唐氏綜合征細胞黏附分子在APP轉基因小鼠海馬中的表達變化及其意義

賈永林，張保華，付志新，賈延劼

（1.河南省開封市中心醫院 神經內科，河南 開封 475000；2.鄭州大學第一附屬醫院 神經內科，河南 鄭州 450052）

論著

唐氏綜合征細胞黏附分子在APP轉基因小鼠海馬中的表達變化及其意義

賈永林1，張保華1，付志新1，賈延劼2

（1.河南省開封市中心醫院 神經內科，河南 開封 475000；2.鄭州大學第一附屬醫院 神經內科，河南 鄭州 450052）

目的觀察唐氏綜合征細胞黏附分子（DSCAM）在淀粉樣前蛋白（APP）轉基因小鼠海馬中的表達變化規律，探討其意義。方法選擇月齡分別為1、3、6和12個月的APP轉基因和野生型小鼠，應用免疫組織化學法對腦切片進行染色，觀察DSCAM在APP轉基因小鼠腦中的表達，應用蛋白免疫印跡法（Western blot）檢測該蛋白在海馬中表達量的變化規律，野生型小鼠做對照。結果DSCAM主要在APP轉基因小鼠大腦皮層、海馬的錐體細胞中表達。在兩組小鼠中，DSCAM在海馬中的表達水平隨年齡增長而下降（P<0.05）。DSCAM在APP轉基因小鼠海馬中的表達量明顯高于同齡野生型小鼠（P<0.05）。結論DSCAM在APP轉基因小鼠海馬內的過度表達可能在APP小鼠的學習和記憶能力下降中扮演重要角色。

唐氏綜合征細胞黏附分子（DSCAM）；APP轉基因小鼠；海馬；癡呆

唐氏綜合征（down syndrome，DS）的顯型是由21號染色體上的特殊基因控制區所決定的，即唐氏綜合征關鍵區（down syndrome critical region，DSCR）。在唐氏綜合征關鍵區上的基因數量的增加從而引起其產物的過度表達被認為是引起DS臨床表現的原因[1-2]。在DS中的神經病理學發現包括了先天或后天發育的畸形以及和提前出現的癡呆相關的變化。前者包括了大腦皮質中顆粒細胞的減少，這很可能與aspinous星形細胞類型相關[3]。研究發現，唐氏綜合征的患者從嬰兒到成人發育的過程中，腦內神經元突觸棘減少和神經元胞體上的異常的棘突樣結構[4-5]。在唐氏綜合征的患者的前額和海馬皮層中也發現了與年齡相關癡呆的老年斑和神經纖維纏結，這與阿爾茨海默病中的病理改變酷似。唐氏綜合征細胞黏附分子基因定位于21號染色體的q22.2～q22.3的DSCR上。該分子的序列和免疫球蛋白超家族的分子序列具有同源性[5]，提示它作為一個黏附分子的功能。研究發現，唐氏綜合征細胞黏附分子（down syndrome cell adhesion molecule，DSCAM）在生長發育期的多數神經系統中表達，并證實其參與了神經元的遷移、分化、增殖、生長發育、連接、維護、軸突導向、靶向作用、突觸間的識別、自我回避及突觸的可塑性，并最終形成正確的神經元連接和神經網絡[5-8]。其廣泛表達提示，DSCAM的過度表達破壞了腦的生長發育和突觸的可塑性，因此可能參與了DS患者的早老性癡呆、精神發育遲滯以及周圍神經缺陷。

在先前研究中筆者發現，DSCAM也在淀粉樣前蛋白（amyloid precursor protein，APP）轉基因小鼠大腦皮層中呈現過度表達[3]。與DSCAM過度表達相關的APP的過度表達提示兩者之間可能存在相互調控作用，或者APP過度表達所致的神經病理改變導致了反應性的DSCAM過度表達，如阿爾茨海默病（alzheimer disease，AD）樣斑的沉積和神經纖維纏結。APP轉基因小鼠也表現出與年齡相關的海馬學習和記憶缺陷，甚至先于淀粉樣前體蛋白(Aβ蛋白)的大量沉積。因此，筆者進一步研究了APP轉基因小鼠海馬中的與年齡相關DSCAM的表達變化。

