Brahma相關基因1在脂多糖誘導的急性肝炎中的作用

劉顯灼，艾芬

（湖北省武漢市中心醫(yī)院 急診科，湖北 武漢 430014）

論著

Brahma相關基因1在脂多糖誘導的急性肝炎中的作用

劉顯灼，艾芬

（湖北省武漢市中心醫(yī)院 急診科，湖北 武漢 430014）

目的觀察Brahma相關基因1（BRG1）在脂多糖（LPS）誘導的急性肝炎中的表達變化，并觀察干預BRG1表達對炎癥因子分泌的影響。方法體內實驗，腹腔注射LPS（2.5mg/kg）構建小鼠肝炎模型，通過免疫組織化學及蛋白免疫印跡法（Western blot）檢測BRG1的表達變化；體外實驗，在人肝細胞HepG2及HepaRG培養(yǎng)基中加入LPS（100 ng/m l），Western blot檢測BRG1的表達變化，轉染BRG1質粒或特異性siRNA，通過ELISA檢測白細胞介素1（IL-1）、白細胞介素6（IL-6）及腫瘤壞死因子α（TNF-α）等促炎因子的分泌。結果體內實驗，腹腔注射LPS（2.5mg/kg）可以顯著誘導小鼠的肝細胞壞死，肝細胞核濃聚，肝小葉組織結構破壞及ALT、AST的水平明顯升高；同時LPS處理后肝細胞中的BRG1表達上升，BRG1在細胞核中濃聚。體外實驗，LPS（100 ng/m l）處理后的HepG2及HepaRG細胞中BRG1的表達升高。同時BRG 1過表達可顯著促進促炎因子IL-1、IL-6及TNF-α的釋放，相反BRG1沉默后可顯著抑制促炎因子IL-1、IL-6及TNF-α的釋放。結論LPS可促進小鼠肝臟中及體外培養(yǎng)肝細胞的BRG1蛋白表達，干預BRG 1表達可影響細胞釋放IL-1、IL-6及TNF-α的能力。

Brahma相關基因1；脂多糖；急性肝炎；促炎因子

SWI/SNF染色質重塑復合物是目前許多真核基因轉錄調控中的關鍵因素，BRG1作為SWI/SNF的催化酶，不僅廣泛參與包括細胞周期調控和細胞分化在內的多種細胞活動，在胚胎發(fā)育和腫瘤抑制中也發(fā)揮著重要的作用。如AGALIOTI等人[1]的研究表明BRG1通過靶向調節(jié)特定核小體的重塑活動，介導SWI/SNF復合物參與調控炎癥反應的動力學效應；BRG1可調節(jié)細胞間黏附分子的水平，促進白細胞的黏附作用[2-3]；BRG1也可調控調節(jié)性T細胞（regulatory T cells，Tregs）的活性[4]。但BRG1自身在炎癥發(fā)展過程中的表達及其對于促炎因子的影響并不十分清楚。細菌脂多糖（Lipopolysaccharides，LPS）作為革蘭氏陰性桿菌細胞壁的主要成分，具有內毒素的作用，能夠激活機體的免疫應答。本研究中，筆者在C57BL小鼠腹腔注射LPS（2.5mg/kg）構建體內的肝炎模型，在人肝細胞HepG2及HepaRG培養(yǎng)基中加入LPS（100 ng/m l）建立體外模型，分別檢測BRG1的蛋白表達變化，并觀察干預BRG1表達對細胞中促炎因子分泌的影響。

1　材料與方法

1.1材料

雌性C57BL小鼠購自武漢大學實驗動物中心，動物實驗受武漢市中心醫(yī)院、華中科技大學附屬同濟醫(yī)學院醫(yī)學倫理委員會批準。人肝癌細胞HepG2及人永生化正常肝細胞HepaRG購自中科院上海細胞庫，以含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基常規(guī)培養(yǎng)于5%二氧化碳CO2，37℃培養(yǎng)箱中。

胎牛血清、RPMI 1640培養(yǎng)基購自武漢啟動子生物有限公司，轉染試劑Lipofectamine2000購自美國Invitrogen公司，BRG1、GAPDH抗體購自美國Santa Cruz公司，促炎因子白細胞介素1（Interleukin 1，IL-1）、白細胞介素6（Interleukin 6，IL-6）及腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor a，TNF-a）酶聯(lián)免疫吸附實驗 (enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)試劑盒購自武漢博士德生物有限公司，BRG1質粒購自山東維真生物有限公司，并經(jīng)測序檢測，BRG1特異性siRNA（序列為5'-GGACCUGAAUGA GGAGGAA-3'）及LPS購自美國Sigma公司。

