瑞香狼毒內生真菌的分離與鑒定

王　歡，路　浩，郭亞洲，馮　柯，耿朋帥，趙寶玉

(西北農林科技大學動物醫學院，楊凌 712100)

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瑞香狼毒內生真菌的分離與鑒定

王歡，路浩，郭亞洲，馮柯，耿朋帥，趙寶玉*

(西北農林科技大學動物醫學院，楊凌 712100)

為探明瑞香狼毒(Stellerachamaejasme)內生真菌的種類及其種屬分布特點，進一步揭示瑞香狼毒內生真菌與毒性物質合成、化感作用以及抗逆性形成之間的相互關系，作者對采自4省5個地區瑞香狼毒的莖、葉、花部位進行內生真菌的分離和純化，通過形態學和分子生物學方法鑒定種屬。結果表明，瑞香狼毒中共分離到21株內生真菌，19株菌分屬7綱8目9科8 屬，2株未鑒定種屬，所有從瑞香狼毒分離到的內生真菌中鏈格孢屬(Alternariasp.)8株，占總分離菌株的42%，為瑞香狼毒的優勢菌株，除1株糞殼菌綱(Sordariomycetessp.)和8株鏈格孢屬(Alternariasp.)外，其余菌屬均首次從瑞香狼毒中分離得到。

瑞香狼毒；內生真菌；分離；鑒定

瑞香狼毒(StelleraChamaejasme)俗稱斷腸草、饅頭花、紅火柴頭等，屬瑞香科狼毒屬多年生草本植物，在中國主要分布于東北、華北、西北及西南的草甸草地、典型草地、高寒草地以及荒漠草地[1]。一般情況下，在適度放牧的草地，瑞香狼毒在草地植物群落中以偶見種或伴生種存在，而在放牧過度的退化草地常成為優勢種。瑞香狼毒全草有毒，其主要毒性成分為黃酮類化合物，如狼毒素、異狼毒素等，人接觸后會發生過敏性皮炎，家畜誤食后產生腹痛、腹瀉、臥地不起、全身痙攣等癥狀，嚴重時虛脫或驚厥死亡[2]。宋曉平等[3]用瑞香狼毒中的黃酮類化合物對小鼠進行急性攻毒試驗，發現小鼠肝、腎和心肌等發生不同程度的病變。

植物內生真菌是一定階段或全部階段寄生于健康植物器官和組織內部的真菌，普遍存在各種植物中。植物內生真菌能夠產生多種次級代謝產物，包括抗生素、殺蟲劑、植物生長調節劑[4]和抗腫瘤化合物等多種活性物質。有學者從銀杏、杜仲等植物中分離到了多種能產生黃酮類化合物的內生真菌[5-6]。雖然楊國棟[7]和H.Jin[8]等從瑞香狼毒中分離得到了一些子囊菌門和擔子菌門的內生真菌，但有關瑞香狼毒內生真菌的種屬分布特點及其多樣性研究還鮮有開展。而且如前所述，瑞香狼毒的主要化學毒性成分也是黃酮類化合物，但是這些黃酮類化合物是由瑞香狼毒自體產生，還是其內部(與銀杏和杜仲等植物相似)也具有產黃酮類化合物的內生真菌，目前尚未見報道。據此，作者對采自不同地區的瑞香狼毒內生真菌進行分離鑒定，旨在闡明瑞香狼毒內生真菌的種類及其種屬分布特點，以期為進一步探究瑞香狼毒中所含黃酮類化合物的生成與其內生真菌種屬之間的關系，以及瑞香狼毒的化感毒性和抗逆性研究提供實驗基礎和理論依據。

1　材料與方法

1.1試驗材料

1.1.1植物材料瑞香狼毒植物樣品2015年6—8月間采自甘肅肅南縣、甘肅天祝縣、青海門源縣、山西陽城縣和陜西旬邑縣，樣品采集地信息見表1。現場采集的瑞香狼毒樣品放在裝有變色硅膠的自封袋中保存備用。

表1瑞香狼毒植物材料信息與內生真菌分離結果

Table 1Plants information ofStellerachamaejasmeand isolation results of endophytic fungi

