辛基酚聚氧乙烯醚混合菌的構建及響應面優化

劉文斌,張海濤,楊海君,劉亞賓,許云海

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辛基酚聚氧乙烯醚混合菌的構建及響應面優化

劉文斌,張海濤,楊海君*,劉亞賓,許云海

(湖南農業大學植物保護學院,湖南 長沙 410128)

為提高辛基酚聚氧乙烯醚(OPnEO)的生物降解效果,在本實驗室已篩選出的H1、TXBc10、OPQb11、TXBa23四株OPnEO高效降解菌的基礎上,首次從構建OPnEO混合菌的角度,著重探究了四菌株等比例不同組合降解OPnEO的效果.結果表明,混合菌L9(H1∶TXBc10∶TXBa23為1∶1∶1)培養7d后對初始濃度500mg/LOPnEO的降解率最高,達到56.44%,比各單一菌株降解效果有較明顯提高.運用單因素試驗考察了影響L9的相關因素,初步確定L9降解OPnEO的最適外加碳源和氮源分別為葡萄糖和胰蛋白胨,最適初始pH值為7.0,最適溫度為28 ℃,最適接種量為4%. Plackett-Burman試驗篩選獲得影響OPnEO降解率的3個顯著因子為L9接種量、溫度及初始pH值.最陡爬坡試驗逼近3個顯著因子的最大響應區域,采用Box-Behnken試驗設計及響應面法分析,確定L9的最優降解條件為50mL反應體系中接種量4.16%、溫度28.20 ℃、初始pH值7.13、葡萄糖與胰蛋白胨濃度均為2%、OPnEO初始濃度500mg/L、180r/min培養7d,該條件下混合菌L9對OPnEO降解率達62.15%,比未優化條件提高了5%左右.

辛基酚聚氧乙烯醚(OPnEO)；混合菌；響應面法；生物降解

辛基酚聚氧乙烯醚(OPnEO)是繼脂肪醇聚氧乙烯醚之后,性能優異的第二大類非離子表面活性劑.廣泛用于洗滌、紡織、皮革、造紙、農藥等領域.然而,OPnEO自然降解性較差[1],生物積累性強[2-3],加之其降解產生的低分子量低聚物具有很強的環境雌激素效應[4-6],使其在使用過程中不可避免地產生了系列嚴重的環境污染.目前已在城市污水、地面水和飲用水、工業廢水、河流及其底泥沉積物、海洋及其沿岸沉積物中檢測到OP及其OPEO1和OPEO2的存在[7].

就目前的研究報道來看,對非離子表面活性劑污染治理的研究主要集中在烷基酚和壬基酚,且研究重點均放在該類表面活性劑的危害、吸附行為、測定方法、降解菌的篩選與鑒定以及應用方面[8-16].而作為產量高、環境雌激素效應強的OPnEO污染的生物治理技術最近才發展起來,且主要集中在OPnEO高效降解菌的篩選及分離菌對OPnEO降解能力等理論研究方面[17-20].大部分降解菌雖可直接應用,但這些分離、篩選得到的降解菌往往在實際污染環境中的耐受性差、可利用性低,甚至某些降解菌在實際利用中失活.雖然優勢混合菌在廢水污染物的降解及廢物資源化中已有較多報道[21-22],但其在降解表面活性劑特別是OPnEO污染的研究才剛剛開始,鮮有報道.

本研究將在前期實驗已篩選的H1、TXBc10、OPQb11、TXBa23四株辛基酚聚氧乙烯醚(OPnEO)高效降解菌的基礎上,通過等比例組合實驗,構建出高效降解OPnEO的混合菌.并利用響應面法(RSM)優化混合菌降解OPnEO的條件以提高其降解效率.

1 材料與方法

1.1 實驗材料與培養基

1.1.1 菌種來源 醋酸鈣不動桿菌H1 (H1)[18]、氣單胞菌TXBc10(sp. TXBc10)、檸檬酸細菌OPQb11(sp. OPQb11)、假單胞菌TXBa23(sp. TXBa23)[19]均由本實驗室從湖南裳海迪瑞特服裝有限公司污水處理的曝氣池和排污口廢水中篩選獲得.

1.1.2 培養基 LB培養基:酵母浸出物 5.0g,胰蛋白胨 10.0g,NaCl 10.0g,TX-100(OPnEO, n=9- 10)0.5g,H2O 1000mL,pH7.0,若配制固體培養基,則加1.5-2%瓊脂.無機鹽培養基(MS):K2HPO40.4g,KH2PO40.4g,NaCl 0.1g,(NH4)2SO40.04g, MgSO4·7H2O 0.1g,MnSO4·H2O 0.01g, Fe2(SO4)3·H2O 0.01g,NaMoO4·2H2O 0.01g, H2O1000mL,pH7.0.

