熱應激造成奶牛乳腺上皮細胞損傷并影響乳合成相關載體的基因表達

權素玉，張源淑，卜登攀

(1.南京農業大學農業部動物生理生化重點開放實驗室，南京 210095； 2.中國農業科學院北京畜牧獸醫研究所，動物營養學國家重點實驗室，北京 100193； 3.CAAS-ICRAF農用林業與可持續畜牧業聯合實驗室，北京 100193； 4.東北農業大學 食品安全與營養協同創新中心，哈爾濱 150030)

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熱應激造成奶牛乳腺上皮細胞損傷并影響乳合成相關載體的基因表達

權素玉1，2，張源淑1*，卜登攀2，3，4*

(1.南京農業大學農業部動物生理生化重點開放實驗室，南京 210095； 2.中國農業科學院北京畜牧獸醫研究所，動物營養學國家重點實驗室，北京 100193； 3.CAAS-ICRAF農用林業與可持續畜牧業聯合實驗室，北京 100193； 4.東北農業大學 食品安全與營養協同創新中心，哈爾濱 150030)

本試驗以奶牛乳腺上皮細胞為模型，旨在尋找熱應激下調奶牛泌乳功能的相關因素。42 ℃高溫處理奶牛乳腺上皮細胞0、0.5、1、1.5、2、4、8 及12 h，檢測其對細胞活率，線粒體膜電位，熱休克分子及蛋白基因、氧化應激相關基因以及氨基酸和葡萄糖轉運載體基因表達的影響。結果顯示，不同時間熱處理顯著降低乳腺上皮細胞活率(P<0.05)，損傷細胞線粒體膜電位。HSP27基因表達顯著下降(P<0.05)，HSP70基因表達顯著上調(P<0.05)，HSP90基因表達在前4 h顯著上調(P<0.05)，后恢復至正常水平，HSF-1基因表達在某些時間點顯著上調(P<0.05)。氧化應激相關基因Keach樣環氧氯丙烷相關蛋白-1 (Keap1)表達無顯著變化 (P>0.05)，核因子E2相關因子2 (Nrf2) 表達顯著上調(P<0.05)，NAD(P)H脫氫酶醌-1 (NQO1) 表達顯著上調(P<0.05)?？缒ぐ被徂D運載體SLC7A7基因表達在1 h和4 h顯著上調(P<0.05)。葡萄糖轉運載體GLUT1及GLUT8基因表達顯著下調(P<0.05)。葡萄糖轉運載體GLUT12在熱處理0～2 h表達顯著上調，4～12 h顯著下調(P<0.05)。熱應激能夠顯著降低奶牛乳腺上皮細胞活率，引起氧化應激，改變熱休克蛋白和分子及跨膜轉運載體的基因表達。

熱應激；牛乳腺上皮細胞；細胞活力；線粒體膜電位；氧化應激；熱休克蛋白；跨膜轉運載體

熱應激(Heat stress)可簡單定義為動物機體自身產生的熱量或者從外界吸收的熱量不能充分散發出去時，機體為了維持體溫平衡時的一種狀態[1]。已有研究證實，周圍環境溫度過高引起的熱應激不利于奶牛的泌乳、生長和繁殖，其對乳制品行業產生的經濟損失尤為嚴重[2]。熱應激不僅顯著降低乳產量，而且對乳品質也有很大的影響，基于熱應激的強度和持續時間不同，其對乳糖含量[3-4]、乳脂含量[5]、乳蛋白含量的影響也不一致，并且熱應激可能影響乳蛋白的合成機制，尤其是β-酪蛋白的合成[6]。

奶牛乳腺上皮細胞對高溫(42 ℃)產生快速應激反應，以熱休克轉錄因子HSF(Heat shock transcription factor，HSF) 和熱休克蛋白HSP(Heat shock protein，HSP) 基因表達顯著改變為標志[7]。Keap1-Nrf2-ARE信號通路介導的II相解毒酶和抗氧化基因的轉錄是細胞抗氧化機制中最重要的通路[8]，熱應激可造成細胞氧化應激損傷，上調Keap1-Nrf2-ARE信號通路及其下游基因HO-1和NQO1的表達[9]。