地點Location地理位置Geographicsites海拔Latitude分離部位Planttissue菌株編號Isolatesnumber甘肅肅南縣Sunan,GansuN38°29',E100°24'2500m莖,葉,花Stem,leaf,flowerSC1L1-1,SC1L6-1,SC3S6-1,SC4L3-1,C5F2-1甘肅天?？hTianzhu,GansuN36°58',E103°07'2600m莖StemSC5S1-1青海門源縣Menyuan,QinghaiN37°57',E101°24'2700m葉,花Leaf,flowerSC6F3-1,SC6F5-1,SC6L3-1,SC8L3-1山西陽城縣Yangcheng,ShanxiN3520',E112°13'1680m葉LeafSY1L2-1,SC16L4-1,SC16L5-1陜西旬邑縣Xunyi,ShaanxiN3503',E108°32'1690m莖,葉,花Stem,leaf,flowerSC10L2-1,SC12S1-1,SC13L2-1,SC13L5-1,SC13L5-2,SC13F1-1,SC13S1-1,SC15L2-1

1.1.2培養基PDA雙抗培養基：馬鈴薯200 g·L-1，葡萄糖20 g·L-1，瓊脂10 g·L-1、20 g·L-1。滅菌后的PDA培養基按100 IU·mL-1分別加入青霉素和鏈霉素。

1.1.3試劑與儀器設備75%酒精，次氯酸鈉溶液，CTAB提取液，氯仿，異戊醇，無水乙醇，TAE(Tris，Na2EDTA·2H2O，乙酸)，瓊脂糖，2×Taq Master Mix(赫特生物技術公司)，10×Loading buffer(TaKaRa)，VL2000 marker(TaKaRa)，真菌特異性引物ITS1和ITS4，ITS1序列：CCGTAGGTGAACCTGCGG，ITS4序列：TCCTCCGCTTATTGATATGC(南京金斯瑞)，冰箱(新飛 BCD-213KA)，電熱恒溫培養箱(天津泰斯特DH4000A，精宏)，超凈工作臺(AIR TECH)，冷凍離心機(SIGMA 3K15)，PCR儀(Bio-Rad)，全自動凝膠成像系統(SYNGENE)。

1.2方法

1.2.1內生真菌的分離采用組織塊表面消毒法進行瑞香狼毒內生真菌的分離[9-10]。具體方法如下：將瑞香狼毒植物樣品用自來水反復沖洗干凈，用滅菌蒸餾水浸泡，至植物組織水飽和復原。選擇75%酒精和2%次氯酸鈉作為表面消毒劑，用75%酒精處理30～60 s，滅菌蒸餾水漂洗2次，2%次氯酸鈉處理1.5～3 min，滅菌蒸餾水漂洗3次。消毒后的植物用剪刀剪成5 mm×5 mm×5 mm的組織塊，置于培養基上培養7～15 d，培養溫度28 ℃，每2 d觀察一次，觀察植物組織創口邊緣是否有菌絲生長。試驗中需設立3個對照，以保證所分到的真菌屬于植物內生真菌。一是超凈工作臺無菌檢測，選擇一含有培養基的平皿，分離過程中將其敞口放于工作臺。二是組織塊表面無菌檢測，將表面消毒過的樣品不經剪切放置在PDA培養基上。三是滅菌蒸餾水無菌檢測，將最后一次漂洗樣品的蒸餾水均勻涂抹在PDA培養基上。將以上3個培養皿與放置組織塊的平皿同時置于培養箱進行培養，3個培養皿中均無真菌生長則說明分離出來的是瑞香狼毒內生真菌。

1.2.2內生真菌的純化與保存組織塊邊緣有菌絲生長時，用接種針挑取邊緣菌絲接種至新的PDA培養基，待菌落生長至一定大小，重復以上操作2次，直至得到純化的內生真菌。將純化的內生真菌接種至PDA斜面培養基，置于培養箱中，28 ℃進行培養，待真菌長滿斜面后，取出放于冰箱，4 ℃保存。每3個月對試管中的內生真菌進行活化，將試管中的真菌接種至PDA培養基，培養到一定大小，再次進行菌種保存。

1.2.3內生真菌的鑒定結合傳統的形態學鑒定方法與分子生物學鑒定方法對瑞香狼毒內生真菌進行鑒定[11]。

1.2.3.1形態學鑒定：觀察PDA培養基上生長的菌落，記錄真菌生長的快慢，菌落的形狀，菌絲的形態，有無色素產生等。采用插片培養法，在真菌生長的對數期，在菌落邊緣以45°斜插蓋玻片，使菌絲沿蓋玻片生長直至覆蓋整個蓋玻片，取出蓋玻片，顯微鏡下觀察菌絲的顏色，孢子形態，產孢結構以及是否有橫隔。結合菌落形態和菌絲顯微形態，參照《真菌鑒定手冊》對分離出的內生真菌進行初步鑒定。