1.2 實驗方法

1.2.1 辛基酚聚氧乙烯醚高效降解菌的活化 將保存在-80 ℃冰箱中的OPnEO高效降解菌H1、TXBc10、OPQb11、TXBa23取出溶化后,分別接種到50mL LB培養基中,28 ℃、180r/min 振蕩培養14~16h后,挑選部分茁壯的菌落接種到新的LB培養基中培養,重復此步驟2~3次,從而得到生長良好的菌落.

1.2.2 混合菌的構建 將LB培養基中培養24h的菌液離心(10000r/min)后,用生理鹽水(NaCl 0.85%)重懸制成菌懸液,并在600nm下測其光密度,并加入適量無菌生理鹽水調節菌濃度,使4菌株OD600均為1.0左右,然后將濃度一致的4種菌等比例混合,構建不同的混合菌,并將其按4%接種到50mL含500mg/L OPnEO的無機鹽液體培養基中,振蕩培養(28℃、pH7.0、180r/min)7d后取樣,用高效液相色譜法(AGILENT 1100)測定OPnEO含量[23-24],計算OPnEO的降解率.選取降解率最高的混合菌進行后續試驗.

1.2.3 環境因素對混合菌降解效率的影響 通過單因素試驗,分別研究溫度、pH值、底物濃度、接種量、外加碳源和氮源對混合菌降解OPnEO的影響.將混合菌接種到含500mg/L OPnEO的無機鹽液體培養基中,180r/min振蕩培養7d后取樣,并用高效液相色譜法(AGILENT 1100)測定OPnEO含量,計算OPnEO的降解率.標準試驗:接種量為4%、28℃、pH7.0、180r/min、50mL無機鹽培養基反應體系.溫度分別為15、20、25、28、30、35和40℃;pH值分別為5.0、6.0、7.0、8.0、9.0和10.0;底物濃度分別為50、100、200、500、800、1000和1500mg/L;接種量分別為0.5%、1%、2%、4%、8%和10%;外加碳源分別為葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、檸檬酸、乳糖、乙酸鈉、山梨醇、明膠和木糖,外加氮源分別為牛肉膏、尿素、硝酸鉀、胰蛋白胨、硝酸銨、酵母粉、乙酸銨、氯化銨和硫酸銨,添加量均為2%.

1.2.4 L9降解OPnEO的最優條件研究 在單因素試驗的基礎上,采用N=12Placket-Burman 試驗設計研究溫度、pH值、底物濃度、接種量、培養時間、外加碳源和氮源7個因素對混合菌降解OPnEO的影響(表1),每個處理3個重復.根據Plackett-Burman試驗結果,利用最陡爬坡路徑方法確定重要因子的最適濃度范圍[25],并根據最陡爬坡試驗結果進行Box-Behnken試驗設計,利用Design-Expert.8.05b軟件分析最優值.

表1 Placket-Burman試驗因素及水平 Table 1 Plackett-Burman experimental factors and levels

注:Dummy1~4為空白因素.

2 結果與分析

2.1 混合菌降解OPnEO效率

不同混合菌降解OPnEO的效率明顯不同.與單一菌株相比,有些混合菌能在一定程度上提高OPnEO的降解率,另一些混合菌的降解率卻下降.由此可見,單純的把各單菌株簡單的組合在一起,降解效果并不一定都會提高,這可能是菌株間的拮抗作用所致.在所有混合菌組合中,9號混合菌(命名為L9, H1:TXBc10:TXBa23=1:1:1)的降解率最高,為56.44%,比單菌株高8.63%~ 15.44%,選其進行后續試驗.

表2 混合菌降解OPnEO的效率 Table 2 Effect of OPnEO degradation by the mixed bacteria

注:表中"1" 代表接種菌株,"0" 代表未接種菌株.各菌株間等比例投加,總接種量為4%.

2.2 環境因素對L9降解效率的影響

2.2.1 溫度對L9降解效率的影響 由圖1可知,溫度對L9降解OPnEO有顯著性影響.隨著溫度的升高,L9的降解效率先升高后降低.在25~30℃時,L9的降解率較高;當溫度低于25℃或高于30℃時,L9的降解率顯著下降.當溫度為28℃時, L9的降解率最高,為56.24%,分別為15℃和40℃的2倍和4倍,這表明L9與大多數環境微生物對溫度的敏感程度一致,過高或過低的溫度都會嚴重影響菌株體內相關酶的活性,從而導致菌株代謝能力降低、生長受到抑制.

