加味小柴胡湯及其有效物質(zhì)部位群抗炎實(shí)驗(yàn)研究

吳歡歡　周愛軍　胡麗娟　陳雪劍　楊夢玲　劉焱文

加味小柴胡湯及其有效物質(zhì)部位群抗炎實(shí)驗(yàn)研究

吳歡歡周愛軍胡麗娟陳雪劍楊夢玲劉焱文

目的 對加味小柴胡湯及其有效物質(zhì)部位群進(jìn)行抗炎活性實(shí)驗(yàn)研究，確定其有效物質(zhì)部位群，以期闡述其藥效物質(zhì)基礎(chǔ)，為該經(jīng)典方劑治療慢性胃炎的臨床療效提供科學(xué)實(shí)驗(yàn)依據(jù)。方法 將加味小柴胡湯復(fù)方視為整體，采用系統(tǒng)溶劑法將其提取分離為揮發(fā)油、多糖、生物堿、酚酸類、皂苷類等化學(xué)物質(zhì)部位；采用二甲苯致小鼠耳廓腫脹和角叉菜膠致大鼠足趾腫脹抗炎實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型，對該方劑及其各物質(zhì)部位進(jìn)行抗炎實(shí)驗(yàn)研究。結(jié)果 二甲苯致小鼠耳廓腫脹模型實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果表明，與模型組比較，全方高及低劑量組、皂苷部位高及低劑量組、多糖部位高劑量組均能極顯著抑制小鼠耳腫脹（P<0.01）；酚酸類物質(zhì)部位高劑量組能顯著抑制小鼠耳腫脹（P<0.05）。角叉菜膠致大鼠足趾腫脹模型實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與模型組比較，全方高及低劑量組、皂苷部位高及低劑量組、酚酸類物質(zhì)部位高劑量組均能極顯著地減輕大鼠足趾腫脹（P<0.01）；多糖部位高劑量組能顯著減輕大鼠足趾腫脹（P<0.05）。結(jié)論 確定了加味小柴胡湯及其有效物質(zhì)部位群的抗炎作用，從而為該臨床經(jīng)驗(yàn)方治療慢性胃炎提供了現(xiàn)代藥理學(xué)實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

加味小柴胡湯； 有效物質(zhì)部位群； 抗炎

加味小柴胡湯以張仲景所著《傷寒論》中小柴胡湯為基本方，加味干姜、黃連、茯苓、白術(shù)組成；臨床治療慢性胃炎，療效確切。

本實(shí)驗(yàn)在臨床療效基礎(chǔ)上，將加味小柴胡湯復(fù)方視為整體，按其不同化學(xué)物質(zhì)類別提取分離為揮發(fā)油、多糖、生物堿、酚酸類、皂苷類等物質(zhì)部位［1］；采用二甲苯致小鼠耳廓腫脹和角叉菜膠致大鼠足趾腫脹動(dòng)物實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ停孕∈蠖[脹度和大鼠足趾腫脹度為考察指標(biāo)，對加味小柴胡湯及其各物質(zhì)部位群進(jìn)行了抗炎實(shí)驗(yàn)的研究。

1　材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

昆明種小鼠，雌雄各半，體質(zhì)量18～22 g，由湖北省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究中心提供，許可證號：SCXK（鄂）2008-0005；Wistar大鼠，雄性，體質(zhì)量190～210 g，由湖北省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究中心提供，許可證號：SCXK（鄂）2015-0018。

1.2藥物與試劑

加味小柴胡湯處方藥材（湖北九州通醫(yī)藥集團(tuán)）；阿司匹林腸溶片（沈陽奧吉娜藥業(yè)有限公司，批號：140910）；λ-角 叉 菜 膠 （sigma，批 號：1408463V）；二甲苯（分析純）；氯化鈉注射液（雙鶴藥業(yè)，批號：1504080801）。

1.3器材

萬分之一電子天平（Metter Toledo A1204）、直徑6 mm打孔器、小鼠灌胃針頭、大鼠灌胃針頭、手術(shù)剪、100 μL移液槍、鑷子、三通閥、10 mL注射器、5 mL注射器、1 mL注射器、橡膠管、2 mL刻度吸管、鐵架臺等。