氨基酸和葡萄糖分別是乳蛋白及乳糖合成的主要前體物，血液中的氨基酸和葡萄糖必須通過特殊的轉運系統進入乳腺上皮細胞后才能用于乳蛋白和乳糖的合成，這些轉運系統包括氨基酸轉運載體SLC1家族、SLC7家族、SLC38家族，SLC43家族及葡萄糖轉運載體(Glucose transporter，GLUT) SLC2家族等[10]。目前，雖然鑒定出的氨基酸轉運載體數量與日俱增，但其在機體生長發育及乳腺上皮細胞泌乳中的功能研究較少，胡菡等[7]研究發現，高溫(42 ℃)處理顯著影響奶牛乳腺上皮細胞乳脂肪和乳蛋白合成相關基因mRNA的表達豐度。

本試驗采用奶牛乳腺上皮細胞為模型，通過42 ℃高溫引起熱應激，探討熱應激對細胞活率，熱休克蛋白、跨膜氨基酸轉運載體、葡萄糖轉運載體基因表達的影響，為尋找熱應激降低奶牛乳腺上皮細胞泌乳功能的機制提供參考。

1　材料與方法

1.1儀器和試劑

3111型 CO2培養箱(Thermo，美國)，D-37520離心機(Thermo，美國)，4F00318倒 置 顯 微 鏡(Olympus，日本)，NanoDrop1000(Thermo，美國)，TC10細胞計數儀(Bio-Rad，美國)，EV Eleeh酶標儀(Thermo，美國)，IQ5 熒光定量 PCR 儀(Bio-Rad，美國) 等。

DMEM/F12 培養基(Gibco，美國)，FBS(Gibco，美國)，胰酶(碧云天生物技術研究所，中國)，RNeasy Plus Universal Mini Kit (QIAGEN，德國)，Prime ScriptTMRT reagent Kit With gDNA Erase (TaKaRa，日本)，噻唑藍(MTT，Sigma，美國)、 二甲基亞砜(DMSO，Sigma，美國)，線粒體膜電位檢測試劑盒(碧云天，中國)等。

1.2方法

1.2.1細胞培養及試驗設計原代奶牛乳腺上皮細胞由東北農業大學乳品科學教育部重點實驗室提供。細胞培養參照H.Hu等[11]的方法。具體如下：細胞培養于含10% FBS 的DMEM/F12 培養基中，培養條件為5% CO2，對照組38 ℃，高溫應激組42 ℃。

用培養基懸浮凍存的奶牛乳腺上皮細胞，38 ℃培養3代使其穩定。胰酶消化細胞后以1×104個·mL-1的密度接種到中號培養皿，每皿5 mL細胞懸液。于倒置顯微鏡觀察，待細胞生長至80%～90%后轉移至42 ℃分別培養0.5、1、1.5、2、4、8、12 h，以38 ℃培養條件為對照，每個處理3個重復。1.2.2細胞活率檢測MTT法檢測。將生長旺盛的牛乳腺上皮細胞鋪于96孔板，細胞懸液密度為1×105個·mL-1，每孔200 μL，在接種孔的四周每孔加入200 μL培養基，防止“邊緣效應”。于38 ℃培養，通過倒置顯微鏡觀察，待細胞基本長滿時，置于42 ℃分別培養0、0.5、1、1.5、2、4、8、12 h后加入含0.5 mg·mL-1的MTT培養基，于38 ℃孵育4 h。棄去孔中培養基，每孔加入150 μL DMSO，37 ℃ 孵育10 min，分別于570 nm，630 nm測其吸光度。每個處理3個重復。細胞活率按如下公式計算[12]：

細胞活率(%)=(熱處理組OD570 nm-熱處理組OD630 nm)/(對照組OD570 nm-對照組OD630 nm)×100/%。

1.2.3線粒體膜電位檢測JC-1是理想的檢測細胞線粒體膜電位熒光探針，當細胞線粒體膜電位較高時，JC-1聚集在線粒體基質中形成聚合物，產生紅色熒光，當膜電位較低時，JC-1為單體，產生綠色熒光，我們用紅綠熒光的比例來衡量線粒體膜電位的變化。以38℃培養的細胞作為陰性對照組，42 ℃培養1.5 h的細胞作為試驗組(細胞活率檢測結果可知，1.5 h熱應激細胞活率最低，細胞損傷最嚴重)，CCCP誘導線粒體膜電位下降的細胞為陽性對照組，檢測熱應激1.5 h對細胞線粒體膜電位的損傷。

