中藥復方子宮灌注液中鹽酸小檗堿和丹酚酸B的質量控制

高媛媛,陳　穎,鐘留情,任美美,許清慧,張世佳,范云鵬,麻武仁,宋曉平

(西北農林科技大學動物醫學院中獸醫藥研究所,陜西楊凌712100)

中藥復方子宮灌注液中鹽酸小檗堿和丹酚酸B的質量控制

高媛媛,陳穎,鐘留情,任美美,許清慧,張世佳,范云鵬,麻武仁,宋曉平

(西北農林科技大學動物醫學院中獸醫藥研究所,陜西楊凌712100)

為了建立中藥復方子宮灌注液的質量標準,采用薄層色譜法(TLC)對其中的黃連和丹參進行定性鑒別,并采用高效液相色譜(HPLC)法測定黃連中鹽酸小檗堿和丹參中丹酚酸B的含量.結果:薄層色譜斑點清晰,陰性對照無干擾;鹽酸小檗堿含量測定的線性方程為Y=38553X-89683(r=0.9998),進樣量在4.1616～83.232 μg/mL濃度范圍內具有良好線性關系,平均回收率為98.59%,RSD為0.70%;丹酚酸B含量測定的線性方程為Y=1X107X-80303(r=0.9999),進樣量在0.02952～1.476 mg/mL濃度范圍內具有良好線性關系,平均回收率為98.60%,RSD為1.86%;結論:該方法簡便易行,專屬性強,重復性好,可用于該制劑的質量控制.

中藥子宮灌注液;鹽酸小檗堿;丹酚酸B;質量控制

奶牛子宮內膜炎是奶牛養殖業中普遍存在的一種繁殖障礙性疾病,嚴重危害奶牛業的發展.奶牛子宮內膜炎主要用抗菌藥物和激素治療,這些藥物的長期使用,不僅容易導致病原耐藥性,而且易在牛奶中殘留,嚴重威脅人類健康.中藥具有資源豐富、毒副作用小、不產生耐藥性和殘留少的優點,在子宮內膜炎治療方面具有潛在應用前景.中藥復方子宮灌注液由黃連、連翹、丹參和紅花經水煎而成,具有清熱燥濕和活血化瘀之功效[1],臨床上治療奶牛急性子宮內膜炎效果顯著[2].本試驗采用薄層色譜法對其中的黃連和丹參進行鑒別,采用高效液相色譜法測定鹽酸小檗堿和丹酚酸B的含量,旨在為該中藥復方子宮灌注液的質量控制及進一步應用提供科學依據.

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1主要試藥與試劑黃連對照藥材(批號:120913-201310),鹽酸小檗堿對照品(含量86.7%,批號:110713-201212),丹酚酸B對照品(含量97%,批號:111562-201212),均購自中國食品藥品檢定研究院.黃連、丹參藥材,均購自西安市萬壽路藥材批發市場.中藥復方子宮灌注液為本實驗室自制.乙腈(色譜純,批號:1210042),甲醇(色譜純,批號: 1210058),美國;其他試劑均為分析純.

1.1.2主要儀器Waters高效液相色譜系統,美國Waters公司.

