5種植物提取物對豬致病菌的體外抗菌研究

王定發,周璐麗,周　雄,周漢林

(中國熱帶農業科學院熱帶作物品種資源研究所,海南儋州571737)

5種植物提取物對豬致病菌的體外抗菌研究

王定發,周璐麗,周雄,周漢林

(中國熱帶農業科學院熱帶作物品種資源研究所,海南儋州571737)

本試驗旨在采用氣相色譜-質譜聯機法對5種植物提取物進行成分分析,并采用試管倍比稀釋法研究其對豬大腸桿菌、豬金黃色葡萄球菌的體外抑菌效果.結果表明,5種植物提取物的共有成分和主要成分為洋芹腦、吉馬烯D、β-石竹烯、胡椒酮、α-蒎烯、4-萜烯醇、天然維生素E,且其對豬兩種致病菌均有較好的抑制作用,其中廣西華山蒟提取物殺菌效果最好.結論是5種植物提取物對豬兩種致病菌呈現較好地體外抑殺效果,可能是因為其含有洋芹腦、吉馬烯D、β-石竹烯、胡椒酮等活性抗菌成分所致.

植物提取物;氣相色譜-質譜聯機法;試管倍比稀釋法

目前,在畜禽養殖中抗生素濫用的危害,如易產生耐藥性、藥物殘留以及環境污染等日趨嚴重,開發抗菌效果好、安全低毒、無污染的植物提取物類飼料添加劑來取代或部分替代抗生素的使用迫在眉睫.華山蒟、山蒟、假蒟、毛脈樹胡椒均屬胡椒科(Piperaceae)植物,主要分布于我國熱帶和亞熱帶地區,資源豐富.已有研究報道,山蒟具有殺蟲、抗血小板凝集和抗氧化作用[1-3];假蒟具有解熱、抗炎、降血糖、抗氧化及有效抑制香蕉炭疽病、芒果炭疽病等多種植物病原菌作用[4-8],而關于毛脈樹胡椒和華山蒟藥理作用研究鮮有報道,但這幾種植物同屬于胡椒科屬,且已有記載[9],胡椒科植物可入藥治療風寒感冒、嘔吐腹瀉、食欲不振等癥.本試驗旨在研究5種胡椒科植物提取物對豬金黃色葡萄球菌、豬大腸桿菌的體外抗菌效果,并采用氣相色譜-質譜聯用分析法,初步探討其抗菌活性成分,為其作為飼料添加劑的應用開發提供依據.

1　材料與方法

1.1試驗材料

1.1.1植物提取物制備將新鮮采集的5種植物樣品(廣西華山蒟、廣西山蒟、毛脈樹胡椒、海南假蒟、夏威夷假蒟,均采自中國熱帶農業科學院香料飲料研究所熱帶香料飲料種質圃),烘干,粉碎,用95%乙醇溶劑,75℃,熱回流提取4 h,旋轉蒸發定容至濃度為1 000 mg/mL(按烘干樣原料算得),待用.

1.1.2菌種與培養基豬大腸桿菌(CVCC224)、豬金黃色葡萄球菌(CVCC546)標準菌株,均購自中國獸醫微生物菌種保藏中心;營養肉湯培養基、營養瓊脂培養基、麥康凱培養基、Baird-parker瓊脂基礎培養基,均購自北京奧博星生物技術有限責任公司.

1.2試驗方法

1.2.1GS-MS分析條件氣相色譜DB-5MS毛細管色譜柱(30 mmX0.25 mmX0.25 μm);進樣口溫度150℃,傳輸線溫度:280℃;柱溫升溫程序,60℃保持2 min,然后以5℃/min升溫至280℃,保持10 min;載氣為高純氦氣,柱流量1.0 mL/min;自動進樣0.1 μL,分流比100∶1.

質譜條件:離子源溫度,240℃;電離方式,EI,電子能量70 ev,其他參數為標準自動調諧參數;質量掃描范圍,50～650 μm,溶劑延遲3 min;檢索方式,儀器自動檢索結合人工檢索,依據為NIST標準質譜圖庫.

1.2.2菌懸液的制備及最低殺菌濃度(minimal bacteriocidal concentration,MBC)測定將2種菌株分別接種到已加有2 mL滅菌營養肉湯試管中進行純培養活化,再分別配制成10X105CFU/mL試驗菌液.

取68支滅菌試管,分為2組,每組34支,依次編號.用試管倍比稀釋法,每支試管加入1 mL滅菌營養肉湯,再將1 mL 5種提取物溶液(1 g/mL)分別加入到每組第1支試管中,再從每組第1管吸取1 mL混合溶液至第2支試管,依次類推,直到第8管,從第8管中棄掉1 mL混合液.第9管為陽性對照,第10管為陰性對照.以上各管中分別加入1 mL 10X 105CFU/mL試驗菌液,陰性對照加入1 mL滅菌營養肉湯.混勻,將上述試管37℃培養48 h,將含有豬大腸桿菌、豬金黃色葡萄球菌的試管培養物分別接種到麥康凱培養基、Baird-Parker瓊脂基礎培養基平板上,37℃培養24 h,觀察有無細菌生長,以無菌生長平板對應的試管內提取物濃度為該菌株的最低殺菌濃度(MBC).

2　結果與分析

2.1氣質成分分析結果5種植物提取物共分離鑒定出20多種化合物,按峰面積歸一化法計算各成分的相對百分含量,結果見表1.