1.2.4細胞相關基因Real-time PCR 檢測細胞總RNA提?。翰捎?RNeasy Plus Universal Mini Kit(QIAGEN，Germany) 提取細胞RNA，所提取RAN用紫外分光光度計Nanodrop 測定濃度，并將其濃度調整至500 ng·μL-1，用于后續反轉錄。

反轉錄：采用Prime ScriptTMRT reagent Kit With gDNA Erase (TaKaRa，Japan) 試劑盒進行反轉錄。反轉錄總體系為10 μL。反應條件：37 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s，4 ℃保存，獲得cDNA，-20 ℃保存備用。

引物合成：HSF-1、HSP27、HSP70、HSP90、RPS9引物序列參見參考文獻[13]。GLUT1、GLUT8、GLUT12引物序列參見參考文獻[14]，Keap1、Nrf2、HO-1、NQO1基因分別參見參考文獻[15]和[16]，SLC7A5、SLC7A7、SLC38A2、SLC43A1 的擴增引物由Primer Premier 5.0 設計。所有引物由北京華大基因公司合成，詳見表1。

采用ABI 7500 PCR儀進行qRT-PCR 反應，20 μL反應體系中：SYBR Premix Ex TaqⅡ(Tli RNaseH Plus)10 μL，PCR Forward primer 0.8 μL，PCR Reverse primer 0.8 μL，cDNA 2 μL，RNase-free H2O，6 μL，ROX Reference DyeⅡ，0.4 μL。反應條件：第1階段：95 ℃ 30 s，1 個循環；第2階段：95℃ 5 s，60℃ 34 s，40個循環，然后完成熔解曲線。

以核糖體蛋白R9(RPS9)[12]作為內參基因，2-ΔΔCT[15]法對奶牛乳腺上皮細胞熱休克因子HSF-1，熱休克蛋白HSP27、HSP70、HSP90，抗氧化基因Keap1、Nrf2、NQO1，葡萄糖轉運載體GLUT1、GLUT8、GLUT12，跨膜氨基酸轉運載體SLC7A5、SLC7A7、SLC38A2、SLC43A1基因表達進行相對定量分析。

1.2.5數據統計與分析數據經Excel初步整理后，以SPSS 17.0 軟件進行單因素方差分析(one-way ANOVA)，之后進行Duncan 氏多重比較，結果用“平均值±標準差(mean±SD)”表示，顯著水平為P<0.05。

2　結　果

2.1不同時間熱處理對奶牛乳腺上皮細胞活率的影響

不同時間熱處理對細胞活率的影響結果見圖1。由圖1可知，不同時間熱處理均顯著降低了細胞活率。在0～1.5 h細胞活率持續降低，于2 h后開始恢復。推測熱應激2 h后細胞逐漸適應高溫環境，存活率短期內不再下降。

2.2熱應激對細胞線粒體膜電位的影響

熱應激對細胞線粒體膜電位的影響見圖2。圖2中A為陰性對照組，B為熱應激組，C為陽性對照組，可看出陰性對照組主要顯示紅色熒光，表明細胞線粒體膜電位較高，熱應激組綠色熒光多于陰性對照組，表明細胞線粒體膜電位降低，細胞損傷，陽性對照組細胞幾乎全部損傷，顯示綠色熒光。