1.4供試藥物的制備

加味小柴胡湯全方水煎液的制備：組成：柴胡15 g 、黃苓10 g、法半夏10 g、黨參10 g、生姜10 g、炙甘草10 g、干姜6 g、黃連3 g、白術(shù)10 g，水煎煮提取、濃縮、干燥，研磨成藥粉；稱取藥粉適量，加水溶解，配制成低與高濃度藥液，按生藥量計(jì)為3.25 g/mL、6.5 g/mL。

揮發(fā)油物質(zhì)部位藥液的制備：處方同前，采用水蒸氣蒸餾法提取揮發(fā)油，取揮發(fā)油適量，加水搖勻（加0.8‰吐溫80助溶），配制成低與高濃度藥液，按生藥量計(jì)為3.25 g/mL、13 g/mL。

總多糖物質(zhì)部位藥液的制備：按加味小柴胡湯處方比例稱取除黃連外適量藥材，加水煎煮3次，合并煎煮液，濃縮至適量體積，少量多次加入95%乙醇，攪拌，使藥液醇度達(dá)70%，靜置過夜，減壓抽濾，將醇沉物干燥，得總多糖物質(zhì)部位 333.2 g（13.3%）；取多糖干膏粉適量，加水溶解，配制成低與高濃度藥液，按生藥量計(jì)為3.25 g/mL、13 g/mL。

生物堿物質(zhì)部位藥液的制備：取上述抽濾后濾液適量，揮至無醇味，用1 mol/L NaOH溶液調(diào)pH至10～11，用等體積的氯仿萃取8次，合并氯仿萃取液，減壓回收氯仿，得氯仿萃取物；另按處方比例稱取適量黃連藥材，用甲醇-鹽酸（100∶1）超聲提取30分鐘，提取液回收溶劑，與氯仿萃取物合并，干燥，得生物堿物質(zhì)部位14.55 g（0.58%）；取生物堿物質(zhì)部位干膏粉適量，加水溶解，配制成低與高濃度藥液，按生藥量計(jì)為3.25 g/mL、13 g/mL。

酚酸類物質(zhì)部位藥液的制備：將上述氯仿萃取后的水相用1 mol/L HCL溶液調(diào)pH至3～4，用等體積乙酸乙酯萃取8次，合并乙酸乙酯萃取液，減壓回收乙酸乙酯，得酚酸類物質(zhì)部位29.19 g（1.17%）；取酚酸類部位干膏粉適量，研磨，加水溶解，配制成低與高濃度藥液，按生藥量計(jì)為3.25 g/mL、13 g/mL。

皂苷類物質(zhì)部位藥液的制備：將上述乙酸乙酯萃取后的水相用1 mol/LNaOH溶液調(diào)pH至中性，用等體積水飽和正丁醇萃取8次，合并正丁醇層，減壓回收正丁醇，得皂苷類物質(zhì)部位90.2 g（3.61%）；取正丁醇部位干膏粉適量，加水溶解，配制成低與高濃度藥液，按生藥量計(jì)為3.25 g/mL、13 g/mL。

1.5二甲苯致小鼠耳廓腫脹實(shí)驗(yàn)

1.5.1實(shí)驗(yàn)分組及給藥 取昆明小鼠112只，雌雄各半，隨機(jī)分為14組，即模型組（等體積生理鹽水），陽性藥物對照組（阿司匹林：0.05 g/kg），全方水煎液低與高劑量組（按生藥量計(jì)為16.25 g/kg、32.5 g/kg，相當(dāng)于1倍和2倍臨床給藥劑量），各物質(zhì)部位高、低劑量組（按生藥量計(jì)為16.25 g/kg、65 g /kg，相當(dāng)于1倍和4倍臨床給藥劑量）。每天灌胃給藥1次，連續(xù)給藥6天。

