枸杞多糖對精神分裂癥模型大鼠海馬中G luR1表達及認知功能的影響

陳宇薇，趙曉華，黃鵬

[1.廣州醫科大學附屬腦科醫院（廣州市惠愛醫院）精神科，廣東 廣州 510370；2.南方醫科大學中醫藥學院，廣東 廣州 510515]

論著

枸杞多糖對精神分裂癥模型大鼠海馬中G luR1表達及認知功能的影響

陳宇薇1，趙曉華2，黃鵬1

[1.廣州醫科大學附屬腦科醫院（廣州市惠愛醫院）精神科，廣東 廣州 510370；2.南方醫科大學中醫藥學院，廣東 廣州 510515]

目的探討枸杞多糖（LBP）對精神分裂癥模型（Sz）大鼠海馬中G luR 1表達及認知功能影響。 方法選取36只健康SD大鼠，隨機分3組，每組12只，分別為正常對照組、模型組及藥物干預組（Sz+LBP）。Sz及Sz+LBP腹腔注射地卓西平馬來酸鹽0.6mg/（kg·d），連續注射14 d制造精神分裂癥模型，Sz+LBP同時灌胃枸杞多糖100mg/（kg·d）。正常對照組在相應時段注射等劑量的正常生理鹽水。造模成功后，分別評估各組大鼠的行為學改變，進行M orris水迷宮，比較3組大鼠的定位航行和空間探索時間以及采用免疫熒光染色、W estern blot法測定海馬中GluR 1蛋白的表達。結果Sz的運動量、共濟失調、刻板行為評分以及海馬中GluR 1均高于正常對照組（P<0.01），Sz+LBP的運動量、共濟失調及刻板行為評分均低于Sz，明顯抑制精神分裂癥大鼠海馬中GluR1的表達（P<0.01）。結論枸杞多糖對精神分裂癥模型大鼠海馬具有保護作用，其機制與海馬中GluR 1表達來改善其認知功能相關。

枸杞多糖；精神分裂癥；海馬；GluR 1；認知功能。

精神分裂癥是一種嚴重危害人群健康且認知缺陷發生率非常高的重性精神病之一[1-2]。精神分裂癥給患者和社會帶來了嚴重的困擾，其原因是對其病因和發病機制的研究尚未明確。對于精神分裂癥的假說眾說紛紜，其中精神分裂癥谷氨酸（Glutamate，Glu）功能紊亂假說最為流行，認為精神分裂癥患者N-甲基 -D-天冬氨酸（N-Methyl-D-aspartic acid，NMDA）受體缺陷誘導的Glu系統功能紊亂是精神分裂癥的主要病理機制。并且研究發現給予動物NMDA受體競爭性拮抗劑或非競爭性拮抗劑，均可引起與精神分裂癥（Schizophrenia，Sz）類似的異常行為[3-4]。枸杞多糖（lycium barbarrum polysaccharides，LBP）從枸杞子中提取出來的，是中藥枸杞子的重要活性成分。研究發現LBP具有調節免疫、抗氧化以及延緩衰老等多種功效，尤其是對神經系統具有非常重要的保護功能[5]。本研究旨在通過建立地卓西平馬來酸鹽（Dizocilpine，MK-801）誘導的精神分裂癥模型，探討枸杞多糖對海馬的保護作用及可能機制，為臨床預防和治療精神分裂癥提供實驗依據。

1　材料與方法

1.1動物

選取鼠齡為8周（體重220～240 g）的健康雄性SD大鼠36只，由南方醫科大學動物實驗中心提供。動物飼養室溫為（20±2）℃，濕度為43%～45%，常規的自由攝食飲水，將動物適應性喂養1周后開始進行實驗。

1.2藥品與試劑

枸杞多糖購自廣州廣修堂醫藥科技有限公司，含量≥30%，MK-801購于美國Sigma公司，兔抗大鼠Anti-谷氨酸受體1（glutamate receptor 1，GluR1）抗體購自英國Abcam公司，山羊抗兔二抗購自美國Santa Cruz生物技術公司。