2.2.2 pH值對L9降解率的影響 由圖2可知,pH5~10時L9對OPnEO的降解率出現了較大的起伏.當pH在7~9時, L9對OPnEO具有較高的降解率,且當pH為7.0時,L9對OPnEO降解效果達到最佳,此時OPnEO的降解率為55.68%,故初步判斷最適pH為7.0.而當pH為5或10時,L9對OPnEO的降解能力急劇降低,這與過高或過低的pH值會使微生物體內酶失活,不利于微生物生長繁殖有關.總之,L9適應中性偏弱堿性環境,與大多數微生物對pH的適應范圍基本一致.

2.2.3 底物濃度對L9降解效率的影響 由圖3可知,在OPnEO濃度低于200mg/L時,L9對OPnEO的降解速率隨OPnEO初始濃度的增加而迅速下降,變化十分明顯.說明混合菌L9在低濃度的OPnEO環境中迅速生長,并能有效利用OPnEO;當OPnEO濃度為200~800mg/L時,L9對OPnEO的降解率受濃度的影響不大,降解率基本保持在50%左右,說明L9能夠適應較高OPnEO濃度環境.考慮到L9的實際應用環境和實際應用價值,選擇底物濃度為500mg/L作為后續研究;而當OPnEO濃度高于1000mg/L時,L9對OPnEO的降解率又開始出現大幅下降,到1500mg/L時,降解率下降到31.3%.

2.2.4 接種量對L9降解效率的影響 由圖4可知,接種量對于L9降解OPnEO的影響比較明顯,隨著L9接種量的增加,L9對OPnEO的降解率大幅增加,但并不成簡單線性關系.當接種量達到4%時,此時L9對OPnEO的降解效果達到最佳,降解率為51.8%.再繼續增加接種量, L9的降解效率并沒有明顯增加,反而有少許下降.

2.2.5 外加碳、氮源對L9降解效率的影響 從圖5可知,添加外加碳源對L9降解OPnEO的效果有一定的促進作用,且葡萄糖能有效提高L9對OPnEO的降解,其次蔗糖、麥芽糖和乙酸鈉也對L9的降解效果有一定促進作用.而檸檬酸和乳糖的存在則會抑制L9對OPnEO的降解效果,這可能與菌株體內酶活受到影響有關.從圖6中可以看出,胰蛋白胨能提高L9對OPnEO的降解能力,且有機氮源對L9降解能力的促進作用均高于無機氮源.

2.3 響應面法優化L9降解性能

2.3.1 PB試驗設計結果分析 運用Design- Expert.8.05b軟件進行數據處理分析,結果如表3和表4所示.從表3中可以看出,試驗組3對OPnEO的降解率最高,達到60.83%;試驗組9的降解率最低,僅有11.22%.將試驗數據采用Design-Expert.8.05b軟件分析后,可得方程為

=40.91+0.972-1.183+4.575-1.596- 6.027-0.888+11.1910

式中,2為葡萄糖含量,%3為OPnEO濃度,mg/L5為L9接種量,%;6為胰蛋白胨含量,%;7為溫度,℃;8為培養時間,d;10為初始pH.得到模型的為0.0042,表明所得回歸方程顯著,即該模型在研究的整個回歸區域擬合性很好;復相關系數2=0.9765,表明相關性比較好;校正決定系數Adj2=0.9355,表明93.55%的試驗數據的變異性可用此回歸模型來解釋;通常情況下變化系數(v)越低,試驗的精確度和可信度越高,v值等于9.00%,表明此PB試驗的精確度和可信度較好;精密度指有效信號和噪聲的比值,大于4.0即視為合理,在本試驗精密度為16.508,遠大于4.0.從回歸分析結果表4可知,L9的接種量(L9菌懸液與培養液體積比)、溫度以及初始pH值對L9降解OPnEO的效率存在顯著影響,其中初始pH的值最小(=0.0005),說明其對L9降解OPnEO的效率影響最顯著,其次是溫度(=0.0048),再次為L9的接種量(=0.0127).而其他4個因素,葡萄糖濃度、OPnEO濃度、胰蛋白胨濃度以及培養時間的值均大于0.05,對L9降解OPnEO的效率沒有明顯影響.由此可知,初始pH、溫度和L9的接種量為影響L9降解OPnEO效率的關鍵因素.