1.5.2實(shí)驗(yàn)方法 末次給藥1小時(shí)后，于各試驗(yàn)組小鼠右耳正反兩面各涂二甲苯20 μL致炎，45分鐘后脫頸椎處死小鼠，用直徑6 mm打孔器沖下左右耳同一部位的圓片，于分析天平上稱重［2］。

腫脹度=右耳質(zhì)量-左耳質(zhì)量

腫脹抑制率=（模型組腫脹度-給藥組腫脹度）/模型組腫脹度×100%

1.6角叉菜膠致大鼠足趾腫脹實(shí)驗(yàn)

1.6.1實(shí)驗(yàn)分組及給藥 取Wistar雄性大鼠112只，分組同1.5.1，模型組給予等量生理鹽水，陽性藥物對照組（阿司匹林：0.075 g/kg），全方低與高劑量組（按生藥量計(jì)為11.25 g/kg、22.5 g/kg，相當(dāng)于1倍和2倍臨床給藥劑量），各物質(zhì)部位高、低劑量組（按生藥量計(jì)為11.25 g/kg、45 g/kg，相當(dāng)于1倍和4倍臨床給藥劑量）。各組每天灌胃給藥1次，連續(xù)6天。

1.6.2實(shí)驗(yàn)方法 末次給藥前，分別在各試驗(yàn)組大鼠右后肢踝關(guān)節(jié)處作標(biāo)記，并測定給藥前足趾容積，末次給藥1小時(shí)，分別于各試驗(yàn)組大鼠右后足掌心向踝關(guān)節(jié)方向皮下注射1%角叉菜膠0.1 mL，致炎后1、2、3、4、5小時(shí)分別測量各鼠右后足趾體積［3］。計(jì)算各鼠足腫脹度。

腫脹度=致炎后足容積-致炎前足容積

1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

應(yīng)用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件處理數(shù)據(jù)，計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示。各指標(biāo)組間比較均采用單因素方差分析，若方差齊性時(shí)采用 LSD法，若方差不齊采用Dunnett's T3法。小鼠耳腫脹度，大鼠3小時(shí)、4小時(shí)、5小時(shí)足腫脹度數(shù)據(jù)資料組間方差齊性，采用LSD法檢驗(yàn)，大鼠1小時(shí)、2小時(shí)足腫脹數(shù)據(jù)資料方差不齊，采用Dunnett's T3法檢驗(yàn)，以P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1二甲苯致小鼠耳廓腫脹實(shí)驗(yàn)結(jié)果

各組采用二甲苯涂于小鼠右耳廓使腫脹致炎，15分鐘后均可見右耳廓明顯紅腫，表明小鼠造模成功。供試藥物抗炎實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，加味小柴胡湯高及低劑量組、皂苷類物質(zhì)部位高及低劑量組、多糖高劑量組均能顯著抑制模型動(dòng)物的的耳廓腫脹度，與模型動(dòng)物組比較具有極顯著性差異（P<0.01），與陽性藥物組比較無顯著性差異（P＞0.05）；酚酸類物質(zhì)部位高劑量能明顯抑制動(dòng)物模型的耳廓腫脹度，與模型動(dòng)物比較，具有顯著性差異（P<0.05）；其他物質(zhì)部位也具有一定抑制模型動(dòng)物的耳廓腫脹效果。因此，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，加味小柴胡湯具有明顯抗炎效果，其主要有效物質(zhì)部位群為皂苷類、多糖和酚酸類物質(zhì)。研究結(jié)果見表1。