1　材料與方法

1.1實驗動物

APP轉基因小鼠（采用隔代回交法將轉基因鼠攜帶的APP基因導入遺傳背景清晰的近交系小鼠C57BL/6J中，建立C57BL/6J-APP同源導入近交系小鼠）由中國醫學科學院中國協和醫科大學實驗動物研究所提供。月齡分別為1、3、6和12個月。同月齡野生型同種系小鼠做為對照組。

1.2主要試劑

DSCAM的一抗（16sc-79437）購自美國Santa Cruz公司，二抗（SP-9001）免疫組織化學試劑盒購自北京中杉金橋生物技術有限公司，Cy3標記的山羊抗兔免疫球蛋白G（immunoglobulin G，IgG）（H+L A0516）購自上海市碧云天生物技術研究所，水合氯醛、多聚甲醛及其他試劑均為國產分析純。

1.3主要方法

1.3.1樣本采集用10%水合氯醛將實驗用小鼠以0.3～0.4ml/100 g進行腹腔注射麻醉后，其四肢固定于解剖盤中，在劍突以下打開腹腔，穿過橫膈，游離出心臟組織。從左心室插入灌流針并固定，剪開右心耳，50m l注射器從心臟灌注溫生理鹽水，至灌出液變清，再用4%的多聚甲醛溶液經心臟灌注至小鼠死亡，斷頭取出全腦，4%的多聚甲醛溶液將所有腦組織進行固定2周。

1.3.2免疫組織化學法將固定過的小鼠全腦用石蠟包埋，切成4μm厚的切片，切片脫蠟至水，90℃微波處理9min，以恢復DSCAM對抗血清DSCAM-2的抗原性。3%過氧化氫H2O2去離子水孵育10min，用以消除內源性過氧化物酶活性，用封閉用正常山羊血清阻斷非特異性結合，室溫孵育30min，傾去，勿洗，用抗DSCAM抗體（稀釋至1∶50）將切片在4℃孵育過夜，隨后用生物素標記山羊抗兔IgG抗體生物素化30min后，在室溫下用辣根酶標記鏈霉卵白素工作液孵育30min。每兩個步驟之間，切片用磷酸鹽緩沖液（pH：7.2，氯化鈉NaCl：8.0 g，磷酸二氫鉀KH2PO4：0.20 g，氯化鉀KCl：0.20 g，水合磷酸氫二鈉Na2HPO4·H2O：1.56 g）充分清洗3次，每次3min。在50mmol/L的氨基丁三醇氯化氫溶液（pH：7.4）中，用0.02%的3，3'-二氨基聯苯胺和0.006%過氧化氫作用2min，再用蘇木素將切片進行對比染色，用適當的封片劑封片。

1.3.3蛋白免疫印跡法（Western blot）檢測樣本來自于月齡分別為新生、1、3、6和12個月的APP轉基因陽性小鼠和陰性對照小鼠的海馬。樣本取出后立即置入-80℃冰箱中冷凍保存。用標準方法完成對蛋白質印跡的分析。蛋白質的提取：解凍標本并在氨基丁三醇/鹽緩沖液（50 mmol/L氨基丁三醇，150 mmol/L氯化鈉，5mmol/L依地酸鈣鈉酸四鈉，2mmol/L苯甲磺酰基氟化物，1μg/ml胃酶抑素A，1μg/ml N-α-p-甲苯磺酰基-L賴氨酸氯甲基酮，pH：7.6和1%曲拉通X-100）中均勻加工處理。離心后收集上清液，用Bradford法對蛋白進行含量測定。樣品（30或60μg/泳道）在6%的SDS-聚丙烯酰胺凝膠上進行電泳分離，而后電泳轉移到硝酸纖維素膜上。用考馬斯亮藍對膜的未用部分染色，證實同樣數量的蛋白已經被裝載并轉運。用8%的脫脂乳封閉后（室溫1 h），隨之用含有1∶200的抗血清的膜孵育（4℃過夜），再用含辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔IgG（1∶1 000）的膜在室溫下孵育1 h。用電化發光系統，蛋白質條帶在載膜上完全顯現出來，用放射自顯影膠片（電化發光計算機膠片；載膜）檢測到化學發光。分析底片上條帶的光密度值，以同一膜上靶蛋白光密度/β-肌動蛋白光密度，其比值作為目的蛋白的相對光密度值。