2.3不同時間熱處理對熱休克因子(HSF-1)及熱休克蛋白(HSPs)基因表達的影響

不同時間熱處理對熱休克因子(HSF-1)及熱

表1引物信息

Table 1The information of primer designed

基因GeneGenBank序列號GenBankaccessionNo.引物序列(5'-3')PrimersequenceHSF-1NM_001076809F:AAAGATCCCCCTGATGCTGAACGACR:CAGTTCGGTGATGTCGGAGATGATGHSP27BT021550F:CGGACGCACCAGACCAGCCAGCATR:GGCTGTGGGCCGGATACCAGTCGCGHSP70X53827F:CTGAACCCGCAGAACACGR:CCTTGGTCTCCCCTTTGTHSP90NM_001079637F:CCAAGTCTGGCACTAAAGR:GAAGACTCCCAAGCATACSCLC7A5NM_174613.2F:GCTCGTCTTCGCCACCTACCR:GCCTTCACGCTGTAACAGTTCASLC7A7NM_001075151.1F:CATGGCGTTGATCTATTTGTR:CCTGTTGGGCTCCTTCCSLC43A1NM_001206598.1F:TGAGACGGATGACCTGAAGCR:GGTGGTCTGACGGACTTGGSLC38A2NM_001082424.1F:AAGCCATTATGCCGATGTR:GGATTCCACTGCCCACARPS9DT860044F:CCTCGACCAAGAGCTGAAGR:CCTCCAGACCTCACGTTTGTTCGLUT1NM_174602F:GTGCTCCTGGTTCTGTTCTTCAR:GCCAGAAGCAATCTCATCGAAGLUT8NM_201528F:AGTGACTGCCCGTCCTTGCTR:TGCTGTCCTGGCTCCTGACTGLUT12NM_00101168F:AAGATGCTGCCCACCTACGR:TCGCTTCCCATTCCTCACAKeap1NM_001101142.1F:TCACCAGGGAAGGATCTACGR:AGCGGCTCAACAGGTACAGTNrf2NM_001011678F:CCCAGTCTTCACTGCTCCTCR:TCAGCCAGCTTGTCATTTTGHO-1NM_001014912F:AGACTTGGCTCCCACCAAR:AGGTGCCTGGGAGAGGACNQO1NM_001034535F:CGGAATAAGAAGGCAGTGCTR:CCATGGATACCATGCAGAGA

圖1　不同時間熱處理對細胞活力的影響Fig.1　Effects of different heat treatment time on cell vitality

A.陰性對照；B.熱應激組；C.陽性對照組A.Negative control group；B.Heat stress group；C.Positive control group圖2　熱應激對細胞線粒體膜電位的影響 200×Fig.2　Effects of heat stress on cell mitochondrial membrane potential 200×

休克蛋白(HSPs)基因表達的影響見表2。由表2可知，隨著熱應激時間延長，HSP27表達量持續并顯著降低(P<0.05)。HSP70的基因表達顯著上升，2 h其表達量達到峰值(P<0.05)。HSP90在0.5～4 h一直維持較高水平的表達量(P<0.05)，8 h回落到基礎水平。HSF-1在熱應激情況下基因表達升高顯著(P<0.05)。

表2不同時間熱處理對熱休克因子及熱休克蛋白基因表達的影響

Table 2Effects of different heat treatment time on the gene expression of heat shock factor and heat shock protein

項目Item處理時間/hTreatmenttime00.511.524812HSP271.00±0.12a0.50±0.13c0.35±0.04c0.49±0.13c0.53±0.28b0.35±0.06c0.38±0.09c0.28±0.09cHSP701.01±0.15d57.80±4.48c133.89±13.33b156.22±19.53ab188.86±31.89a74.62±21.27c14.68±7.03d59.27±55.26cHSP901.01±0.17b1.82±0.16a1.87±0.15a1.95±0.27a1.75±0.49a2.07±0.14a1.07±0.28b0.72±0.05bHSF-11.03±0.28c3.18±1.29ab3.38±0.59ab1.81±0.13bc3.36±0.10ab2.39±1.01ab1.13±0.15c3.30±0.53ab

同行數據肩標無字母或相同字母表示差異不顯著(P>0.05)，不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。下表同

Values in the same row with the same or no small letter superscripts mean no significant difference (P>0.05)，while with different small letter superscripts mean significant difference (P<0.05).The same as below

2.4不同時間熱處理對抗氧化基因表達的影響

不同時間熱處理對抗氧化基因表達的影響見表3。由表3可知，Keap1基因在熱應激條件下表達量無顯著差異(P>0.05)。Nrf2基因表達顯著上調，在高溫2 h表達量最高，隨后開始下調，至8 h回落到基礎水平(P<0.05)。NQO1基因表達顯著上調，在高溫1 h表達量最高(P<0.05)，隨后開始下降，但在高溫12 h內始終高于基礎水平。

