腎小管上皮細胞線粒體氧化損傷在腎間質纖維化中的作用及機制

黃繼義　鐘鴻斌　逯富華　朱茂述廈門市第五醫院腎內科，福建廈門　361000

腎小管上皮細胞線粒體氧化損傷在腎間質纖維化中的作用及機制

黃繼義鐘鴻斌逯富華朱茂述
廈門市第五醫院腎內科，福建廈門361000

目的探討腎小管上皮細胞線粒體氧化損傷在腎間質纖維化中的作用機制。方法2015年6～12月期間，于本地動物實驗中心選取60只健康雄性大鼠，根據處理方法的不同將其分為實驗組和對照組，其中實驗組行左側輸尿管結扎術，對照組則僅接受左側輸尿管游離，14 d后對兩組大鼠的左側腎臟中線粒體相關基因的表達情況、腎臟功能等參數進行檢測分析。結果實驗組大鼠術后14 d mtDNA（1.49±0.12）、NRF1（1.87±0.17）、PGC1a （1.76±0.21）、Drp1（2.49±0.24）、Mfn2（2.45±0.27）的表達水平均明顯高于對照組（1.07±0.23、1.11±0.29、1.05±0.32、1.14±0.35、1.17±0.14），差異具有統計學意義（P＜0.05）；術后14 d，實驗組大鼠腎臟組織中的COX（2.61±0.27）明顯高于對照組的（1.07±0.19），SOD較對照組明顯降低（0.55±0.16 vs 1.07±0.18），其RIF指數（22.76±1.39）明顯高于對照組的（0.81±0.16），差異具有統計學意義（P＜0.05）。結論在腎間質纖維化中腎小管上皮細胞線粒體氧化損傷發揮著十分重要的作用，缺氧所造成的線粒體氧化損傷會造成腎小管功能受損，引起大量致纖維因子的產生，并從多途徑引起腎間質纖維化。

腎間質纖維化；腎小管上皮細胞；線粒體氧化損傷；腎小管功能

［Abstract］Objective To discuss the effect andmechanism ofmitochondria oxidative damage in renal tubular epithelial cells on renal interstitial fibrosis.M ethods A total of 60 healthmale ratswere selected from a local animal experimental center from June to December 2015 and divided into study group and control group.Rats in the study group were given left ureteral obstruction，while those in the control group were only given left ureteralmobilization.Parameters including the expression of genes in mitochondria and renal function of the left kidney were detected and analyzed after 14 days.Results At 14 d after surgery，the expression levels ofmtDNA（1.49±0.12），regenerating gene（1.87±0.17），interrupted gene（1.76±0.21），and fusion gene（2.49±0.24，2.45±0.27）in the study group were all significantly higher than those（1.07±0.23，1.11±0.29，1.05±0.32，1.14±0.35，and 1.17±0.14）in the control group（P＜0.05）.The level of COX （2.61±0.27）in kidney tissues in the study group was significantly higher than that（1.07±0.19）in the control group，while the level of SOD was significantly lower than the control group（0.55±0.16 vs 1.07±0.18）.The RIF index（22.76± 1.39）in the study group was significantly higher than that（0.81±0.16）in the control group（P＜0.05）.Conclusion Mitochondria oxidative damage in renal tubular epithelial cells has a significant effect on renal interstitial fibrosis.Mitochondria oxidative damage caused by anoxia may lead to functional impairment of kidney tubules，inducing a large number of fibrosis factors and resulting in renal interstitial fibrosis from multiple pathways.

［Key words］Renal interstitial fibrosis；Renal tubular epithelial cell；Mitochondria oxidative damage；Renal tubular function

絕大部分慢性腎臟疾病均存在腎間質纖維化表現，如間質細胞外基質和小管基底膜成分出現定量及定性改變、肌纖維母細胞聚集、腎小管萎縮等［1］。目前大量研究均指出，在腎小管基膜破壞過程中，患者多存在腎小管上皮細胞轉化為肌纖維母細胞樣細胞現象，繼而引起間質區出現大量細胞外基質（engine controlmodule，ECM）沉積，引發腎小管萎縮，最終造成間質纖維化病損［2，3］。本次研究在2015年6～12月期間通過建立大鼠模型，旨在探討腎小管上皮細胞線粒體氧化損傷在腎間質纖維化中的作用機制。現報道如下。