1.2實驗方法

1.2.1動物模型及藥物誘導將8～9周齡的C57BL雌性小鼠飼養(yǎng)于華中科技大學同濟醫(yī)學院基礎醫(yī)學院免疫學系動物中心，遵循12 h/12 h晝夜節(jié)律，自由進食飼料及飲水。按照小鼠體重給以腹腔注射LPS（2.5mg/kg）作為實驗組，給以等量生理鹽水（NS）腹腔注射作為對照組，每組8只，8 h后處死小鼠，分別取肝臟組織及血清樣本行相關檢測。該實驗得到華中科技大學同濟醫(yī)學院及武漢市中心醫(yī)院倫理委員會的批準。

1.2.2細胞藥物處理及轉染LPS以100 ng/ml的終濃度處理HepG2及HepaRG細胞，等量生理鹽水作為對照組，8 h后收集細胞培養(yǎng)基上清及細胞行相關檢測。BRG1過表達質粒及特異性siRNA按照Lipofectamine 2000試劑說明書常規(guī)轉染48 h后行相關檢測，以空質粒及無意亂序siRNA作為實驗的陰性對照組。

1.2.3ELISA檢測細胞分泌IL-1、IL-6及TNF-α將HepG2及HepaRG細胞以1×106個/孔密度接種于6孔板，按照上述方法轉染質粒或siRNA，常規(guī)培養(yǎng)48 h后，吸取細胞培養(yǎng)基上清，離心去固體沉淀后按照 ELISA試劑盒檢測其中的 IL-1、IL-6及TNF-α含量，并以轉染空質粒及無意亂序siRNA組作為1，計算相對的蛋白含量繪圖。相同實驗重復3次。

1.2.4蛋白免疫印跡法（Western blot）實驗收集肝臟組織并勻漿，收集LPS處理后或轉染處理后的HepG2及HepaRG細胞，加入適量RIPA裂解液(每1×106個細胞加入100μl裂解液)，獲取細胞總蛋白液，加入SDS上樣緩沖液100℃水浴解除蛋白交聯(lián)。各組蛋白樣品行聚丙烯酰胺凝膠電泳，PVDF膜轉膜并用脫脂奶粉封閉1 h，然后依次孵育一抗4℃過夜及辣根過氧化物酶標記的Ⅱ抗室溫1 h后化學發(fā)光法顯影，檢測細胞中BRG1表達情況，以GAPDH作為內參。

1.2.5免疫組織化學法收集LPS處理后的小鼠肝臟加入多聚甲醛固定、石蠟包埋、切片，并行HE染色及BRG1的免疫組織化學染色。在普通光學顯微鏡下觀察肝細胞變化及BRG1的陽性細胞數(shù)和染色強弱。

1.3統(tǒng)計學方法

采用SPSS 12.0統(tǒng)計學軟件進行數(shù)據(jù)分析，計量資料用均數(shù)±標準差（）表示，組間比較用t檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2　結果

2.1LPS對小鼠肝炎模型中BRG 1表達的影響

將LPS處理后及對照組的小鼠肝臟行HE染色及免疫組織化學染色，結果提示腹腔注射LPS（2.5 mg/kg）可以顯著誘導小鼠肝炎發(fā)生，表現(xiàn)為肝細胞壞死，肝細胞核濃聚，肝小葉組織結構破壞，同時伴隨ALT及AST的水平明顯升高；同時觀察到LPS處理后肝細胞中的BRG1表達上升，BRG1在細胞核中濃聚。同時將肝組織裂解，Western blot實驗同樣提示肝細胞中的BRG1的表達升高（見圖1）。

圖1　LPS對小鼠肝炎模型中BRG 1表達的影響

2.2LPS對體外培養(yǎng)肝細胞中的BRG 1表達及促炎因子釋放的影響

將LPS（100 ng/m l）處理后的HepG2及HepaRG細胞及細胞培養(yǎng)基上清分別行Western blot實驗和ELISA實驗檢測，結果提示LPS可顯著促進細胞中BRG1的表達，并且升高細胞培養(yǎng)基上清中的IL-1、IL-6及TNF-α含量。IL-1：HepG2+LPS vs HepG2，（13.541±0.140）vs（1.000±0.021），P<0.05；HepaRG+LPS vs HepaRG，（10.010±0.242）vs（1.000±0.112），P<0.05。 IL-6：HepG2+LPS vs HepG2，（9.431±0.262）vs（1.000±0.051），P<0.05；HepaRG+LPS vs HepaRG，（16.321±0.502）vs（1.000±0.050），P<0.05。TNF-α：HepG2+LPS vs HepG2，（15.231±0.153）vs（1.000±0.071），P<0.05；HepaRG+LPS vs HepaRG，（7.923±0.114）vs（1.000±0.020），P<0.05（見圖2和表1）。