表3不同時間熱處理對抗氧化基因表達的影響

Table 3Effects of different heat treatment time on the gene expression of antioxidant

項目Item處理時間/hTreatmenttime00.511.524812Keap11.01±0.210.77±0.070.83±0.070.84±0.171.07±0.200.76±0.000.84±0.081.13±0.71Nrf21.01±0.18c1.10±0.34c1.11±0.16bc1.28±0.52bc2.59±0.67a1.70±0.28b0.91±0.16c1.35±0.34bcNQO11.06±0.46c2.01±0.40ab2.36±0.29a1.56±0.10bc1.45±0.23bc1.56±0.06bc1.42±0.60bc1.40±0.60bc

2.5不同時間熱處理對跨膜氨基酸轉運載體基因表達的影響

不同時間熱處理對跨膜氨基酸轉運載體基因表達的影響見表4。由表4可知，高溫處理顯著降低跨膜氨基酸轉運載體SLC7A5基因的表達(P<0.05)，SLC7A7基因在1 h及4 h表達量顯著升高(P<0.05)。SLC38A2及SLC43A2基因表達在熱應激條件下無顯著差異(P>0.05)。

表4不同時間熱處理對氨基酸轉運載體基因表達的影響

Table 4Effects of different heat treatment time on the gene expression of transmembrane amino acid transporters

項目Item處理時間/hTreatmenttime00.511.524812SLC7A51.00±0.10a0.86±0.06b0.70±0.07c0.56±0.03d0.51±0.17d0.55±0.02d0.15±0.04e0.11±0.00eSLC7A71.01±0.20c1.07±0.09c1.12±0.14b0.91±0.02c0.73±0.15c1.66±0.69a0.75±0.10c0.73±0.02cSLC38A21.00±0.071.96±1.581.34±0.864.03±3.143.67±0.112.95±0.503.29±0.942.67±0.39SLC43A21.00±0.081.13±0.021.38±0.341.49±0.011.40±1.051.09±0.281.31±0.181.67±0.16

2.6不同時間熱處理對葡萄糖轉運載體基因表達的影響

不同時間熱處理對葡萄糖轉運載體基因表達的影響見表5。由表5可知，GLUT1基因在熱應激4～12 h表達量均顯著下調(P<0.05)。GLUT8基因從0.5 h即開始顯著下調，至8～12 h表達量達到最低(P<0.05)。GLUT12基因表達在0.5～2 h顯著上調，4～12 h顯著下調(P<0.05)。

表5不同時間熱處理對葡萄糖轉運載體基因表達的影響

Table 5Effects of different heat treatment time on the gene expression of glucose transporters

項目Item處理時間/hTreatmenttime00.511.524812GLUT11.01±0.20a0.86±0.19ac0.92±0.11a0.87±0.21ab0.73±0.24ad0.59±0.15bcde0.41±0.18e0.41±0.12eGLUT81.01±0.19a0.49±0.21cde0.49±0.20ce0.49±0.10bde0.85±0.04ab0.58±0.24bc0.19±0.13f0.22±0.03defGLUT121.01±0.17cdf1.61±0.06bc1.82±0.24b2.52±0.91a1.75±0.37b0.60±0.19de0.18±0.13e0.39±0.11def

3　討　論

細胞暴露于高溫環境會引起細胞功能一系列異?，F象，包括廣泛的蛋白合成抑制、蛋白結構和功能的改變、細胞骨架重排造成的細胞形態學變化、代謝轉變、細胞膜流動性的改變以及細胞增殖受阻[17]。L.Li等[[18]將奶牛乳腺上皮細胞于40.5 ℃高溫水浴制造熱應激，30 min后于37 ℃恢復3～24 h，表明細胞活率在6 h達到最低，而后逐漸開始增加，于18～24 h恢復到正常水平。胡菡等[7]將奶牛乳腺上皮細胞置于42 ℃高溫成功制造了熱應激模型，本試驗參照其方法，將奶牛乳腺上皮細胞置于42 ℃高溫，復制熱應激模型。結果顯示，在0～1.5 h細胞活率持續降低，于2 h后開始恢復，但均顯著低于正常水平，說明熱應激2 h后細胞逐漸適應高溫環境，存活率短期內不再下降。J.Du等[19]通過40 ℃ 1 h成功制造了奶牛乳腺上皮細胞熱應激模型，表明高熱可通過降低線粒體膜電位觸發細胞凋亡及壞死途徑。本試驗證明，高溫1.5 h可降低細胞線粒體膜電位，后者觸發的細胞凋亡途徑可能是導致細胞活率顯著降低的重要原因。