1　資料與方法

1.1一般資料

選取21日齡SD雄性成年大鼠60只，由本地動物實驗中心提供，實驗動物生產許可證號為SCXK2015-0002。將其隨機分為對照組和實驗組，實驗組大鼠30只，平均體重（221.9±12.4）g，對照組大鼠30只，平均體重（216.7±13.5）g，兩組大鼠的日齡、體重等一般資料比較差異無統計學意義（P＞0.05）。其中對照組接受左側輸尿管游離，實驗組大鼠接受左側輸尿管結扎術。

1.2方法

1.2.1模型制備方法 實驗組：取10%水合氯醛（0.03 mL/kg）對大鼠行腹腔注射麻醉，在手術臺上對其行右側臥位固定，剪除體毛后對手術區進行消毒，取左側腹切口，將皮膚、肌肉和腹壁各層逐層切開，使左側輸尿管暴露并對其進行分離，使用5-0絲線對其進行結扎并離斷輸尿管，逐層縫合完成手術。對照組大鼠僅對左側輸尿管進行游離，但不進行結扎和離斷。

1.2.2檢測方法術后14 d摘取兩組大鼠左側腎臟，并對其進行處理，對下述指標進行檢測：①線粒體基因表達水平：采用Real-time PCR技術度兩組大鼠腎小管上皮細胞線粒體NRF1、PGC1a、Drp1、Mfn2和mtDNA（mitochondrial DNA，mtDNA）的表達水平進行檢測記錄；②超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、環氧酶（cyclo-oxygenase，COX）水平：采用Real-time PCR技術對兩組大鼠腎臟組織中的SOD和COX水平進行檢測；③腎間質纖維化（renal interstitial fibrosis，RIF）指數：對大鼠腎臟組織進行Masson染色，其中膠原纖維呈綠色，對其中綠色數量進行統計；④對兩組大鼠的腎組織羥脯氨酸（hydroxyproline，Hyp）含量進行比較。

1.3統計學方法

采用統計學軟件SPSS18.0進行數據分析，計量資料以均數±標準差（±s）表示，組間結果比較進行t檢驗，P＜0.05為差異具有統計學意義。

2　結果

2.1兩組大鼠線粒體基因表達水平比較

實驗組大鼠術后14 d mtDNA（1.49±0.12）、NRF1 （1.87±0.17）、PGC1a（1.76±0.21）、Drp1（2.49±0.24）、Mfn2 （2.45±0.27）的表達水平均明顯高于對照組，差異具有統計學意義（P＜0.05），提示實驗組大鼠腎臟組織中的線粒體具有較高活性。見表1。

2.2兩組大鼠術后14 d腎臟指標比較

術后14 d，實驗組大鼠腎臟組織中的COX明顯高于對照組，SOD較對照組明顯降低，其RIF指數明顯高于對照組，且實驗組大鼠腎體比、腎臟Hyp含量均明顯高于對照組，差異具有統計學意義（P＜0.05）。見表2。

表1　兩組大鼠線粒體基因表達水平比較（±s）

表1　兩組大鼠線粒體基因表達水平比較（±s）

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表2　兩組大鼠術后14 d腎臟指標比較（±s）

表2　兩組大鼠術后14 d腎臟指標比較（±s）

COX　SOD　RIF指數　Hyp （μg/g）腎體比（mg/g）組別　n實驗組對照組t值P值30 30 2.61±0.27 1.07±0.19 25.549 0.000 0.55±0.16 1.07±0.18 -11.826 0.000 22.76±1.39 0.81±0.16 80.227 0.000 481.79±25.40 411.54±31.75 9.463 0.000 10.71±0.37 7.49±0.42 31.509 0.000

3　討論

慢性腎臟疾病已成為嚴重威脅公眾健康的常見慢性疾病，此種患者多以腎纖維化作為病理基礎。Huising MO等［4］研究證實，在腎纖維化早期可采取有效措施促進其逆轉，特別是對于腎間質和腎小管而言，其具有自我修復功能，在一定程度上可促進腎間質纖維化的逆轉。

