藥敏試驗擴散法比較分析

李雁萍，宋志勇

（山西省畜牧獸醫學校，山西 太原 030024）

藥敏試驗擴散法比較分析

李雁萍，宋志勇

（山西省畜牧獸醫學校，山西 太原 030024）

藥敏試驗是指細菌對抗菌藥物的敏感性試驗，通過藥敏試驗，能很好地掌握藥物對細菌的敏感性，為臨床選用抗菌藥物提供理論參考，以便準確有效地利用藥物進行預防治療。常用方法有紙片法、牛津杯法和打孔法等。通過對大腸桿菌的藥敏試驗，氧氟沙星、氟甲喹、新霉素為高敏，硫氰酸紅霉素、林可霉素為中敏。

抗菌藥；藥敏試驗；擴散法；比較

抗菌藥對細菌性傳染病的預防、控制起到非常重要的作用，但因盲目、濫用抗菌藥，致使很多致病性細菌產生了耐藥性，使得抗菌藥對細菌性疾病的控制效果越來越差，不但造成藥物浪費，而且還延誤病情，給養殖場（戶）造成了很大的經濟損失，給養殖業帶來很大的困惑［1］。通過藥敏試驗，能很好地掌握藥物對細菌的敏感性，為臨床選用抗菌藥物提供理論參考，以便準確有效的利用藥物進行預防治療［2］。筆者從事實驗工作30年，臨床微生物實驗室進行藥敏試驗的方法主要是擴散法，現將三種擴散法的具體操作及試驗結果介紹總結如下，供大家臨床用藥參考。

1　材料和方法

1.1原理

藥物在瓊脂中擴散，隨著擴散距離的增加，抗菌藥物的濃度呈對數減少，從而形成濃度梯度，由于抑菌濃度范圍內的菌株不能生長，而抑菌范圍外的菌株則可以生長，從而形成透明的抑菌圈，抑菌圈的大小可以反映測試菌對藥物的敏感程度，并與該藥物對測試菌的MIC（最小抑菌濃度）呈負相關［3］。

1.2材料

1.2.1菌種

臨床現場采取大腸。

1.2.2抗生素和抗菌藥

選用氧氟沙星可溶性粉（編號為1）、硫氰酸紅霉素可溶性粉（編號為2）、鹽酸林可霉素可溶性粉（編號為3）、氟甲喹可溶性粉（編號為4）、硫酸新霉素可溶性粉（編號為5）5種抗菌藥進行對比試驗。

1.3方法

1.3.1紙片法

將含有定量抗菌藥物的濾紙片貼在已接種了測試菌的瓊脂表面上。

1.3.1.1紙片制備

取定性濾紙，用打孔機打成6 mm直徑的圓形小紙片。取圓紙片200片分5份分別裝入清潔干燥的5個青霉素空瓶中，瓶口以報紙包扎。經15磅15～2 min高壓消毒后，放在37℃溫箱或烘箱中數天，使完全干燥備用。

1.3.1.2藥液的制備（用于商品藥的試驗）

挑選可溶性粉劑氧氟沙星（編號為1）、硫氰酸紅霉素（編號為2）、林可霉素（編號為3）、氟甲喹（編號為4）、新霉素（編號為5），按商品藥治療量的10倍的比例配制藥液。

1.3.1.3藥敏片的準備

在上述含有40片紙片的5個青霉素瓶內分別加入氧氟沙星可溶性粉（編號為1）、硫氰酸紅霉素可溶性粉（編號為2）、鹽酸林可霉素可溶性粉（編號為3）、氟甲喹可溶性粉（編號為4）、硫酸新霉素可溶性粉（編號為5）的0.1%藥液10 ml，并翻動紙片，使各紙片充分浸透藥液。翻動紙片時不能將紙片搗爛，同時在瓶口上記錄藥物名稱，放37℃溫箱內過夜，干燥后即密蓋。切勿受潮，置陰暗干燥處存放，有效期3～6個月。

1.3.1.4普通營養瓊脂培養基

稱取瓊脂培養基22.5 g，加入500 ml蒸餾水中，加熱煮沸溶解，培養皿分裝，在培養皿的皿底劃十字形，標號（與抗菌藥物編號一致），消毒，備用。

1.3.1.5菌種的挑選、培養

將臨床癥狀和剖檢變化疑似大腸桿菌病的雞或豬的肝、脾、心臟，先用灼燒的手術剪在肝或心臟表面烙燙一下，剪取病料如肝、脾、心臟剪小塊直接放入肉湯培養基中，置于37℃恒溫箱中培養24 h進行培養，備用。

1.3.1.6操作步驟

第1步，在“超凈臺”中，用經（酒精燈）火焰滅菌的鑷子夾取消毒棉，蘸取待檢細菌混懸液，涂布于平皿培養基表面。要求涂布均勻致密，涂好的培養皿放入37℃恒溫箱中20～30 min，效果更好。

第2步，將消毒鑷子夾取藥敏片貼到平皿培養基表面。為了使藥敏片與培養基緊密相貼，可用鑷子輕按幾下藥敏片。藥敏片有規律地貼于平皿培養基上，每種藥敏片要與相應的編號對應，每組重復3次，結果取平均值。

第3步，將平皿培養基置于37℃溫箱中培養24 h后，觀察效果。

1.3.2牛津杯法

在“超凈臺”中，用經（酒精燈）火焰滅菌的鑷子夾取消毒棉，蘸取待檢細菌混懸液，涂布于平皿培養基表面。操作、要求同紙片法。

無菌操作將滅菌的不銹鋼小管（內徑6 mm、外徑8 mm、高10 mm的圓形小管，管的兩端要光滑，也可用塑料管、玻璃管、瓷管代替），放置在培養基上，輕輕加壓，使其與培養基接觸無空隙。