1.2方法

1.2.1中藥復方灌注液中黃連和丹參的鑒別

(1)黃連及對照溶液的制備:取3個批次的中藥灌注液各2 mL,加無水甲醇5 mL,混勻,濾過,取濾液作為樣品溶液[3],并制備不含黃連的灌注液陰性樣品溶液;取黃連藥材粉末0.25 g,加甲醇25 mL,超聲處理30 min,濾過,取濾液作為黃連藥材溶液;取黃連對照藥材0.25 g,同法制成對照藥材溶液,另取鹽酸小檗堿對照品,加甲醇制成每1 mL含0.5 mg的溶液,作為對照品溶液;(2)丹參及其對照溶液的制備:取3個批次的中藥灌注液各10 mL,加10 mL水、1 mL稀鹽酸,搖勻,過濾,濾液中加入20 mL乙酸乙酯,振搖提取,分取乙酸乙酯層,蒸干,殘渣中加入4 mL甲醇使溶解,作為樣品溶液[9],并制備不含丹參的灌注液陰性樣品溶液;取丹參藥材粉末0.2 g,加75%甲醇25 mL,加熱回流1 h,濾過,濾液濃縮至1 mL,作為丹參藥材溶液,另取丹酚酸B對照品,加75%甲醇制成每1 mL含2 mg的溶液,作為對照品溶液;(3)黃連的薄層色譜檢測:分別吸取鹽酸小檗堿對照品溶液、黃連對照藥材溶液、黃連藥材溶液、樣品溶液、陰性樣品溶液各1 μL,分別點于同一高效硅膠G薄層板上,以環己烷-乙酸乙酯-異丙醇-甲醇-水-三乙胺(3∶3.5∶1∶1.5∶0.5∶1)為展開劑,置于濃氨試液預飽和20 min的展開缸內,展開,取出,晾干,置紫外光燈(365 nm)下檢視[4];(4)丹參的薄層色譜鑒別:分別吸取丹酚酸B對照品溶液、樣品溶液、陰性樣品溶液各1 μL,丹參藥材溶液0.5 μL,分別點于同一硅膠GF254薄層板上,以甲苯-乙酸乙酯-甲酸(5∶6∶1)為展開劑中,展開,取出,晾干,置紫外光燈(254 nm)下檢視[5].

1.2.2中藥復方灌注液中鹽酸小檗堿和丹酚酸B的含量測定(1)色譜條件:色譜柱均為Diamon?sil C18(5 μm,150X4.6 nm),流速為1 mL/min,柱溫為30℃,進樣量為10 μL.鹽酸小檗堿以乙腈-0.05 mol/L磷酸二氫鉀溶液(50∶50)(每100 mL中加十二烷基硫酸鈉0.4 g,再以磷酸調節pH值4.0)為流動相,檢測波長為345 nm;丹酚酸B以甲醇-乙腈-甲酸-水(30∶10∶1∶59)為流動相,檢測波長為286 nm;(2)對照品溶液的制備:精密稱取鹽酸小檗堿對照品0.0060 g,加甲醇制成每1 mL含208.08 μg的溶液;或精密稱取丹酚酸B對照品0.0274 g,加75%甲醇制成每1 mL含1.476 mg的溶液;(3)樣品溶液的制備:取中藥灌注液2 mL于具塞錐形瓶中,精密加入甲醇-鹽酸(100∶1)的混合溶液50 mL,密塞,稱重,超聲處理30 min,放冷,再稱重,用甲醇補足減失的重量,搖勻,濾過,精密量取續濾液5 mL于10 mL量瓶中,甲醇定容,搖勻,濾過,取續濾液,即得鹽酸小檗堿樣品溶液[8].另取中藥灌注液2 mL于具塞錐形瓶中,精密加入75%甲醇50 mL,稱重,加熱回流1 h,放冷,再稱重,用75%甲醇補足減失的重量,搖勻,濾過,取續濾液,即得丹酚酸B樣品溶液[8];(4)陰性樣品溶液的制備:按處方比例分別稱取不含黃連或不含丹參的其他藥材,依照中藥灌注液的生產工藝制成陰性灌注液,再分別按樣品溶液的制備方法制成各自的陰性樣品溶液;(5)專屬性試驗:在上述色譜條件下,分別取對照品溶液、陰性樣品溶液和樣品溶液各10 μL,注入液相色譜儀,記錄色譜圖;(6)線性關系考察:分別取鹽酸小檗堿對照品溶液(濃度208.08 μg/mL)0.1,0.2,0.4,0.8,1.6,2 mL于5 mL量瓶中,甲醇定容.另取丹酚酸B對照品溶液(濃度1.476 mg/mL),分別將其稀釋50,25,10,4,2倍和原液.分別精密吸取10 μL注入高效液相色譜儀,分別記錄峰面積.以進樣濃度為橫坐標,峰面積為縱坐標,進行線性回歸;(7)精密度試驗:分別吸取33.29 μg/mL的鹽酸小檗堿對照品溶液或0.369 mg/mL的丹酚酸B對照品溶液各10 μL,連續進樣6次,分別測定峰面積;(8)穩定性試驗:吸取同一樣品溶液10 μL,分別在0、2、4、6、10、24 h測定鹽酸小檗堿或丹酚酸B峰面積;(9)重復性試驗:取同一批樣品,分別制備6份樣品溶液,吸取10 μL,測定鹽酸小檗堿或丹酚酸B峰面積;(10)加樣回收試驗:精密量取已知含量的樣品(鹽酸小檗堿含量497.44 μg/mL) 1 mL,加入鹽酸小檗堿對照品溶液(208.08 μg/ mL)2.4 mL;或精密量取已知含量的樣品(丹酚酸B含量2.8552 mg/mL)1 mL,加入丹酚酸B對照品溶液(1.476 mg/mL)1.9 mL,分別按樣品溶液制備方法制備成溶液后,分別依照上法測定,計算平均回收率;(11)樣品含量測定:取3批樣品,每批取3份,分別按樣品溶液的制備方法制備,精密吸取樣品溶液10 μL,按前述色譜條件測定其中鹽酸小檗堿或丹酚酸B的含量.

