進行了探索，尚存在許多不足之處，還需要更進一步的探究。但本實驗中涉及到轉基因技術已引起了研究人員的極大興趣，也許在不久的將來會有更廣闊的前景。因此繼續探索并完善基因修飾NSC移植治療SCI的理論水平和分子機制，從而使基因治療早日應用于臨床，是我們進一步研究的課題和努力的方向。

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Bcl-2 gene-modified neural stem cell transplantation for spinal cord injury in rats

ZHANG Mei1，WANG Yue-xin1*，HOU Xiao-hua1，HONG Jun1,YIN Sheng-chun1，LI Yan1，LIU Qing-yang2

(1. Tangshan Worker’s Hospital，Tangshan 063000，China；2.Coal General Hospital，Beijing 100028，China)

ObjectiveTo investigate the bcl-2 gene modification on neurological function recovery in rats with spinal cord injury in neural stem cell transplantation. Methods Cultured rat neural stem cells by Ad-EGFP as vector-mediated side B-cell lymphoma 2 gene (bcl-2) gene transfection of neural stem cells were divided into 3 groups: control group, negative transfection group, bcl-2 transfection group. Use western-blot to detect the expression of bcl-2 protein in neural stem cells before and after transfection. 85 adult female SD rats, successful model 72, were randomly divided into control group, NSCs group, bcl-2-NSCs groups, 24/group, rat acute spinal cord injury model in accordance with a modified Allen’s method. Assess the motor function by BBB rating and the swash plate test. 7 days after modeling by RT-PCR and Western blot detection of spinal cord injury around HSP27, c - fos gene expression, TUNEL assay apoptosis. Four weeks after model drawn line HE staining and fluorescence microscopy EGFP-labeled NSC survival and distribution of the rats neurophysiological recovery by SEP and MEP.Resultsbcl-2 gene transfection of rat neural stem cells, bcl-2 transfection group and control group, negative transfection group compared to bcl-2 mRNA and protein levels were expressed (P< 0.05); lower extremity motor function in rats evaluation of bcl-2-NSCs group than NSCs group, NSCs group than the control group. 72 hours after modeling, bcl-2-NSCs number of apoptotic cells were significantly lower than the control group and NSCs group (P< 0.05). 7 days after modeling, compared with the control group and NSCs group, bcl-2-NSCs group HSP27 gene and protein expression was significantly higher than that (P< 0.05), bcl-2-NSCs group c-fos mRNA and protein expression was significantly reduced compared (P< 0.05). 4 weeks after modeling, HE staining control group showed spinal cord tissue loss and the formation of syringomyelia, no axonal through. NSCs group damage zone few of neuraxis-like structures, syringomyelia smaller, bcl-2-NSCs group showed more nerve axon-like structure, no syringomyelia. EGFP-positive cells labeled: bcl-2-NSCs group the most, NSCs group followed, no control group, and the difference between the groups was statistically significant (P< 0.05). After the 4th week, SEP and MEP latency period: bcl-2-NSCs group NSCs group> control group, and between the groups was significant difference (P< 0.05). Conclusions By Ad-EGFP as vector-mediated side B-cell lymphoma 2 gene (bcl-2) gene transfection make neural stem cells can promote cultured rat neural stem cells. bcl-2 gene-modified neural stem cell transplantation can promote the regeneration of spinal cord injury synaptic elevated HSP27 expression after spinal cord injury, reduced expression and neural cell apoptosis after spinal cord injury bcl-2 gene and improve limb movement in rats function and electrophysiological function.

Spinal cord injury;Bcl-2 gene; Modification; Neural stem cells;Transplantation;Repair;Rat;Nerve function

唐山市科技計劃項目(15130254a)。

張梅(1980-)，女，本科，研究方向：脊柱脊髓損傷及其護理。E-mail：zhangmeiwang1@163.com。

王躍新(1979-)，男，碩士，研究方向：脊髓脊柱損傷。E-mail：m13102643830@163.com。

研究報告

R-332

A

1671-7856(2016)07-0035-07

10.3969.j.issn.1671-7856.2016.07.006

2016-01-12