表1　加味小柴胡湯及各物質(zhì)部位組對二甲苯致小鼠耳廓腫脹的影響（n=8，x±s）

2.2角叉菜膠致大鼠足趾腫脹實(shí)驗(yàn)結(jié)果

各組大鼠于右后足掌心向踝關(guān)節(jié)方向皮下注射1%角叉菜膠0.1 mL，1小時(shí)后均呈現(xiàn)明顯紅腫，各試驗(yàn)組大鼠足趾容積與造模前比較顯著增大（P< 0.01），表明大鼠足趾腫脹造模成功。供試藥物抗炎實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，加味小柴胡湯高及低劑量組、皂苷物質(zhì)部位高及低劑量組、酚酸類物質(zhì)部位高劑量組具有顯著抑制大鼠足趾腫脹的藥效作用，與模型動(dòng)物組比較具有極顯著性差異（P<0.01）；與陽性藥物組比較無顯著性差異（P＞0.05）；多糖物質(zhì)部位能明顯減輕大鼠足趾腫脹度，與模型動(dòng)物組比較具有顯著性差異（P<0.05）；其他物質(zhì)部位也具有一定抑制模型大鼠足趾腫脹的藥效作用。因此本項(xiàng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果仍然表明，加味小柴胡湯具有顯著抗炎效果，其主要有效部位群為皂苷類、酚酸類和多糖類物質(zhì)。研究結(jié)果見表2。

表2　加味小柴胡湯及各物質(zhì)部位對角叉菜膠致大鼠足趾腫脹的影響（n=8，x±s）

3　討論

小柴胡湯是醫(yī)圣張仲景所著《傷寒論》的代表方，主治脾胃疾患，沿用2000余年，經(jīng)久不衰。張仲景在臨床實(shí)踐中，以柴胡和甘草為小柴胡湯的核心藥物，方中其他諸藥則可隨癥加減［4］。東莞市中醫(yī)院周愛軍主任醫(yī)師以小柴胡湯為基本方，在長期臨床實(shí)踐中總結(jié)出加味小柴胡湯臨床經(jīng)驗(yàn)方治療慢性胃炎，療效顯著。本研究在臨床療效基礎(chǔ)上，采用現(xiàn)代藥理學(xué)方法對加味小柴胡湯及其有效物質(zhì)部位群進(jìn)行抗炎實(shí)驗(yàn)研究，研究結(jié)果表明加味小柴胡湯具有顯著抗炎效果。

中醫(yī)復(fù)方的配伍協(xié)同作用是其臨床療效的優(yōu)勢和特色。本論文將加味小柴胡湯視為整體，從中提取分離不同化學(xué)物質(zhì)部位，并通過藥理篩選研究，確定了該臨床經(jīng)驗(yàn)方的主要有效物質(zhì)部位群為皂苷類、酚酸類和多糖類物質(zhì)部位，其余揮發(fā)油和生物堿物質(zhì)部位具有一定抗炎作用，但效果不明顯。加味小柴胡湯中這些藥效不明顯的物質(zhì)部位是否存在配伍協(xié)同的增效機(jī)制，有待進(jìn)一步深入探討其成分配伍組方的協(xié)同作用［5］。

據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道［6-7］，幽門螺旋桿菌（helicobacter pylori，HP）感染是導(dǎo)致慢性胃炎最常見的病因。本實(shí)驗(yàn)室前期對加味小柴胡湯及其有效物質(zhì)部位群進(jìn)行了抗HP的實(shí)驗(yàn)研究，具有明顯抑制HP的藥效作用［8］；本論文研究結(jié)果表明，該方劑及其有效物質(zhì)部位群具有顯著抗炎作用。前次研究結(jié)果認(rèn)為，加味小柴胡湯通過清除HP的途徑發(fā)揮治療慢性胃炎的作用；本次研究結(jié)果表明，該方劑直接通過抗炎效果發(fā)揮藥效作用。綜合分析本研究團(tuán)隊(duì)前后兩次對加味小柴胡湯的研究結(jié)果，為該經(jīng)驗(yàn)方治療慢性胃炎的臨床療效提供了科學(xué)實(shí)驗(yàn)依據(jù)，其有效物質(zhì)抗慢性胃炎的作用機(jī)理有待深入研究。

［1］ 王明軍.試論現(xiàn)代中藥衍生的“有效部位配伍”新藥模式［J］.中國中醫(yī)藥結(jié)合雜志，2008，28（1）：73-76.

［2］ 徐小龍，盧杰，余建強(qiáng)，等.醋制老瓜頭鎮(zhèn)痛抗炎活性研究［J］.中國實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2013，19（7）：221-225.

