蜂蜜中泰樂菌素A的穩定性研究

陳惠蘭　張曉燕　陳磊　殷耀　丁濤　朱文君　黃娟　楊雯筌（江蘇出入境檢驗檢疫局動植物與食品檢測中心國家蜂產品基準實驗室，南京210001）

蜂蜜中泰樂菌素A的穩定性研究

陳惠蘭張曉燕陳磊殷耀丁濤朱文君黃娟楊雯筌
（江蘇出入境檢驗檢疫局動植物與食品檢測中心國家蜂產品基準實驗室，南京210001）

泰樂菌素A對控制有土霉素抗性的美洲幼蟲腐臭病很有效，且對蜜蜂的生長毒性較小，但過度使用會在蜂產品中殘留。由于蜂蜜為弱酸性，泰樂菌素A在酸性條件下易降解。本文研究了不同溫度下蜂蜜中泰樂菌素A的穩定性，并建立了蜂蜜中泰樂菌素A及其降解產物脫紅霉糖泰樂菌素的測定方法：以pH 6.0的磷酸鹽緩沖液為提取劑，經HLB小柱凈化富集后，采用高效液相色譜串聯質譜法測定。該方法前處理簡單，對泰樂菌素A和脫紅霉糖泰樂菌素的檢出限和定量限分別為1.0和2.0μg/kg，回收率范圍為70.75～89.28%，RSD為6.4～8.9%。方法回收率穩定且重現性較好，能滿足日常檢測工作的需要。

蜂蜜；泰樂菌素A；脫紅霉糖泰樂菌素；穩定性；高效液相色譜串聯質譜

引言

泰樂菌素A是從弗氏鏈霉菌(Streptomyces fradiae)的培養液中獲得的一種大環內酯類抗生素，早在1970年泰樂菌素首次被報道可作為治療美洲幼蟲腐臭病（AFB）的候選藥物，2002年Elzen P等發現其對控制有土霉素抗性的AFB很有效，且對蜜蜂的生長毒性較小[1]，所以美國FDA批準其用于蜜蜂AFB的治療。然而抗生素過度使用不但會在蜂產品中殘留、影響蜂產品的品質，還能破壞蜂群內微生物平衡，給有害菌發展創造條件并誘導其產生耐藥性，甚至會造成環境的污染。

目前的文獻多是關于蜂蜜中泰樂菌素殘留的檢測方法，涉及其在蜂蜜中穩定性的研究比較少，由于大環內酯類抗生素在酸性條件下不穩定，而蜂蜜呈弱酸性，所以研究蜂蜜中泰樂菌素A的穩定性及其降解產物有助于確定養蜂過程中的休藥期，避免蜂蜜產品中抗生素殘留超標。

泰樂菌素的檢測方法主要有ELISA法[2]、生物傳感器法[3-4]、膠體金法[5]、高效液相色譜法[6-8]以及高效液相色譜串聯質譜法[9-10]，由于ELISA法、表面等離子共振生物傳感器法、膠體金法、高效液相色譜法等存在靈敏度低、假陽性等情況，高效液相色譜串聯質譜法是最常用的檢測方法。本文主要采用高效液相色譜串聯質譜法比較了不同溫度下蜂蜜中泰樂菌素A的降解情況，同時檢測降解產物脫紅霉糖泰樂菌素的含量。

1　材料與方法

1.1儀器與材料

Thermo Finnigan Surveyor液相色譜系統和 TSQ Vantage串聯四級桿質譜儀，配有電噴霧離子源（Electron Spray Ionization，ESI）；N-EVAPTM111氮吹儀（美國Organomation Associates公司）；超純水器（MILLIPORE公司）。

1.2試劑與溶液

泰樂菌素A（USP）、脫紅霉糖泰樂菌素標準品（Toronto Research Chemicals Inc.）。用甲醇溶解并配成0.5 g/L的標準儲備液，再逐級稀釋成0.5 mg/L的混合標準工作液。標準工作曲線按照1.0、2.5、5.0、10.0、25.0、50.0 μg/L的濃度配成6點標準溶液。磷酸氫二鉀、鹽酸均為分析純，甲醇、甲酸均為色譜純。0.2mol/L磷酸二氫鉀緩沖液：稱取 22.8 g K2HPO4·3H2O，用300mL水溶解，用鹽酸溶液調節pH至6.0，用水定容至500mL。

1.3樣品前處理

1.3.1樣品提取和凈化

稱取蜂蜜樣品5.00（±0.05）g于50 ml具塞聚丙烯離心管中，加入磷酸鹽緩沖液15 ml，渦旋混勻1min，上清液過濾于一干凈玻璃離心管中，過HLB小柱（預先用3 ml甲醇和3 ml水處理）凈化。上樣后用3 ml水淋洗，用5 ml甲醇洗脫。洗脫液于45℃水浴氮氣吹干，殘渣用1.0 ml甲醇-水（3∶7）溶解，供液相色譜串聯質譜儀測定。

1.3.2分析測定條件

HPLC條件：Varian Polaris C-18色譜柱（100mm× 2.1 mm,5 μm）；流動相：A，甲醇，B，0.1%甲酸水溶液；梯度洗脫程序：0～1 min 10%A，1.1～2 min 10～60%A，2.1～7min 60%A，7.1～8min 60～90%A，8.1～9min 90%A，9.1～11min 10%A；流速：0.25 ml/min；柱溫為室溫，進樣體積為25 μl。