表3 Placket-Burman試驗設計與結果 Table 3 Design and its response value of Plackett- Burman experiment

注:1~11含義同表1.

表4 Placket-Burman試驗分析結果 Table 4 Analytic result of Plackett-Burman experiment

注:1~11含義同表1.

2.3.2 最陡爬坡試驗結果與分析 根據Placket-Burman 試驗篩選出的3個顯著因素估計系數的正負效應,依次增大或減小,其他因素根據單因素試驗結果分別取最佳值,設計最陡爬坡試驗.結果如表5所示,隨著L9接種量、初始pH的增加和溫度的減小,L9對OPnEO的降解率呈現先增大后減小的趨勢.當L9接種量為4%,初始pH為7.0,溫度為28℃時,L9對OPnEO的降解效率達到最大.因此,序號3的試驗為最大響應值區域,故以此為中心點進行后續響應面分析.

表5 最陡爬坡試驗設計及結果 Table 5 Experimental design and results of steepest ascent

2.3.3 響應面分析法確定最佳降解條件 通過最陡爬坡試驗確定3個顯著因子的最適范圍后,以L9接種量4%、溫度28℃、初始pH值7.0為中心點實施響應面分析,各因素水平見表6.以OPnEO降解率為響應值,設計3因素3水平的Box-Behnken試驗,試驗設計及結果見表7和表8.

表6 Box-Behnken 設計因子及水平 Table 6 Factors and levels of Box-Behnken design

運用Design Expert 軟件對17個試驗點的響應面值進行回歸分析,得二次多項式方程

=61.29+0.97+2.03+4.52-0.84+0.33+

0.89-2.812-5.342-9.262

式中:為OPnEO降解率;、、分別為L9接種量、溫度、初始pH的編碼值.相關系數2= 0.9530,說明方程的擬合度比較好,可以用該方程進行試驗結果預測.

表7 Box-Behnken 試驗設計及結果 Table 7 Box-Behnken experimental design and result

運用Design-Expert.8.05b軟件對該模型進行回歸方差分析和顯著性檢驗,得到模型值為0.0007,遠小于0.01,表明該模型極顯著,即該模型在被研究的整個回歸區域擬合性很好;模型的變異系數(v)為4.39%,說明模型的精密度較好,試驗的可信度較高.結合響應面分析3維圖(圖7),可直觀的看出各因素之間的交互作用,表明響應值與各因素間并不是簡單的線性關系,且響應值存在1極值點.

分析表8數據可知,3個顯著因子對響應值的影響排序為:初始pH值()>溫度()>L9接種量().其中,、2對的影響差異極顯著,、2和2對的影響高度顯著,而、、和對的影響不顯著.

對模型構建的方程進行偏導微分處理,得到方程的3個解:=4.16,=28.20,=7.13,即:L9接種量4.16%、溫度28.20℃、初始pH7.13.此時,L9對OPnEO降解率達到最大預測值,為62.15%.

2.3.4 驗證試驗 由模型可知,三個顯著因素L9接種量4.16%、溫度28.20℃、初始pH7.13時,L9對OPnEO降解率達到最大預測值62.15%.為驗證模型預測結果的準確性和有效性,按照優化后的OPnEO降解條件進行搖瓶試驗,重復試驗3次.結果顯示,實際檢測OPnEO的降解率分別為61.95%、60.81%、61.02%,平均值為61.26%,與預測值62.15%接近,兩者之間具有良好的擬合性,表明該模型能比較真實的預測各因素對L9降解OPnEO的影響.同時,與未優化試驗組之前結果比較發現,優化后的最佳降解條件可使L9對OPnEO的降解率提高4.82%.

3 討論

雖然在多數領域中高效混合菌的作用已得到肯定,部分成果也已經在實踐中得到應用[27-30],但在降解表面活性劑,特別是OPnEO污染的研究報道尚不多見.故本實驗選擇在前期已篩選的H1、TXBc10、OPQb11、TXBa23四株辛基酚聚氧乙烯醚(OPnEO)高效降解菌的基礎上,采用等比混合的方式構建混合菌.結果發現,混合菌對OPnEO的降解效果并不一定都比單菌株高,甚至有些混合菌比各單菌株的降解率還低,這與何麗媛等[31]的研究結果相一致.由此可見,如果只是簡單的把能利用同一底物的單菌株組合在一起,不一定會取得理想的效果.這是由于當前對于具有協同作用關系的混菌篩選還停留在一個隨機的過程上,對混合菌體系中各菌間相互關系和作用機理缺乏深入研究,從而不能有效地協調各菌株之間的關系,使其達到最佳水平,發揮最大效應.上述問題都嚴重地阻礙了混合菌的發展和實際應用.