1.2.3.2分子生物學鑒定：基于rDNA-ITS區的序列多態性確定內生真菌的種屬[12]?；驹硎翘崛≌婢腄NA，通過聚合酶鏈式反應擴增ITS1、5.8S rDNA和ITS2區，瓊脂糖凝膠電泳檢測目的片段，出現500 bp左右的條帶即為陽性，說明目的片段擴增成功。

內生真菌總DNA的提?。翰捎酶牧嫉腃TAB法提取內生真菌的總DNA[13]。真菌鋪滿PDA培養基后，取得菌絲并稱重，取50 g用于提取DNA。將菌絲放于1.5 mL離心管，加入液氮充分研磨，研磨后的菌絲中加入60 μL CTAB提取液(65 ℃預熱)，離心管使用封口膜封口，放于水浴鍋中，65 ℃加熱45～60 min，間隔搖晃3次。加入600 μL氯仿和異戊醇混合液(576∶24)，搖晃均勻后，12 000 r·min-1離心5 min，取離心后的上清液，重復以上步驟，直至兩相間澄清。吸取最后一次離心的上清液至2 mL的離心管中，加入900 μL無水乙醇與60 μL 3 mol·L-1乙酸鈉(pH=6)，混勻后放于冰箱-20 ℃，沉淀1 h以上或過夜。12 000 r·min-1離心5 min，棄上清。沉淀用無水乙醇(-20 ℃預冷)清洗2～3次，揮干乙醇。加適量ddH2O溶解沉淀，放于冰箱-20 ℃保存。

目的片段的擴增：選擇ITS1(5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′)和ITS4(5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′)真菌特異性引物，擴增真菌核糖體RNA基因的ITS1、5.8S rDNA和ITS2區。取5 μL PCR擴增產物進行瓊脂糖凝膠電泳，使用成像系統觀察結果并拍照，將陽性結果測序(上海桑尼生物科技有限公司)。

1.2.3.3系統發育樹構建：測序結果提交至美國國家生物技術信息中心(National Center of Biotechnology Information，NCBI)的BLAST子網，尋找具有同源性的序列，將所測序列與同源性高的序列使用軟件Mega5.1進行序列對齊，進而使用鄰接法(Neighbor-joining)構建系統發育樹，自展法檢測發育樹，分析發育樹以確定真菌種屬。

2　結　果

2.1瑞香狼毒內生真菌的分離

從來自4省5個地區的瑞香狼毒中進行瑞香狼毒莖、葉、花三個部位內生真菌的分離，通過形態學觀察，根據各菌株菌落形態特征，將疑似同種屬的菌株合并，合并后的菌株共有21株，其中葉中分離到的最多，共13株，其余有4株來自莖，4株來自花(表1)。

2.2瑞香狼毒內生真菌的鑒定

觀察記錄21株真菌的菌落形態，是否產生色素，菌絲顯微形態(表2，圖1)，初步鑒定SCL6-1、SC16L5-1、SC15L2-1、SC13S1-1、SC13L5-1、SC13L2-1、SC12S1-1、SC10L2-1共8株菌屬于鏈格孢屬，其余各菌株形態差異大，通過分析5.8S rDNA-ITS區序列進行分子生物學鑒定。除未鑒定的2株菌，瑞香狼毒中分離的其余19株菌分屬于真菌的擔子菌亞門，半知菌亞門，子囊菌門的子囊菌亞門和盤菌亞門，共7綱8目9科8 屬。已鑒定的19株菌中，1株僅確定到綱，為子囊菌門盤菌亞門糞殼菌綱(Sordariomycetessp.)，1株確定到科，子囊菌亞門核菌綱炭角菌目毛孢殼科(Coniochaetaceaesp.)。11株菌確定到屬，其中8株是鏈格孢屬(Alternariasp.)，枝孢屬(Cladosporiumsp.)2株，戴氏霉屬(Taifanglaniasp.)1株。6株確定到種，分別是柄孢殼屬Podosporavesticola、核座孢屬Plenodomushendersoniae、光黑殼屬Preussiafuniculata和Preussiaintermedia、球蓋菇屬Leratiomyceslaetissimus、莖點霉屬Phomamoricola。由圖2可見，鏈格孢屬(Alternariasp.)是瑞香狼毒內生真菌的優勢菌屬，其余菌屬的菌株數目相當，均為1～2個。瑞香狼毒中分離出的19株菌株序列已提交至GenBank，登入號信息見表2。