腎間質纖維化作為多種慢性腎臟疾病的終末期病例特點，在腎臟結構破壞過程中具有十分重要的作用，會造成間質毛細血管破壞、腎小管萎縮、成纖細胞增生和腎間質中細胞外基質的積聚［5-7］。相關資料顯示，腎間質纖維化主要從以下四個方面實現：細胞損傷及活化、促炎因子和致纖維化因子產生、纖維化形成、腎臟結構和功能喪失，在此過程中，腎小管上皮細胞損傷和功能不全占據著十分關鍵的位置［8，9］。臨床研究證實，缺氧性損傷會造成腎小管上皮細胞損傷，主要由于腎小管上皮細胞具有高溶轉運活性特征，對于線粒體能量供給具有較高要求，缺氧會造成線粒體氧自由基產生增多，與線粒體膜結合造成其通透性改變［10-13］。從而引起細胞色素C由線粒體進入細胞漿，引發細胞損傷途徑。左側輸尿管結扎會造成腎臟組織出現血流動力學改變，引起組織發生缺氧缺血性損傷，從而導致腎間質纖維化的發生［14］。

在本研究中，通過對大鼠左側輸尿管進行結扎以模擬腎小管上皮細胞線粒體氧化損傷，通過對兩組小鼠腎臟組織中線粒體的基因表達情況進行檢測，結果顯示實驗組大鼠的mtDNA、NRF1、PGC1a、Drp1、Mfn2表達水平均明顯高于對照組（P＜0.05），提示在實驗組大鼠中存在顯著的腎臟線粒體活性增強表現，表明模型建立成功。

腎間質纖維化的形成機制較為復雜，以ECM積聚和腎間質纖維細胞增生為主要病理特征。SOD、COX作為表征腎小管上皮細胞活性的主要指標，在發生腎小管損傷時，COX和SOD水平會出現相應變化。在本研究中，術后14 d實驗組大鼠的SOD水平明顯低于對照組，COX則明顯高于對照組（P＜0.05），表明實驗組大鼠存在十分顯著的腎小管上皮細胞損傷，結合線粒體基因表達情況，提示缺氧所造成的線粒體氧化損傷同腎小管上皮細胞損傷之間存在密切聯系。其中，氧化損傷所引起的腎小管上皮細胞損傷會造成大量致纖維因子的產生，引起ECM產生和降解失衡，從而在腎間質中出現大量ECM沉積，造成患者腎小管萎縮和腎功能減退。在眾多致纖維化因子中，以TGF-β1作用最為顯著。Jelakovic B等［15］研究指出，腎間質中的TGF-β1因子主要來源于肌纖維母細胞和成纖維細胞，在本次研究中，腎臟組織Masson染色試驗證實，在實驗組大鼠中存在明顯腎間質纖維化表現，再次證實缺氧損傷會誘發腎間質纖維化。同時對兩組大鼠的腎臟發育情況進行分析顯示，實驗組大鼠的腎體比、腎臟Hyp含量均明顯高于對照組（P＜0.05），與相關報道中的結論基本一致。

綜上所述，本次研究從腎小管上皮細胞線粒體氧化損傷研究入手，對腎小管解離在腎間質纖維化中的作用進行分析，創新性從線粒體動力平衡、功能等方面對線粒體損傷同TGF-β1致纖維因子之間的關系進行探討。在腎間質纖維化中腎小管上皮細胞線粒體氧化損傷發揮著十分重要的作用，缺氧所造成的線粒體氧化損傷會造成腎小管功能受損，引起大量致纖維因子的產生，并從多途徑引起腎間質的纖維化。

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Effect and mechanism of m itochondria oxidative damage in renal tubular epithelial cells on renal interstitial fibrosis

HUANG Jiyi ZHONG HongbinLU Fuhua ZHU Maoshu
Department of Nephrology，Xiamen Fifth Hospital，Xiamen361000，China

R692

A

1673-9701（2016）20-0032-03

福建省廈門市科技惠民項目（3502Z20144068）

2016-05-06）