細胞熱應激反應是一個高度保守的蛋白激活和基因表達改變級聯反應，該網絡中的基因表達受到HSF的調節[20]。HSF家族普遍存在于真菌、果蠅、禽類、人類等多種生物體內，且具有廣泛的同源性，被證明是細胞溫度升高的最重要的第一反應物[21]，轉錄因子與細胞對熱應激的反應相協同，影響包括HSP在內的一系列基因的表達[22]。奶牛HSF1基因定位于14號染色體，由525個氨基酸組成，包括DNA結合域、三聚區域、調節域和轉錄活化域4部分[23]。HSP是在各種應激條件下產生的分子伴侶，在細胞保護中的中心作用體現在其對抗高溫引起的循環休克和腦缺血[24]。

泌乳期奶牛對高溫尤其敏感，R.J.Collier等[25]以奶牛乳腺上皮細胞為模型證明，在高溫開始階段(42 ℃)，牛乳腺上皮細胞形態發生變化(導管分支退化)，細胞生長減弱，隨后，基因轉錄與蛋白合成及細胞代謝下降，在這一模型系統中，HSP70基因維持了4 h的高表達，8 h后恢復基礎水平，標志著耐熱信號的終止和凋亡相關基因的激活。隨后，R.J.Collier等[26]明確提出提高或者延長熱休克應答能夠改善細胞對高溫的耐受能力。與此相一致，K.Dokladny等[27]發現MDCK上皮細胞過表達HSP70同樣可以提高熱耐受。本試驗證明，42 ℃高溫處理可顯著提高HSP70的基因表達，并在2 h其表達量達到峰值，隨后表達量逐漸降低，但始終顯著高于基礎水平。HSP90在0.5～4 h一直維持較高水平的表達量，8～12 h回落到基礎水平。HSP27隨著熱應激時間延長，其表達量顯著降低。HSF-1在熱應激情況下基因表達總體升高。HSP70在1～2 h之內表達量升高至百倍，HSP90在1～4 h表達量增加1倍左右，而細胞活率在1.5～2 h后不再降低，說明隨著高溫時間延長，其耐熱能力增強，細胞死亡率降低，推測HSP70和HSP90高表達提高了細胞對于高溫的耐受能力。胡菡等[7]的試驗中，熱應激0～24 h 對HSP27基因的表達無顯著影響，而本試驗中HSP27隨熱應激延長表達量持續下降，可能是由于所選用細胞代數不同，其對高溫的耐受程度不同所造成，但其降低的具體原因還有待深入研究。

熱應激會引起動物體溫上升，體溫升高會影響機體內代謝酶的活性，使機體代謝率升高，高代謝率會增加自由基的產生，自由基會和許多生物大分子反應，如脂質蛋白質和核酸，過多的自由基會打破機體氧化和抗氧化的平衡系統，造成脂質的過氧化，引起蛋白質和DNA的損傷，導致氧化應激的產生[28]。宋小珍等[29]研究發現，熱應激導致肉牛機體產生了明顯的氧化損傷。Nrf2是調控氧化應激基因表達的關鍵轉錄因子，正常生理條件下，Keap1與Nrf2相互結合，抑制Nrf2從胞漿進入胞核內激活下游ARE信號。當細胞發生氧化應激時，Keap1與Nrf2解偶聯，Nrf2轉移入核內，與基因中的小Maf 蛋白結合成異二聚體后識別并結合ARE，啟動下游抗氧化蛋白基因的轉錄，提高細胞抗氧化能力[30]。本試驗發現，Nrf2及下游抗氧化基因NQO1隨著熱應激時間延長，其表達量均有不同程度的升高，推測高溫造成了奶牛乳腺上皮細胞氧化應激，激活了Keap1-Nrf2-ARE信號通路，使抗氧化基因表達上調。