表2瑞香狼毒內生真菌形態學特征、種屬和GenBank登入號

Table 2Morphological characteristics，genus and species and accession number of endophytic fungi fromStellerachamaejasme

菌株編號Strainnumber種屬Genusandspecies登入號Accessionnumber形態學特征MorphologicalcharacteristicsSC1L1-1Cladosporiumsp.KT235907菌絲綠色、質密、匍狀生長,菌落中間凸四周扁平,背面菌落綠色、邊緣白色、全圓,生長速度3.3mm·d-1Green,compacthyphaecreep.Thecolonyisprotuberantinthemiddleandflataround.Thecolonylooksgreen,whiteintheedgefromthebackandshowsawholecir-cle.Growthrateis3.3mm·d-1SC1L6-1,SC10L2-1,SC12S1-1,SC13L2-1,SC13S1-1,SC13L5-1,SC15L2-1,SC16L5-1Alternariasp.KT235908菌絲綠色、質密、匍狀生長,菌落中間凸四周扁平,背面菌落白色、邊緣黑色、全圓,生長速度11mm·d-1Green,compacthyphaecreep.Thecolonyisprotuberantinthemiddleandflataround.Thecolonylooksgreen,blackintheedgefromthebackandshowsawholecir-cle.Growthrateis11mm·d-1SC3S6-1PreussiaintermediaKT235913菌絲白色、質密、匍狀生長,菌落扁平,背面菌落黃色、鋸齒狀、邊緣白色泛黃,生長速度0.075mm·d-1Green,compacthyphaecreep.Thecolonyisflat.Thecol-onylooksyellow,whitewithyellowintheedgeandserra-tedfromtheback.Growthrateis0.075mm·d-1SC4L3-1PodosporavesticolaKT235909菌絲米白、質密、匍狀生長,菌落中間凸四周扁平,背面菌落白色、全圓、邊緣白色泛淺綠,生長速度0.33mm·d-1Beige,compacthyphaecreep.Thecolonyisprotuberantinthemiddleandflataround.Thecolonylookswhite,whitewithlightgreenintheedgeandshowsawholecir-cle.Growthrateis0.33mm·d-1SC5S1-1PlenodomushenersoniaeK235910菌絲白色、質密、輻狀生長,菌落半球形,背面菌落黑色、全圓、邊緣白色,生長速度0.05mm·d-1White,compacthyphaegrowradially.Thecolonyishemi-spheric.Thecolonylooksblack,whiteintheedgeandshowsawholecircle.Growthrateis0.05mm·d-1SC5F2-1LeratiomyceslaetissimusKT235914菌絲白色、質密、匍狀,菌落不規則圓形,背面菌落白色、不規則圓形,生長速度0.02mm·d-1White,compacthyphaecreep.Thecolonyisirregularcir-cle.Thecolonylookswhiteinthebackandshowsanir-regularcircle.Growthrateis0.02mm·d-1

(轉下頁 Carried forward)

圖1　瑞香狼毒內生真菌菌落與菌絲形態(400×)Fig.1 Hyphae and Colony characteristics of endophyic fungi from Stellera chamaejasme (400×)

圖2　鄰接法構建的基于5.8S rDNA-ITS序列的系統發育樹Fig.2　Phylogenetic tree constructed with the programme neighbor-joining based on the 5.8S rDNA-ITS sequences

2.3內生真菌遺傳進化分析

對分離出的19株內生真菌與Blast上具有與其5.8S rDNA-ITS區相似性序列的真菌，以5.8S rDNA-ITS區為對象，通過序列對齊，鄰接法構建系統發育樹，得到圖2所示系統發育樹。分析發育樹可見，瑞香狼毒內生真菌分屬于I、II、III 3大類群，3個類群自展系數均達到99%以上。類群III僅包含1株菌SC5F2-1，且與其他菌株親緣關系較遠。類群II可分為C和D兩個小類群，其中D中的3株菌親緣關系較近，都屬于子囊菌亞門。類群I在3個類群中菌株數量最多，除鏈格孢屬的8株菌外，其余2株菌都屬于半知菌亞門腔孢綱球殼孢目球殼孢科。