1.3實驗動物分組及模型的建立

健康雄性SD大鼠隨機分為正常對照組、模型組（Sz）和藥物干預組（Sz+LBP），每組各12只。模型組（Sz）和藥物干預組（Sz+LBP）腹腔注射MK-801 0.6mg/（kg·d）[6]連續注射14 d；同時藥物干預組灌胃給予枸杞多糖100mg/（kg·d）正常組以等容量生理鹽水同時注射。

1.4運動量的評價

飼養14 d后，監測給藥以后各組大鼠60min內的運動量的差異。具體方法：將各組大鼠放入監測室里透明的塑料盒內（規則35 cm×35 cm×25 cm），適應環境30min后注射給藥（MK-801）。每只大鼠每5min的運動情況將自動記錄保存在計算機上。

1.5評估刻板行為和共濟失調程度

參考SAMS-DODD[7]的刻板行為評分標準，采用的是5級評分，進行盲法評分，取其平均分，然后進行統計。評分越高，說明精神分裂癥癥狀越重。參考HOFFMAN[8]的共濟失調評分標準，共濟失調本研究用4級評分，每10min評分1次。進行盲法評分，取其平均分，然后進行統計。進行盲法評分，取其平均分，然后進行統計。評分越高，說明精神分裂癥癥狀越重。

1.6Morris水迷宮實驗

在（30±2）℃水池內各組大鼠自停藥后第l天實施水迷宮實驗，由計算機監視系統同步記錄各組大鼠的運動軌跡。①定位航行實驗：造模后一共測試3 d，每天測試6次大鼠尋找平臺的學習能力的檢測。每天上午8︰00～12︰00對各組大鼠進行訓練和測試，具體方法：將平的站臺放在水池的中央，隨機從4個象限標記好的入水點將大鼠面向池壁慢慢地放入水中，電腦軟件將記錄大鼠搜索站臺軌跡，從大鼠入水游泳直到找到并爬上平臺所游過的距離。記錄在平臺象限內的游泳時間，共4次，取平均值。②空間探索實驗：撤走池內平臺，將大鼠從原入水點面向池壁放入池中。計算機將記錄大鼠在60 s內穿越平臺區域的次數和在平臺象限內的游泳時間用于測試大鼠的空間記憶能力，共4次，取平均值。

1.7蛋白免疫印跡法（Western blot）檢測

實驗通過Western blot實驗方法對海馬不同區域組織的GluR1表達量進行比較。大鼠在末次游泳實驗后30min迅速斷頭處死，取出腦組織。游離右側海馬，放置-80℃冰箱保存，具體方法：①4℃將海馬區切片，裂解分離CA1區組織，然后經勻漿液離心，提取CA1區總蛋白，接著離心總蛋白，最后超聲波裂解，從裂解液中分離提取生物化蛋白；②組織勻漿后提取蛋白成分變性，蛋白樣品通過聚丙烯酰胺凝膠（積層膠濃度6%，分離膠濃度10%）電泳2 h，將分離的蛋白轉移到聚偏氟乙烯膜上（濕轉300ma，1.5 h或110 V，1 h）；③轉膜后，將膜置于3%牛血清白蛋白溶液中孵育；④加一抗Anti-GluR1抗體（1∶1 000），孵育（4℃，過夜），TBST洗一抗；⑤加二抗HRP抗體（1∶1 000）孵育（室溫，40min），TBST洗二抗，發光。采用NIH ImageJ軟件進行圖像分析。采用軟件Imagine分析圖像灰度，檢測各組樣品中海馬CA1區突觸膜上GluR1的表達量，后續統計。

1.8免疫熒光染色

心臟灌流法采集腦組織標本。切片的厚度為18μm，貼于掛膠的載玻片，置于-80℃冰箱備用。實驗前，將切片置于室溫放置1 h，具體方法：①0.01 mol/L磷酸緩沖鹽溶液（phosphate buffer saline，PBS）溶液沖洗3次，每次3min；②0.2%Triton-X100 37℃孵育30min，PBS沖洗；③加一抗（1∶100），4℃冰箱過夜；④PBS沖洗，加入熒光標記的二抗（1∶100），放入37℃恒溫箱溫育1 h，PBS沖洗。滴加熒光封片劑，封片。熒光顯微鏡進行觀察拍攝，利用圖像分析系統進行分析。