AA通過幾種特殊的轉運系統進入乳腺上皮細胞，1985年，C.R.Baumrucker 初步闡明了奶牛乳腺組織中的氨基酸轉運載體(Amino acid transporters，AATs) 的功能特性[31]。1998年，基于離子依賴性和底物特異性，至少已鑒定出6個氨基酸轉運系統，包括Na+依賴性的A、ASC、XAG，N系統和非Na+依賴性的L和y+系統[32]，形成了6個溶質載體(Solute carrier，SLC)基因超家族：SLC1、SLC6、SLC7、SLC36、SLC38及SLC43家族及一個單羧酸轉運蛋白SLC16。特定的氨基酸轉運載體不僅能夠跨膜運輸氨基酸，而且這些氨基酸轉運載體能夠通過mTORC1影響蛋白代謝[33]。某些氨基酸轉運載體還具有“轉運感受器(Transceptors)” 的功能，它位于胞內信號上游，能夠感受細胞內外氨基酸濃度。J.Pinilla等[34]研究顯示，降低細胞氨基酸供給，氨基酸結合到中性氨基酸轉運載體SNAT2時，或者氨基酸流經過SNAT2時，可改變SNAT2的構象，從而觸發激活mTORC1的層疊信號。因此，氨基酸轉運載體在介導氨基酸與mTORC1信號通路及調控蛋白代謝過程中起了重要作用。

SLC7A5編碼的氨基酸轉運載體LAT1，與SLC3A2編碼的4F2hc載體(CD98)相結合形成的雙向轉運異二聚體可將苯丙氨酸、酪氨酸、精氨酸、亮氨酸以及色氨酸等長鏈氨基酸轉運入胞內，同時將谷氨酰胺轉運出細胞，該雙向轉運過程為氨基酸激活mTOR通路的限速步驟[35]，mTOR通路可進一步調控乳蛋白合成過程。中性氨基酸轉運載體SNAT2由SLC38A2編碼，近期研究表明，SNAT2與LAT1-CD98相偶聯，亮氨酸濃度增加后可通過該偶聯激活mTOR通路[36]。SLC7A7編碼的轉運載體可將陽離子氨基酸及一些長鏈氨基酸轉運到胞外，該基因缺乏可導致賴氨酸尿性蛋白不耐受[6]。本試驗顯示，熱應激可顯著下調奶牛乳腺上皮細胞SLC7A5基因表達。SLC7A7基因表達在42 ℃高溫1.5 h及4 h表達量顯著高于對照組。SLC38A2和SLC43A1基因表達受高熱處理后基因表達無顯著差異 。該結果表明，奶牛乳腺上皮細胞各個家族氨基酸轉運載體受高熱處理后基因表達變化不一致，推測熱應激條件下奶牛乳腺上皮細胞通過影響跨膜氨基酸轉運載體基因表達改變其對血液中游離氨基酸的攝取進而改變乳蛋白的合成。

葡萄糖是乳糖合成的重要前體物，是乳中的重要固形物，能夠滲透性調節乳產量[37]。葡萄糖轉運載體(GLUTs)是廣泛存在于哺乳動物細胞膜上的一類功能性蛋白，其主要作用為跨膜運輸細胞內外的葡萄糖，其中，GLUT1是乳腺組織中最重要的葡萄糖轉運載體，其對于乳腺組織乳糖的合成有重要的意義[13]。懷孕后期至泌乳前期GLUT1、GLUT8、GLUT12基因表達增加5倍到數百倍不等，表明其對乳腺發育及泌乳的維持必不可少[38]。本試驗表明，熱應激可不同程度降低GLUT1和GLUT8基因的表達量，GLUT12基因表達在熱應激0～2 h表達量顯著升高，4～12 h顯著降低。乳腺上皮細胞轉染試驗顯示，GLUT1和GLUT12表達增加可顯著上調SLC1A5、SLC3A2、SLC7A5的基因表達[39]，表明乳腺上皮細胞葡萄糖轉運載體表達可影響跨膜氨基酸轉運載體的表達。熱應激條件下跨膜氨基酸及葡萄糖轉運載體基因表達的改變可能與高溫造成細胞膜流動性改變，細胞膜重新排列有關[40]，但其具體機制目前尚不明確。