MS/MS條件：采用ESI源，正離子方式檢測；噴射電壓：2500 V；鞘氣（Sheath Gas）50，輔助氣（Auxiliary Gas）6。其他質譜條件見表1。

表1　泰樂菌素A和脫紅霉糖泰樂菌素的母離子、子離子和碰撞能量

3　結果與討論

3.1前處理條件

大環內酯類藥物在酸性條件（pH<4）下苷鍵易水解，而堿性條件（pH>9）可使內酯環開裂，所以對于蜂蜜中泰樂菌素的前處理選擇了pH4～10的磷酸鹽提取液進行比較，不同pH值提取液的回收率見圖1。由圖1可知，提取液pH值為6時，泰樂菌素A的回收率最高，為76%，而脫紅霉糖泰樂菌素在pH值為5和6時相差不大，所以最終選擇了pH 6的提取液。

圖1　不同pH值提取液對泰樂菌素A和脫紅霉糖泰樂菌素的回收率

3.2不同溫度下成熟蜜和生蜜中泰樂菌素A的穩定性

在成熟蜜（經蜜蜂充分釀造、脫水的蜂蜜，含水量在20%以下）和生蜜（蜜蜂剛采回不久沒有經過充分釀造的蜂蜜，水分含量較高）中添加泰樂菌素A標準溶液，添加量為20 μg/kg，攪勻后各分成兩份，分別放置于4℃冰箱和室溫，選擇不同時間檢測其中泰樂菌素A的含量，結果見圖2。由圖2可知，室溫放置時，成熟蜜和生蜜中泰樂菌素A含量均在下降，脫紅霉糖泰樂菌素含量在逐漸上升，且在生蜜中降解更快；4℃冰箱放置的蜂蜜中的泰樂菌素A含量較穩定。蜂蜜中水分含量和蜂蜜放置溫度均對泰樂菌素A的穩定性有影響。

圖2　不同溫度下成熟蜜和生蜜中泰樂菌素A及其代謝物

3.3方法的線性范圍、檢測限、添加回收實驗和精密度

配制質量濃度為2.0～100μg/L的系列標準溶液，以待測物峰面積 (y)為縱坐標，待測物的質量濃度(x,μg/ kg)為橫坐標進行線性回歸，均獲得良好的線性。標準溶液色譜圖見圖3，在陰性蜂蜜樣品中添加待測物標準溶液，提取凈化后進行測定，確定方法的檢出限和定量限分別為1.0和2.0μg/kg。在陰性蜂蜜中加入泰樂菌素A及脫紅霉糖泰樂菌素標準溶液（添加水平為2.0、5.0和10.0μg/kg），每個水平做6個平行，回收率和精密度數據見表2。采用本方法檢測了150個蜂蜜樣品，其中一個檢出泰樂菌素A，檢測結果為4.2 μg/kg。

圖3　泰樂菌素A及脫紅霉糖泰樂菌素標準溶液色譜圖

4　結論

本文研究蜂蜜中泰樂菌素A的穩定性，泰樂菌素A在蜂蜜中會發生降解，生成代謝物脫紅霉糖泰樂菌素；同時建立蜂蜜中泰樂菌素A和脫紅霉糖泰樂菌素的高效液相色譜串聯質譜檢測法，方法前處理簡單，回收率穩定且重現性較好，能滿足日常檢測工作的需要。

表2　回收率和精密度試驗結果（n=6）

[1]張睿.蜂產品檢測技術指南[M].南京：南京大學出版社，2013：85.

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[6]劉永濤，艾曉輝，鄒世平，等.水產品中螺旋霉素、替米考星、泰樂菌素與北里霉素殘留量的超高效液相色譜-紫外檢測法同時測定.分析測試學報，2010，29（3）：316-320.

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The stability of Tylosin A in honey

Cheng Huilan,Zhang Xiaoyan,Chen Lei,Yin Yao,Ding Tao,Zhu Wenjun,Huang Juan,Yang Wenquan
（National Honey Reference Laboratory,Animal,Plant and Food Inspection Center(APFIC)of Jiangsu Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau,Nanjing 210001,China）

Tylosin A is effective to AFB which is resistant to the antibiotic oxytetracycline and is almost non-toxicity to honeybees.However,tylosin A will remain in honey products if it was overdosed.Honey is weak acidic and tylosin A will degrade in acidic conditions.Therefore,the degradation was studied in honey at different tempeture and the method for determination of tylosin A and the metabolite desmycosin was developed by high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry.The antibiotics was extracted by phosphate buffer(pH6.0)and cleaned-up by HLB.The limit of detection and the limit of quantitation were 1.0μg/kg and 2.0μg/kg,respectively.The recoveries ranged from 70.75%to 89.28%while the precision from 6.4%to 8.9%.The method was used in detection.

honey，tylosin A，desmycosin，stability，high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry(LC-MS/MS)

陳惠蘭，女，高級工程師，主要研究獸藥殘留檢測。

張曉燕，女，高級工程師，主要研究獸藥殘留檢測，E-mail：zhangxy@jsciq.gov.cn。