因此,從生理、代謝和遺傳角度深入研究菌株間的關系和協同作用機理,對提高混合菌的穩定性和協同作用效率具有重要作用.在此基礎上引入一些新興的生物技術,如利用細胞融合技術和基因工程技術把具有互利協同關系的微生物構建工程菌,可使其既具有混菌培養的功能,又擁有純培養菌株營養要求單一、易于調控、生理代謝穩定等優點;采用固定化微生物技術固定高效優勢混合菌,以使其可多次重復使用,降低成本,增加效率,提高環境耐受能力,這些都對混合菌的理論發展和實際應用有重要意義.

4 結論

4.1 通過對四菌株(H1、TXBc10、OPQb11和TXBa23)進行等比例組合實驗,獲得了一組高效降解OPnEO的混合菌L9(H1:TXBc10:TXBa23= 1:1:1),其在總接種量4%,28℃,pH7.0,180r/min培養7d對初始濃度為500mg/L的OPnEO降解率達到56.44%,比降解效果最好的單一菌株(表1試驗組15TXBa23,47.81%)提高了8.63%.

4.2 運用單因素試驗考察了影響混合菌L9降解的相關因素,初步確定混合菌L9降解OPnEO的最適外加碳源和氮源分別是葡萄糖和胰蛋白胨,最適pH值7.0,最適溫度28℃,最適接種量4%.應用響應面法分析,確定混合菌L9的最優降解條件為50mL反應體系中接種量4.16%、溫度28.20℃、初始pH值7.13、葡萄糖濃度2%、胰蛋白胨濃度2%、OPnEO初始濃度500mg/L、180r/min培養7d,該條件下混合菌L9對OPnEO的降解率達62.15%,通過驗證實驗實際檢測的平均值為61.26%,比未優化條件下提高了4.82%.

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* 責任作者, 副教授, 1227677453@qq.com

Construction of mixed flora effective degrading octylphenyl polyethoxylates (OPnEO) and optimization of degrading conditions using response surface method

LIU Wen-bin, ZHANG Hai-tao, YANG Hai-jun*, LIU Ya-bin, XU Yun-hai

(College of Plant Protection ,Hunan Agricultural University, Changsha 410128, China)., 2016,36(8)：2444~2452

In order to heighten the biodegradation effect of the non-ionic surfactant octyl phenol ethoxylates (Octylphenyl polyethoxylates, OPnEO) in the laboratory, four mixed degradation bacteria (H1, TXBc10, OPQb11, TXBa23) were screened to degrade OPnEO. The construction of OPnEO mixed flora centers on the degradation effects of four bacterial strain of different ratios on OPnEO. The degradation rate of hybrid strain L9 (H1: TXBc10: TXBa23 1: 1: 1) to OPnEO reached 56.44% (highest), slightly higher than the degradation effect of each single strain. The factors related to degradation efficiency of L9were optimized as follows: optimum carbon and nitrogen sources were sucrose and tryptone, respectively; optimum initial pH value was 7.0, the optimum temperature was 28℃; optimum inoculation amount was 4%. To further the degradation rate, three significant factors affecting the degradation OPnEO were screened in Plackett-Burman experimental design: L9mixed bacteria inoculation, temperature, and initial pH value. Then steepest ascent approached the maximum response area of the three significant factors. Using Box-Behnken experimental design and response surface analysis, the optimal conditions for the degradation of OPnEO by mixed bacteria L9were confirmed as follows: inoculation 4.16%, temperature 28.20℃, initial pH value 7.13, sucrose concentration 500mg/L, tryptone concentration 500mg/L, OPnEO initial concentration of 500mg/L,180r/min cultured 7d. Under these conditions, the degradation rate of OPnEO by L9reached 62.15%, about 5% higher than non-optimized OPnEO of experimental conditions. These results can effectively solve the current problem of environmental pollution such as tanning, washing, pesticides and other industries caused by OPnEO, and will offer new ideas to the study of other types of biodegradable surfactants pollutants.

octylphenyl polyethoxylates (OPnEO)；mixed flora；response surface methodology；biodegradation

X172

A

1000-6923(2016)08-2444-09

劉文斌(1990-),男,湖南益陽人,湖南農業大學微生物學專業碩士研究生,主要研究方向為環境污染與治理.

2016-01-18

湖南省自然科學基金(2015JJ2079);長沙市科技計劃(K1403022-31)