3　討　論

雖然H.Jin等[8]從瑞香狼毒中分離到41種，其中40個屬于子囊菌門，1個屬于擔子菌門，楊國棟[7]對分離自瑞香狼毒的68株內生真菌進行鑒定，發現其分屬于10個屬(群)。但有關瑞香狼毒內生真菌種屬多樣性及其分布特點的研究還鮮有報道。本試驗中從瑞香狼毒中共分離到21株內生真菌，優勢菌屬為鏈格孢屬(Alternariasp.)，與H.Jin和楊國棟等的報道一致，有10種是從瑞香狼毒中首次分離到的最新菌屬。作者選擇了采自4省5個地區的瑞香狼毒進行內生真菌的分離，其中甘肅肅南縣分離到內生真菌Cladosporiumsp.、Alternariasp.、Preussiaintermedia、Podosporavesticola和Leratiomyceslaetissimus，甘肅天?？h分離到Plenodomushenersoniae，青海門源分離到Coniochaetaceaesp. 和Sordariomycetessp.，山西陽城分離到Taifanglaniasp.、Phomamoricola和Alternariasp.，陜西旬邑分離到Preussiafuniculata。不同地區分離到的內生真菌，除鏈格孢屬(Alternariasp.)從采自甘肅肅南和山西陽城的瑞香狼毒中都分離到，其余內生真菌在5個地區分布的種類各不相同，這可能是由于不同地區瑞香狼毒中的內生真菌種類存在差異，說明瑞香狼毒內生真菌的種屬分布有區域特異性。試驗選擇的2種瓊脂比例的PDA培養基上分離出的瑞香狼毒內生真菌種類數目相差不多，10 g·L-1的培養基上分離到11株，瓊脂比例為20 g·L-1時，分離到10株，但瓊脂量少時，組織塊上長出內生真菌的時間為3～10 d，而瓊脂量大時，得到內生真菌的時間稍微有所增加，為7～15 d。試驗表明在進行瑞香狼毒內生真菌分離時，選擇瓊脂為10 g·L-1的培養基分離效率比瓊脂為20 g·L-1的要高。李姝諾等[14]從越橘中分離到能產生黃酮的細鏈格孢(Alternaria.tenuissima)，產生的黃酮類化合物具有與植物成分相似的結構。本試驗從瑞香狼毒中分離到了其優勢內生真菌——鏈格孢屬(Alternariasp.)，但其是否能產生狼毒素等黃酮類化合物尚有待進一步研究。

4　結　論

從采自4省5地區的瑞香狼毒中共分離到21株菌，屬于7綱8目9科8 屬，分別是Cladosporiumsp.，Alternariasp.，Preussiaintermedia，Podosporavesticola，Plenodomushenersoniae，Leratiomyceslaetissimus，Coniochaetaceaesp.，Pyrenophorateres，Sordariomycetessp.，Preussiafuniculata，鏈格孢屬(Alternariasp.)是瑞香狼毒內生真菌的優勢菌屬。

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(編輯白永平)

Isolation and Identification of Endophytic fungi fromStellerachamaejasme

WANG Huan，LU Hao，GUO Ya-zhou，FENG Ke，GENG Peng-shuai，ZHAO Bao-yu*

(CollegeofVeterinaryMedicine，NorthwestA&FUniversity，Yangling712100，China)

To explore the classes and distribution characteristics of endophytic fungi inStellerachamaejasmeand further explain the connection between fungal endophytes and the toxin synthetism，allelopathy and stress resistance formation，the endopytic fungi in the stems，leaves and flowers ofStellerachamaejasmewere isolated，purified and identified through morphological and molecular methods.Among 21 isolates obtained fromStellerachamaejasme，19 strains were identified to belong to 8 genera，9 families，8 orders and 7 classes，and 2 strains were unidentified.Eight strains of fungi were identified asAlternariasp.，and take 42% of all strains isolated and were the dominant fungal.Except for 1Sordariomycetessp.and 8Alternariasp.，other species were all first isolated fromStellerachamaejasme.

Stellerachamaejasme；endophytic fungi；isolation；identification

10.11843/j.issn.0366-6964.2016.08.022

2016-01-22

農業部“十二五”公益性行業(農業)科研專項(201203062)

王歡(1990- )，女，山西運城人，碩士生，主要從事動物中毒病與毒理學研究，E-mail: wah2318@163.com

趙寶玉(1964-)，E-mail:zhaobaoyu12005@163.com

S859.87

A

0366-6964(2016)08-1696-08