1.4統計學方法

采用SPSS 16.0統計軟件進行數據分析，計量資料用均數±標準差（）表示，多組間比較用單因素方差分析（ANOVA）（見表1），組間兩兩比較用最小顯著性差異法（LSD法），P<0.05為差異有統計學意義。

表1　單因素方差分析對多組間比較

2　結果

2.1DSCAM在APP轉基因小鼠腦內的表達部位

免疫組織化學法發現，DSCAM主要在野生對照小鼠（見圖1A、1C、1E）和APP轉基因小鼠（見圖1B、1D、1F）大腦皮層、小腦浦肯野細胞、海馬錐體細胞、海馬齒狀回的顆粒細胞層、丘腦以及腦干神經元中表達，主要分布在胞膜的周邊，在浦肯野細胞的軸突內也發現DSCAM的表達。

2.2DSCAM在不同月齡和不同基因型小鼠海馬中的表達

Western blot證實，在APP轉基因小鼠和野生型小鼠中，隨著小鼠月齡的增加，DSCAM在海馬中的表達量逐漸減少（P<0.05），到達3個月時，DSCAM的表達量達到高峰，1個月齡小鼠較3個月齡小鼠DSCAM的表達量差異無統計學意義（P>0.05）。DSCAM在APP轉基因小鼠海馬中的表達量明顯高于同月齡的野生型對照組小鼠，差異有統計學意義（P<0.05）。結果顯示DSCAM在APP轉基因小鼠海馬內存在過度表達。見表2、圖2。

圖1　DSCAM在小鼠腦內的表達部位

表2　DSCAM在每組小鼠海馬中表達的相對光密度值Western blo t（n=10，%，）

表2　DSCAM在每組小鼠海馬中表達的相對光密度值Western blo t（n=10，%，）

注：野生型組1個月與3個月比較，P=0.540；野生型3個月與6個月比較，P=0.000；野生型6個月與12個月比較，P=0.000；轉基因組1個月與3個月比較，P=0.736；轉基因組3個月與6個月比較，P=0.000；轉基因組6個月與12個月比較，P=0.000

組別12個月野生型　51.1±1.783　50.7±1.590　42.7±1.631　35.2±1.488轉基因　80.1±1.273　79.9±1.336　45.6±1.325　40.2±1.085 P值　0.000　0.000　0.000　0.000 1個月3個月6個月

圖2　DSCAM在APP轉基因小鼠和同月齡野生型小鼠海馬中的表達 （n=10）

3　討論

通常認為，轉基因模型的表型是由導入或刪除的基因所決定的。在本研究中筆者發現，DSCAM在APP轉基因小鼠海馬中存在顯著的過度表達，提示DSCAM的表達異常可能參與APP小鼠的神經病理學上的改變和行為表型。實際上，這些小鼠甚至在老年斑形成之前就已經被證實出現學習和記憶缺陷。DSCAM在可塑性強的海馬神經元中的表達增加是學習和記憶的關鍵。研究發現，包含胞內域的截短的DSCAM在突觸后的過度表達阻斷AMPA受體的聚集，而AMPA受體的聚集則是突觸可塑性持久表達所必須的，突觸可塑性持久表達則是海兔學習的基礎[9]。因此，DSCAM的過度表達可能導致APP小鼠的某些表型，但仍需要更多的研究來證明這種假設。

老年斑和β淀粉樣蛋白沉積是AD患者和中年DS受試者神經病理學核心特征。在DS中額外的APP基因導致了Aβ淀粉樣蛋白早期沉積。DSCAM在衰老斑的核心和神經突觸中的免疫反應提示DSCAM在空斑形成中的作用。而且，DSCAM的過度表達可能通過抑制突觸生成和軸突生長的機制導致DS發病[6]。實際上DS患者并沒有AD患者類似的神經病理學特征，提示DS患者的認知功能缺陷可能是DSCAM的過度表達所致。