15 min后分別向各小管中滴加和藥敏片一樣量（25 μL）的各種藥液，每組重復3次，結果取平均值。

將平皿培養基置于37℃溫箱中培養24 h后，觀察效果。

1.3.3打孔法

在“超凈臺”中，用經（酒精燈）火焰滅菌的鑷子夾取消毒棉，蘸取待檢細菌混懸液，涂布于平皿培養基表面。操作、要求同紙片法。

無菌操作將滅菌的不銹鋼小管（外徑為4 mm、孔徑與孔距均為3 mm，管的兩端要光滑，也可用塑料管、玻璃管、瓷管），放置在培養基上打孔，將孔中的培養基用針頭挑出，并以火焰封底，使培養基能充分的與平皿融合（以防藥液滲漏，影響結果）。

待15 min后，分別向各孔中滴加和藥敏片一樣量（25 μL）的各種藥液。每組重復3次，結果取平均值。

將平皿培養基置于37℃溫箱中培養24 h后，觀察效果。

1.3.4判定標準

藥敏試驗的結果，應按抑菌圈直徑大小作為判定敏感度高低的標準。

表1　藥物敏感試驗判定標準

2　結果觀察

運用擴散法進行藥敏試驗，結果顯示如下表。

藥物敏感試驗判定標準參考表1，氧氟沙星（編號為1）、氟甲喹（編號為4）、新霉素（編號為5）；在20 mm以上均為高敏；硫氰酸紅霉素（編號為2）、林可霉素（編號為3）在10～14 mm均為中敏。

表2　藥物敏感試驗結果

3　結論與體會

3.1結論

通過紙片法、牛津杯法和打孔法對大腸桿菌的藥敏試驗，可得出以下結論：

打孔法不需要制作或購買藥敏片，也不用購買牛津杯，成本低，適合生產中應用。打孔法3組對比，結果整齊，誤差小。打孔法直接打孔后，將藥液滴入即可。

由此可見，打孔法操作簡單，成本低，準確率高，適合商品藥敏感度的測定。

3.2影響藥敏試驗的因素

3.2.1培養基

溶解培養基要用蒸餾水，一些離子如Ca2+、Mg2+、Al3+等，一定程度上影響藥敏試驗的結果。

細菌藥敏試驗的培養基厚度大約為4 mm，若培養基厚度大于4 mm，會使細菌出現耐藥；若小于4 mm，本應耐藥的易出現敏感，這一點很關鍵［4］。

3.2.2試紙片的影響

藥敏試紙片的試紙一般是使用加厚型的濾紙，藥敏紙片的厚度要求大約1 mm，這樣才有利于細菌的生長和藥物的擴散速度。藥敏紙片的直徑在6.00～6.35 mm之間，紙片的厚度和直徑大小都會影響藥敏試驗的結果。

做好的紙片應放低溫下（-10℃）保存，同時要避免潮濕，以保持抗菌藥物的活性。盛紙片小瓶自低溫處取出應在室溫平衡至少10min后再打開，避免冷凝水影響藥效。

3.2.3細菌菌株的影響

由于各種菌對藥物的敏感性不同，產生的抑菌環大小不同，如果菌種不純，試驗中所產生的抑菌環大小與該菌種在純培養狀態下產生的抑菌環大小存在較大的差異，影響判斷結果的準確性。因此需要對各種致病菌提純后，分別進行不同的藥敏試驗。藥敏試驗時，需要將提純后的菌種配制成一定濃度的菌液。WHO組織制定的標準是要求菌液濃度在1.5億/mL左右。若菌液濃度過高，該菌會對所有藥物產生耐藥；反之，菌液濃度過低，該菌會對所有藥物均敏感。

藥敏試驗中要將菌液均勻地涂在培養基上，使細菌均勻分布，這樣才能使試驗結果不會出現較大的偏差。涂菌后15 min才能貼藥敏紙片。由于涂菌后，細菌要有一段時間的適應過程，但是時間不能過長，否則會使細菌產生耐藥。貼藥敏紙片時，每取一種藥敏紙片必須燒一下鑷子口，避免藥敏紙片之間相互混淆，以提高藥敏的準確性。藥物殺滅細菌存在一定的量比，藥敏試驗培養基上細菌層越厚抑菌圈就越小，反之抑菌圈就越大［4］。

3.2.4培養時間的影響

一般培養溫度和時間為37℃8～18h，有些抗菌藥擴散慢如多粘菌素，可將已放好抗菌藥的平板培養基，先置4℃冰箱內2～4 h，使抗菌藥預擴散，然后再放37℃溫箱中培養，可以推遲細菌的生長，而得到較大的抑菌圈［4］。

3.3藥敏試驗的應用

藥物敏感試驗后，應選擇高敏藥物進行治療，也可選用兩種藥物協助使用，以減少耐藥菌株。在選擇高敏藥物時應考慮藥物的吸收途徑，因為我們藥敏實驗是藥液直接和細菌接觸，而在給畜禽用藥的時候，必須通過機體的吸收才能使藥物達到一定的效果，所以在給畜禽用藥時，高敏藥物一定要配合適宜的給藥方法，這樣才會達到好的治療效果。

［1］陳學文.獸醫臨床上濫用抗生素的危害［J］.當代畜牧，2014（27）：56～57.

［2］唐光武等.禽病快速診斷指南［M］.河南：和囔科學技術出版社，2008.4：43.

［3］倪語星.抗微生物藥物敏感性試驗規范［M］上海：上海科學技術出版社，2002.10：16.

［4］佚名.影響藥敏試驗的因素［J］.北方牧業，2004（14）：19～19.

S859.1

B

1004-5090（2016）07-0010-03

2016-04-29）