1.9統計學方法

用SPSS 22.0統計軟件進行數據處理，計量數據用均數±標準差（）表示，3組間差異比較首先采用方差分析，在有意義的基礎之上，兩組間差異比較采用兩樣本均數的t檢驗，P<0.05為差異有統計學意義。

2　結果

2.1運動量的評價

將正常對照組，模型組，藥物干預組大鼠60min內運動量進行分析。結果顯示：3個比較組行方差分析，可見差異有統計學意義；行兩兩比較發現模型組均高于對照組，LBP組大鼠低于模型組。見表1。

2.2刻板行為和共濟失調評估

結果顯示：刻板行為和共濟失調評分差異均有統計學意義，模型組高于正常對照組。共濟失調程度呈現同樣的趨勢。見表2、表3。

2.3海馬G luR1的表達

如圖1所示，正常對照組海馬GluR1的表達量為0.453，模型組為0.782，藥物干預組為0.569。

表1　各組大鼠運動量的評價 （）

表1　各組大鼠運動量的評價 （）

注：1）與正常對照組比較，差異有統計學意義（t=-57.204，P=0.032）；2）給藥之后，與模型組比較癥狀有所改善，差異有統計學意義（t=30.454，P=0.025）

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表2　大鼠刻板行為的變化（n=36，分，）

表2　大鼠刻板行為的變化（n=36，分，）

注：1）與正常對照組比較，差異有統計學意義（t=-11.361，P=0.047）；2）給藥之后，與模型組比較癥狀有所改善，差異有統計學意義（t=7.055，P=0.032）

結果正常對照組　0.73±1.12模型組　4.78±2.341）藥物干預組　2.53±0.562）F值　25.86 P值　0.039組別

表3　大鼠共濟失調的變化（n=18，分，）

表3　大鼠共濟失調的變化（n=18，分，）

注：1）與正常對照組比較，差異有統計學意義（t=-10.129，P=0.021）；2）給藥之后，與模型組比較癥狀有所改善，差異有統計學意義（t=3.201，P=0.008）

結果正常對照組　0.43±0.13模型組　2.03±0.781）藥物干預組　1.23±0.522）F值　36.79 P值　0.028組別

圖1　海馬GluR1的表達

2.4海馬G luR1陽性神經元的表達

正常對照組海馬GluR陽性神經元的表達量為19.000，模型組為43.000，藥物干預組為35.000。見圖2。

圖2　海馬G luR陽性神經元的表達

3　討論

精神分裂癥是一種較常見的精神疾病，涉及思維、情感和行為等多方面的障礙，以精神活動與環境不脅凋為特征[9-10]。臨床研究發現在精神分裂癥患者中認知缺陷的發生率高，約85%患者出現認知功能方面的障礙[11]。臨床上使用的藥物在治療過程中易出現不良反應和鎮靜、體位性低血壓與植物神經紊亂的不良反應。因此，探索尋找療效好、副作用小的抗精神分裂癥的中草藥非常迫切，目前我國國內尚未有人具體探討中藥治療精神分裂癥的基礎實驗研究。因此，對于建立合理的動物模型，選取合理的藥物干預并對其發病機制進行系統深入的研究非常有意義。本文利用dizocilpine（MK-801）是高親和力的NMDA受體非競爭性拮抗劑，制備精神分裂癥模型，探討精神分裂癥對認知功能的影響。