研究發現，DSCAM廣泛表達在APP轉基因小鼠大腦皮層、小腦浦肯野細胞、海馬、丘腦及腦干神經元中[3]，這些區域涉及腦的許多種高級功能，如軀體感覺信息的輸入和加工處理、隨意運動、運動的學習、外顯學習和記憶。DSCAM在APP轉基因小鼠海馬中的表達明顯高于同月齡野生對照組，特別是在小鼠青年期。外顯記憶依賴連接齒狀顆粒細胞和海馬錐體細胞的完整的纖維以及連接海馬和其他腦區的通路，例如海馬與額葉皮層間通路。有關果蠅的研究證實DSCAM的過度表達和表達不足均會導致有缺陷軸突導向以及異常的神經網絡的形成[10]。10%～13%的DSCAM胚胎雜合子就導致了Bolwig神經的軸突導向缺陷[25]進一步提示神經元可能對DSCAM的劑量特別敏感。此外，對海兔和果蠅的研究表明，在一些條件下免疫球蛋白超家族神經蛋白量的增加會抑制突觸生長或遷移[10]。因此，過度表達的DSCAM可能引起可在DS患者中看到的異常的架構和皮層缺陷[11]。

筆者研究發現，DSCAM在APP轉基因小鼠小腦中的過度表達可能涉及小鼠的學習運動能力和運動協調能力的缺陷，并在其中扮演重要角色[12]。在此筆者提出DSCAM在海馬中的過度表達可能參與APP轉基因小鼠的學習和記憶缺陷，其機制可能是通過改變神經細胞的黏附性，抑制突觸和/或神經突的生長，擾亂軸突導向和正常的神經連接結構來實現的。此外DSCAM可能促進衰老斑的形成或者增強這些包涵體的神經變性潛力。仍有必要進一步研究DSCAM是否在DS和AD患者的海馬中存在過度表達，APP與DSCAM在表達上和功能上如何相互作用，以及DSCAM是否和怎樣獨自改變作為學習和記憶的基礎的突觸塑形過程。

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（張西倩編輯）

Expression of Down syndrome cell adhesion molecule in hippocampus of APP transgenicm ice and its significance

Yong-lin Jia1，Bao-hua Zhang1，Zhi-xin Fu1，Yan-jie Jia2
（1.Department of Neurology，the Central Hospital of Kaifeng，Kaifeng，Henan 475000，China；2.Department of Neurology，the First Affiliated Hospital of Zhengzhou University，Zhengzhou，Henan 450052，China）

Objective To investigate the changing regularity of the Down syndrome cell adhesion molecule（DSCAM）expression in the brain of amyloid precursor protein（APP）transgenic mice and explore the significance of DSCAM expression.Methods With immunohistochemistry and Western blot，the expression of DSCAM in the brains of APP transgenic mice（aged 1m，3m，6m and 12m），especially the expression pattern and location in hippocampus were detected.The control group included age-matched wide type mice.Results DSCAM was widely expressed in the cerebral cortex and hippocampal pyramidal cell layer in the APP transgenic mice.The expression of DSCAM decreased with age in the hippocampus of APP transgenic and wild-typemice（P＜0.05）.The hippocampus expression level of DSCAM in the APP transgenic mice was higher than that in the wild-typem ice（P＜0.05）.There was no significant difference in DSCAM expression between 1-month old and 3-month old mice（P＞0.05）.Conclusions We propose that over expression of DSCAM in the hippocampus might play an important role in the learning and memory defects of APP transgenic mice.

Down syndrome cell adhesion molecule；APP transgenic mouse；hippocampus；dementia

R 329；R 725.9

A

10.3969/j.issn.1005-8982.2016.14.005

1005-8982（2016）14-0022-05

2015-12-31

賈延劼，E-mail：jiayanjie1971@yahoo.com.cn；Tel：0371-66295112