圖2　LPS對體外培養(yǎng)肝細胞中的BRG 1表達及促炎因子釋放的影響

表1　LPS對體外培養(yǎng)肝細胞中的BRG1表達及促炎因子釋放的影響 （）

表1　LPS對體外培養(yǎng)肝細胞中的BRG1表達及促炎因子釋放的影響 （）

組別HepaRG+LPS IL-1　1.000±0.021　13.541±0.140 1.000±0.112　10.010±0.242 IL-6　1.000±0.051　9.431±0.262　1.000±0.050　16.321±0.502 TNF-α　1.000±0.071　15.231±0.153 1.000±0.020　7.923±0.114 HepG2 HepG2+LPS HepaRG

2.3BRG 1過表達對促炎因子釋放的影響

將轉染BRG1過表達質粒后的HepG2及HepaRG的細胞培養(yǎng)基上清行ELISA實驗檢測，結果提示BRG1過表達可顯著促進促炎因子IL-1、IL-6及TNF-α 的釋放。IL-1：HepG2+BRG1 vs HepG2，（6.881±0.154）vs（1.000±0.022），P<0.05；HepaRG+BRG1 vs HepaRG，（6.313±0.211）vs（1.000±0.031），P<0.05。 IL-6：HepG2+BRG1 vs HepG2，（6.010±0.263）vs（1.000±0.020），P<0.05；HepaRG+ BRG1 vs HepaRG，（12.161±0.493）vs（1.000±0.010），P<0.05。TNF-α：HepG2+BRG1 vs HepG2，（9.134±0.122）vs（1.000±0.024），P<0.05；HepaRG+ BRG1 vs HepaRG，（7.783±0.111）vs（1.002±0.014），P<0.05（見圖3和表2）。

2.4 BRG 1沉默對促炎因子釋放的影響

將轉染BRG1特異性siRNA后的HepG2及HepaRG的細胞培養(yǎng)基上清行ELISA實驗檢測，結果提示BRG1沉默后可顯著抑制促炎因子IL-1、IL-6及 TNF-α 的釋放。IL-1：HepG2+siBRG1 vs HepG2，（0.161±0.030）vs（1.000±0.020），P<0.05；HepaRG+siBRG1 vs HepaRG，（0.163±0.014）vs（1.000±0.102），P<0.05。IL-6：HepG2+siBRG1 vs HepG2，（0.200±0.011）vs（1.000±0.051），P<0.05；HepaRG+siBRG1 vs HepaRG，（0.084±0.051）vs（1.002±0.050），P<0.05；TNF-α：HepG2+siBRG1 vs HepG2，（0.113±0.024）vs（1.000±0.071），P<0.05；HepaRG+siBRG1 vs HepaRG，（0.153±0.033）vs（1.001±0.020），P<0.05（見圖4和表3）。

圖3　BRG1過表達對促炎因子釋放的影響

表2　BRG 1過表達對促炎因子釋放的影響 （）

表2　BRG 1過表達對促炎因子釋放的影響 （）

組別HepaRG+BRG1 IL-1　1.000±0.022　6.881±0.154 1.000±0.031　6.313±0.211 IL-6　1.000±0.020　6.010±0.263 1.000±0.010　12.161±0.493 TNF-α　1.000±0.024　9.134±0.122 1.002±0.014　7.783±0.111 HepG2 HepG2+BRG1 HepaRG

圖4　BRG1沉默對促炎因子釋放的影響

表3　BRG 1沉默對促炎因子釋放的影響 （）

表3　BRG 1沉默對促炎因子釋放的影響 （）

組別HepaRG+siBRG1 IL-1　1.000±0.020　0.160±0.030　1.000±0.102　0.163±0.014 IL-6　1.000±0.051　0.200±0.011　1.002±0.050　0.084±0.051 TNF-α　1.000±0.071　0.113±0.024　1.001±0.020　0.153±0.033 HepG2 HepG2+siBRG1 HepaRG

3　討論

目前研究表明，炎癥激活時，如在LPS刺激下，核因子κB（nuclear factor κB，NF κB）中的p65亞基可磷酸化進入細胞核，結合于炎癥因子的啟動子區(qū)域。而且BRG1自身也可與NFκB中的p65亞基相結合，那么是否BRG1也是通過類似的募集過程，參與炎癥反應的動力學過程調控[5-6]。本研究提示LPS刺激下BRG1的表達水平在體內肝臟組織中及體外肝細胞中都有明顯的升高，尤其在體內實驗中發(fā)現(xiàn)，在LPS激活炎癥的過程中，BRG1在細胞核中發(fā)生濃聚效應，有可能通過募集于促炎因子的核小體附近，重塑其染色質結構，增加細胞中IL-1、IL-6及TNF-α的釋放。