本研究連續14 d給大鼠腹腔注射MK-801，監測各組大鼠的運動量的變化和精神狀態，結果發現對照組大鼠行為活動均正常，而模型組大鼠均出現持續、無目的、迅速的追尾運動。枸杞多糖干預組大鼠活動明顯有所改善（表1、表2）。此結果與ANDINE等[12]給藥誘發大鼠精神分裂癥發生后的行為學改變一致。此外，模型組大鼠還出現擬精神分裂癥癥狀如：向一邊傾斜、走路不穩、反復跌倒、重復抬頭、搖頭或旋轉、尖叫等。筆者對各組大鼠的異常行進行評估，結果發現模型組大鼠的共濟失調與刻板行為評分均高于正常對照組，此結果與YAMAGUCHI[13]相關研究結果一致。證明MK-801誘導產生類似精神分裂癥的模型非常成功。枸杞多糖干預后，上述癥狀均有所改善。說明枸杞多糖對精神分裂癥有一定的治療作用。

中樞神經系統的谷氨酸受體包括α-氨基-3-羥基-5-甲基-4-異惡唑丙酸（α-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazole-propionic acid，AMPA）受體和NMDA受體。其中AMPA受體的數量決定了突出后神經元興奮的程度，是中樞神經系統影響突觸傳遞的主要決定因素.它在突觸后膜區和突觸后膜外區存在的數量比的穩定性，并在學習與記憶功能中發揮重要作用，對于大腦信息的儲存是具有非常重要的意義[14-15]。GluR1是AMPA受體最主要的受體，因此研究其在精神分裂癥模型中的機制尤為重要。本研究發現精神分裂癥模型大鼠海馬區GluR1的表達量較正常組明顯增加，枸杞多糖干預后，精神分裂癥大鼠海馬區及CA1區突觸膜蛋白中GluR1的表達量降低。因此認為LBP對認知的保護作用可能與CA1區突觸膜上GluR1表達量的較少有關。

綜上所述，本次實驗主要通過選取枸杞多糖為干預藥物，建立合理的精神分裂癥大鼠模型，探討枸杞多糖對精神分裂癥認知功能的影響及其作用機制，為精神分裂癥的臨床藥物治療提供了實驗數據，并對精神分裂癥治療提供了新靶點。即枸杞多糖能夠保護精神分裂癥大鼠的認知功能，其具體機制可能與GluR1在海馬區總蛋白及海馬CA1區突觸膜蛋白中的表達量有關。

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（張西倩編輯）

Effect of Lycium barbarrum polysaccharides on hippocam pal GluR1 and cognitive function of schizophrenia rats

Yu-wei Chen1,Xiao-hua Zhao2,Peng Huang1
［1.Department of Psychiatry，the Affiliated Brain Hospital of Guangzhou Medical University，（Guangzhou Huiai Hospital），Guangzhou，Guangdong 510370，China；2.Traditional Chinese Medical College of Southern Medical University，Guangzhou，Guangdong 510515，China］

Objective To exp lore the effect of Lycium barbarrum polysaccharides（LBP）on receptor 1 of glutamic acid（GluR1）in hippocampus and cognitive function of schizophrenia rats.Methods Thirty-six SD rats were randomly divided into 3 groups with 12 in each group：normal group，model group and LBP group.Model group and LBP group were given MK801（0.6mg/kg·d）with sinistro-intraperitoneal injection to set the schizophrenia model.At the same time，LBP group was administered intragatrically with 100 mg/kg·d LBP.The control group was injected with 0.9%saline（NS）in the corresponding period.The behavioral changes of each ratwere separately assessed with Morris experiment，and the navigation and time space exploration were compared between the three groups.Using immunofluorescence and Western blot，the GluR1 protein expression in hippocampus was determined.Results The model group had higher amount of exercise，ataxia，stereotyped behavior score and GluR1 expression in hippocampus than the control group（P＜0.01）.LBP group had significantly lower amount of exercise，ataxia，stereotyped behavior score and GluR1 expression in hippocampus than the model group（P＜0.01）.ConclusionsLBP plays a protective role for schizophrenia，its mechanism may be due to down-regulation of GluR1 expression in the hippocampus of schizophrenia rats.

Lycium barbarrum polysaccharide；schizophrenia；hippocampus；glutamate receptor 1；cognitive function

R 749

A

10.3969/j.issn.1005-8982.2016.14.004

1005-8982（2016）14-0017-05

2016-03-27