4　結　論

夏季高溫持續時間過久引起的熱應激給奶牛業造成了巨大的經濟損失，尤其嚴重地影響了奶牛的泌乳性能。本試驗以奶牛乳腺上皮細胞為模型，證明熱應激可顯著降低細胞活率，引起細胞氧化應激。HSF-1分子及HSPs對熱應激反應敏感，可能提高細胞的耐熱能力?？缒ぐ被徂D運載體及葡萄糖轉運載體基因表達也發生了改變，推測熱應激條件下乳糖及乳蛋白合成下調與跨膜氨基酸及葡萄糖轉運載體基因表達有關。

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(編輯郭云雁)

Heat Stress-induced Cell Injury and Effects on the Gene Expression of Milk Synthesis-related Transporters in Dairy Cow

QUAN Su-yu1，2，ZHANG Yuan-shu1*，BU Deng-pan2，3，4*

(1.TheAnimalPhysiologyandBiochemistryLaboratoryoftheMinistryofAgriculture，NanjingAgricultureUniversity，Nanjing210095，China；2.StateKeyLaboratoryofAnimalNutrition，InstituteofAnimalScience，ChineseAcademyofAgriculturalSciences，Beijing100193，China；3.CAAS-ICRAFJointLaboratoryonAgroforestryandSustainableAnimalHusbandry，Beijing100193，China；4.SynergeticInnovationCenterofFoodSafetyandNutrition，NortheastAgriculturalUniversity，Harbin150030，China)

Bovine mammary epithelial cell was chosen as the model to find the factors impairing lactation performance of dairy cow during heat stress.Cell vitality，mitochondrial membrane potential and the expression of genes related to heat shock molecule and proteins，oxidative stress，amino acids and glucose transporters were detected in the bovine mammary epithelial cells treated for 0，0.5，1，1.5，2，4，8 and 12 h at 42 ℃，respectively.The result showed that different heat treatment time significantly reduced mammary epithelial cell vitality (P<0.05) and damaged mitochondrial membrane potential.The expression ofHSP27 decreased significantly (P<0.05)，whileHSP70 increased significantly (P<0.05).The expression ofHSP90 increased significantly in 0-4 h (P<0.05)，and returned to normal level after then.The expression ofHSF-1 increased significantly in some time points (P<0.05).The gene expression of Keach like ECH-associated protein-1 (Keap1) showed no significant difference(P>0.05)，while nuclear factor-E2-related factor 2 (Nrf2) and NAD (P) H dehydrogenase quinone-1 (NQO1) increased significantly (P<0.05).The gene expression of transmembrane amino acid transporterSLC7A7 increased significantly in 1 h and 4 h(P<0.05).The gene expression of glucose transportersGLUT1 andGLUT8 decreased significantly (P<0.05).The expression of glucose transporterGLUT12 increased significantly during 0-2 h，and decreased significantly during 4-12 h (P<0.05).In conclusion，heat stress could significantly reduce the cell vitality，cause oxidative stress，change the gene expression of heat shock proteins and molecule and membrane transport carriers.

heat stress；bovine mammary epithelial cell；cell vitality；mitochondrial membrane potential；oxidative stress；heat shock protein；membrane transport carriers

10.11843/j.issn.0366-6964.2016.08.023

2015-09-23

國家自然科學基金(31372341)；“十二五”科技支撐計劃(2012BAD12B02-5)；中國農業科學院科技創新工程(ASTIP-IAS07)

權素玉(1989-)，女，河北平山人，碩士生，主要從事反芻動物營養研究， E-mail:1203457176@qq.com

張源淑，教授，E-mail:zhangyuanshu@sina.com；卜登攀，研究員，E-mail:budengpan@126.com

S852.23

A

0366-6964(2016)08-1704-10