2　結果

2.1中藥復方灌注液中黃連和丹參的鑒別在紫外燈下,黃連樣品溶液色譜中,在與黃連對照藥材色譜相應的位置上,顯4個以上相同顏色的熒光斑點;在與鹽酸小檗堿對照品色譜相應的位置上,顯相同顏色的熒光斑點,而陰性樣品溶液在此位置上沒有斑點(圖1).丹參樣品溶液和丹酚酸B對照品溶液在薄層板相應的位置上顯現相同顏色的熒光斑點,而陰性樣品溶液沒有顯示此斑點(圖2).

2.2中藥復方灌注液中鹽酸小檗堿和丹酚酸B的含量測定

2.2.1專屬性試驗樣品溶液色譜峰中鹽酸小檗堿或丹酚酸B與雜質分離完全,分離度均大于1.5,中藥灌注液中其他成分對鹽酸小檗堿或丹酚酸B的測定無干擾(圖3,圖4).

2.2.2線性關系考察鹽酸小檗堿和丹酚酸B含量測定的線性方程分別為Y=38553X-89683(r= 0.9998)和Y=1X107X-80303(r=0.9999),進樣量分別在4.1616～83.232 μg/mL和0.02952～1.476 mg/ mL濃度范圍內,與峰面積具有良好線性關系.

圖1　黃連的薄層色譜鑒別

圖2　丹參的薄層色譜鑒別

圖3　鹽酸小檗堿的高效液相色譜

圖4　丹酚酸B的高效液相色譜

2.2.3精密度、穩定性、重復性試驗鹽酸小檗堿峰面積RSD分別為0.55%,0.26%,0.94%(n=6),丹酚酸B峰面積RSD分別為0.27%,0.48%,1.35%(n=6),表明儀器精密度良好,樣品溶液在24 h內穩定,重復性良好.

2.2.4加樣回收率試驗鹽酸小檗堿和丹酚酸B的平均回收率分別為98.58%和98.60%,RSD分別為0.70%和1.86%(n=6),說明準確度較好.

2.2.5樣品含量測定3批樣品中鹽酸小檗堿的平均含量分別為497.61,497.16,498.70 μg/mL,RSD分別為0.30%,0.26%,0.43%;丹酚酸B的平均含量分別為2.8408,2.8581,2.8498 mg/mL,RSD分別為0.60%,0.45%,0.61%,說明所建立的方法可用于制劑的質量控制.