［3］ 黃斌學(xué)，黃增瓊，許小林，等.烏桕葉提取物鎮(zhèn)痛抗炎作用的實(shí)驗(yàn)研究［J］.中成藥，2004，26（6）：476-479.

［4］ 劉思毅，袁紅霞.從藥到方-《傷寒雜病論》小柴胡湯方證辨析［J］.天津中醫(yī)藥，2014，31（8）：504-506.

［5］ 劉新軍，蘇式兵.中藥及其成分配伍組方的研究方法探析［J］.中西醫(yī)結(jié)合學(xué)報(bào)，2009，7（7）：601-605.

［6］ 陶景德，謝瑞華，王少峰，等.慢性胃炎患者幽門螺桿菌感染與血脂及炎癥因子的關(guān)系［J］.中國現(xiàn)代醫(yī)藥雜志，2013，15（4）：12-14.

［7］ 謝兆蘭，周立云，王明林，等.慢性胃炎病人血清CagA抗體和胃黏膜炎癥活動(dòng)性及Hp密度檢測［J］.齊魯醫(yī)學(xué)雜志，2014，29（1）：40-42.

［8］ 胡麗娟，劉蔚，吳歡歡，等.加味小柴胡湯抗幽門螺桿菌的有效物質(zhì)部位群研究［J］.中國現(xiàn)代中藥，2015，17（3）：307-311.

（本文編輯：蒲曉田）

Experimental study on anti-inflammatory effect of modified Xiaochaihu decoction and its effectivefractions

WU Huan-huan，ZHOU Ai-jun，HU Li-juan，et al. Provincial Key Laboratory of Traditional Chinese Medicine Resources and Traditional Chinese Medicine Chemistry of Hubei University of Chinese Medicine，Wuhan 430070，China

LIU Yan-wen，Email：ywliu2008@163.com

Objective To investigate the anti-inflammatory effect of modified Xiaochaihu decoction and its substance fractions.To determine the effective material parts，in order to explain its pharmacodynamic material basis，and to provide a scientific basis for the treatment of gastritis.Methods The means of systematic solvent extraction was used to separate volatile oils，polysaccharides，alkaloids，phenolic acids and saponins from the decoction；animal were divided into high and low dose groups.Mouse ear swelling induced by xylene and the rats paw edema induced by carrageenin to establish the animal model of anti inflammatory，the anti-inflammatory effect of modified Xiaochaihu decoction and each substance fractions was investigated.Results Xylene-induced mouse ear swelling model，compared with model group，the decoction high and low dose group，saponins high and low dose group，polysaccharide high dose group can significantly inhibit the mouse ear edema（P<0.01）；phenolic acids part of the high dose group could significantly inhibit the mouse ear edema（P<0.05）.Carrageenan-induced rat paw edema test，compared with model group，the decoction high and low dose group，saponins high and lowdose group，phenolic acids high dose group can significantly inhibit the mouse ear edema（P<0.01），polysaccharides high dose group can significant reduce toes swelling of rats（P<0.05）.Conclusion The antiinflammatory effect of modified Xiaochaihu decoction and its effective material site group was determined，which provided modern pharmacology experiment basis for the classic prescription of the clinical treatment of chronic gastritis.

Modified Xiaochaihu decoction； Effective fractions； Anti-inflammatory

R285

A

10.3969/j.issn.1674-1749.2016.06.005

廣東省東莞市科技局項(xiàng)目（2013108101036）

430060 武漢，湖北中醫(yī)藥大學(xué)湖北省中藥資源與中藥化學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室［吳歡歡（碩士研究生）、胡麗娟、陳雪劍、楊夢玲（碩士研究生）、劉焱文］；東莞市中醫(yī)院中醫(yī)藥研究所（周愛軍）

吳歡歡（1990-），女，2013級在讀碩士研究生。研究方向：中藥及其制劑的物質(zhì)基礎(chǔ)研究。E-mail：260617673@qq.com

劉焱文（1945-），本科，教授，博士生導(dǎo)師。研究方向：中藥及其制劑的物質(zhì)基礎(chǔ)研究。E-mail：ywliu2008@163.com

2015-10-14）