2.2對兩種致病菌的殺菌效果由表2可知,5種植物提取物對豬大腸桿菌的最低殺菌濃度為廣西華山蒟(31.25 mg/mL)<毛脈樹胡椒=廣西山蒟=海南假蒟=夏威夷假蒟(125 mg/mL);對豬金黃色葡萄球菌的最低殺菌濃度為廣西華山蒟(7.80 mg/mL)<毛脈樹胡椒(15.60 mg/mL)<廣西山蒟=海南假蒟=夏威夷假蒟(62.50 mg/mL).

3　討論與結論

經氣質分析,從5種植物提取物中共鑒定出22個成分,洋芹腦(40.25%～49.42%)、吉馬烯D (10.63%～13.28%)、β-石竹烯(8.23%～12.84%)、胡椒酮(4.35%～5.52%)、α-蒎烯(2.97%～3.86%)、4-萜烯醇(1.46%～2.00%)、天然維生素E(0.03%～0.36%)是它們的共有成分和主要成分.研究表明,洋芹腦具有抑菌消炎作用,其對副球孢子菌具有一定的抑制效果[10];胡椒酮具有平喘、止咳、祛痰、消炎作用,對慢性支氣管炎的臨床癥狀有較顯著的改善作用[11];石竹烯具有局部麻醉作用和治療結腸炎的作用[12].本試驗中,5種提取物對豬兩種致病菌均呈現較好地體外抑殺效果,可能與這些主要成分的藥理作用有關,其中廣西華山蒟的體外抑殺效果最好,其原因需待進一步研究.

表1　5種提取物化學成分分析結果

表2　不同濃度提取物的殺菌效果

王道平等[13]采用頂空固相微萃取法提取新鮮假蒟揮發油,并鑒定出48種化合物,其中主要化學成分為ɑ-月桂烯、ɑ-水芹烯、檸檬烯、芳樟醇,宋艷平等[14]采用水蒸氣蒸餾法提取假蒟精油,并鑒定出60多種化合物,其中主要含有2,4,5-三甲氧基-1-丙烯基苯、順-石竹烯、1,2-二甲氧基-4-(1-丙烯基)苯、細辛腦等,周亮等[15]研究山蒟醋酸乙酯提取物的化學成分,共分離得到N-p-香豆酰酪胺、馬兜鈴內酰胺、胡蘿卜苷、藜蘆酸等7種化合物.均與本試驗結果存在較大差異.可能是因為提取方法、溶劑、條件和采集的時間、地點、生長環境等因素不同有關.

已有研究表明[16-19],丁香、八角茴香和迷迭香提取物、番石榴葉提取物、大蒜揮發油,以及葎草、蒲公英、馬齒筧、紫花地丁提取物均具有較好抑制大腸桿菌、金黃色葡萄球菌等致病菌的活性,均與本試驗結果一致.當今,充分利用現有植物資源,研究和開發安全有效、優良的飼料添加劑,減少或替代化學類抗生素藥物的使用,提高畜產品質量是畜禽產業發展的重中之重.廣西華山蒟、廣西山蒟、毛脈樹胡椒、海南假蒟、夏威夷假蒟作為我國南方植物資源,具有分布廣泛、采收方便、價廉無毒等優點,本試驗研究了其對豬兩種致病菌的體外抗菌活性和初步分析了其主要成分,為今后研究確立其主要抗菌活性物質和作為飼料添加劑開發應用提供依據.

本試驗中,5種植物提取物對豬兩種致病菌均呈現較好地體外抑殺效果,可能是因為其含有洋芹腦、吉馬烯D、β-石竹烯、胡椒酮等活性抗菌成分所致.

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Antibacterial study of fiveplant extracts against swinepathogens

WANG Ding-fa,ZHOU Lu-li,ZHOU Xiong,ZHOU Han-lin
(Tropical Crops Genetic Resources Institute,Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences,Danzhou 571737,China)

The study was to do component analysis of five kinds of pepper plants ethanol extracts from Soxhlet extraction using gas chromatography-mass spectrometry method.The antibacterial effects in vitro of five extracts on swine E.coli and Staphylococcus aurous were studied.The results showed that apiole,germacrene D,β-caryophyllene,piperitone,α-pinene,4-terpene alcohol and natural vitamin E(0.03%～0.36%)were the common components and the main ingredients.The results indicated that five extracts all had good better antibacterial effect.The minimal bacteriocidal concentration(MBC)of ethanol extracts of Huashan pepper from Guangxi to swine E.coli and Staphylococcus aurous were 31.25 mg/mL and 7.8 mg/mL,respectively.Five kinds of pepper plants eth?anol extracts showed good inhibitory effect to two swine pathogens,probably because its ethanol extract contains apiole,germacrene D,β-caryophyllene,piperitone and other active antibacterial ingredients.

plants extracts;gas chromatography-mass spectrometry method;tube dilution method

ZHOU Han-lin

R 285

A

0529-6005(2016)06-0060-03

2015-04-07

中央級公益性科研院所基本科研業務費專項資金(1630032015042,16300320150046)

王定發(1979-),男,助理研究員,博士,研究方向為動物營養與飼料科學,E-mail:wangdingfa197945@aliyun.com

周漢林,E-mail:zhouhanlin8@163.com