3　討論

3.1關于中藥復方子宮灌注液中黃連和丹參的鑒別在進行中藥復方制劑的質量控制時,主要藥物成分的薄層色譜鑒別是常用的方法.本試驗參照王丹[3]報道的黃連液樣品的前處理方法,即在中藥復方灌注液中加入甲醇,取濾液,再采用2010年版獸藥典中黃連藥材的薄層色譜鑒別方法進行檢測[4],結果表明,中藥復方灌注液樣品中出現鹽酸小檗堿的特征性斑點,且與其他成分的分離效果良好.在進行丹參鑒別時,參照王雪彥等[5]報道的方法,對中藥復方灌注液中的丹酚酸B進行了提取和富集,并采用2010版獸藥典中丹參藥材丹酚酸B薄層色譜鑒別用展開劑,但分離效果欠佳,遂改用甲苯-乙酸乙酯-甲酸(5∶6∶1)為展開劑[5],中藥復方灌注液樣品中的丹酚酸B與其他成分的分離效果好,紫外燈下檢視,在與丹酚酸B對照品相同的位置處斑點清晰可見,且陰性樣品溶液無干擾.

3.2關于中藥復方子宮灌注液中鹽酸小檗堿和丹酚酸B的含量測定本試驗參照2010年版獸藥典中的黃連和丹參質控成分含量測定方法,對中藥復方灌注液中鹽酸小檗堿和丹酚酸B的含量進行了測定,結果表明,本方法專屬性強,重現性好,穩定準確,可用于該中藥復方灌注液中鹽酸小檗堿和丹酚酸B的含量測定.

[1]智曉艷,崔恩慧,范云鵬,等.14種中藥及其復方的體外抗菌活性[J].西北農業學報,2014,23(7):114-119.

[2]馮偉,張烜明,麻武仁,等.中藥復方灌注液對奶牛急性子宮內膜炎臨床療效觀察[J].動物醫學進展,2015,36(1):131-134.

[3]王丹.黃連液質量標準的研究[J].湖北中醫雜志,2013,35 (2):73-74.

[4]中國獸藥典委員會.中國獸藥典(二部)[S].北京:中國農業出版社,2010.

[5]王雪彥,陳澤蓮,宋毅.參苓胃炎合劑中丹參的薄層鑒別[J].華西藥學雜志,2013,28(6):643-644.

Quality Control of BerberineHydrochlorideand Salvianolic Acid B in Traditional ChineseMedicineCompound UterinePerfusate

GAO Yuan-yuan,CHEN Ying,ZHONG Liu-qing,REN Mei-mei,XU Qing-hui,ZHANG Shi-jia,FAN Yun-peng,MA Wu-ren,SONG Xiao-ping
(Institute of Traditional Chinese Veterinary Medicine,College of Veterinary Medicine,Northwest A&F University,Yangling 712100,China)

To establish the quality standard for traditional Chinese medicine compound uterine perfusate.TLC method was performed to identify Coptidis rhizoma and Salvia miltiorrhiza radix et rhizoma in traditional Chinese medicine compound uterine perfusate,and HPLC was used to determine the content of berberine hydrochloride and salvianolic acid B.The spots of TLC were distinguished and clear and the negative control had no interference.The regression equation for determining berberine hydrochloride was Y=38553X-89683 (r=0.9998),and showed a good liner relationship within the range of 4.1616-83.232 μg/mL.The average recovery rate was 98.59% with RSD of 0.70%.The regression equation for determining salvianolic acid B was Y=1X107X-80303(r=0.9999),and showed a good liner relationship within the range of 0.02952-1.476 mg/mL.The average recovery rate was 98.60%with RSD of 1.86%.The methods are simple and convenient with strong specificity and good repeatability,which could be used for the quality control of this preparation.

Traditional Chinese medicine compound uterine perfusate;Berberine hydrochloride;Salvianolic acid B;Quality control

SONG Xiao-ping

S853.72

A

0529-6005(2016)06-0054-03

2015-04-16

公益性行業(農業)科研專項(201303040);西北農林科技大學大學生創新性實驗計劃項目

高媛媛(1989-),女,碩士,從事中獸藥研發工作,E-mial:gaoyuanyuan312@126.com

宋曉平,E-mial:sxpxbnl@163.com