BRG1是SW I/SNF復合體中的關鍵催化亞基，它通過對ATP水解為整個復合體供能使染色體結構發(fā)生改變，進而導致基因序列上啟動子結合位點暴露、易化轉移因子等轉錄調控蛋白的結合，從而參與調控目的基因的表達[7]。SWI/SNF催化亞基的降解，抑制其活性染色質重塑。現(xiàn)已有文獻報導，BRG1在心肌發(fā)育、神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育過程中有十分重要的作用，相關數(shù)據(jù)提示，抑制BRG1的表達將導致心肌發(fā)育以及中樞神經(jīng)系發(fā)育障礙[8-10]。本研究發(fā)現(xiàn)，抑制細胞中BRG1的表達，能夠顯著下調促炎因子的分泌，而過表達BRG1相反可以促進IL-1、IL-6及TNF-α的分泌，這提示BRG1在LPS誘導的急性炎癥過程中可能扮演著重要的角色。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)，LPS誘導的小鼠急性肝炎中，BRG1的蛋白表達水平顯著上升，并在細胞核中濃聚。而LPS作用于體外培養(yǎng)的肝細胞，也可明顯促進細胞中BRG1的表達。同時肝臟細胞中過表達BRG1，可促進促炎因子IL-1、IL-6及TNF-α的釋放。相對應的，BRG1沉默后可顯著抑制肝細胞促炎因子IL-1、IL-6及TNF-α的釋放。這提示BRG1在LPS誘導的急性炎癥過程中可能扮演著重要的角色，干預其表達有望作為治療急性炎癥的潛在藥物靶點。

[1]AGALIOTI T,LOMVARDAS S,PAREKH B,et al.Ordered recruitment of chromatin modifying and general transcription factors to the IFN-beta promoter[J].Cell,2000,103(4):667-678.

[2]CHEN D,FANG F,YANG Y,et al.Brahma-related gene 1 (Brg1)epigenetically regulates CAM activation during hypoxic pulmonary hypertension[J].Cardiovasc Res,2013,100(3):363-373.

[3]FANG F,CHEN D,YU L,et al.Proinflammatory stimuli engage Brahma related gene 1 and Brahma in endothelial injury[J].Circ Res,2013,113(8):986-996.

[4]CHAIYACHATI B H,JANI A,WAN Y,et al.BRG1-mediated immune tolerance:facilitation of Treg activation and partial independence of chromatin remodelling[J].EMBO J,2013,32(3): 395-408.

[5]KAWAHARA T L,MICHISHITA E,ADLER A S,et al.SIRT6 links histone H3 lysine 9 deacetylation to NF-kappa B-dependent gene expression and organismal life span[J].Cell,2009,136(1): 62-74.

[6]NATOLI G,CHIOCCA S.Nuclear ubiquitin ligases,NF-kappa B degradation,and the control of inflammation[J].Sci Signal,2008, 1(1):1.

[7]W ILSON B G,ROBERTS CW M.SWI/SNF nucleosome remodellers and cancer[J].Nature Reviews Cancer,2011,11(7):481-492.

[8]HANG C T,YANG J,HAN P,et al.Chromatin regulation by Brg1 underlies heart muscle development and disease[J].Nature, 2010,466(7302):62-67.

[9]WEIDER M,KüSPERT M,BISCHOF M,et al.Chromatin-remodeling factor Brg1 is required for schwann cell differentiation and myelination[J].Developmental Cell,2012,23(1):193-201.

[10]LIMPERT A S,BAI S,NARAYAN M,et al.NF-B forms a complex with the chromatin remodeler BRG1to regulate schwann cell differentiation[J].Journal of Neuroscience,2013, 33(6):2388-2397.

（張蕾編輯）

Effect of BRG1 in acute hepatitis induced by lipopolysaccharides

Xian-zhuo Liu，F(xiàn)en Ai
（Emergency Department，Wuhan Central Hospital，Wuhan，Hubei430014，China）

Objective To observe the expression of Brahma-related gene 1（BRG1）in acute hepatitis induced by lipopolysaccharide（LPS）and the effect of intervention of BRG1 expression on secretion of inflammatory factors. Methods For in vivo experiments，a hepatitis mouse model was constructed by intraperitoneal injection of LPS（2.5 mg/kg），then the expression of BRG1 was detected though immunohistochemical staining and Western blot.For in vitro experiments，LPS（100 ng/ml）was added in human liver cell line HepG2 and HepaRG culture media，and then，the expression of BRG1 was detected through Western blot.Meanwhile，BRG1 plasmid or specific siRNA was transfected into HepG2 and HepaRG cells，enzyme linked immunosorbent assay（ELISA）was performed to detect the IL-1，IL-6 and TNF-αsecretion.Results in vivo，intraperitoneal injection of LPS could obviously induce necrosis of hepatic cells and lobules，together with condensation of nuclei in mice.Meanwhile，the expression of BRG1 was enhanced in mouse hepatic cells after procession by LPS，and accumulated in nuclei.In vitro experiments showed the expression of BRG1 in HepG2 and HepaRG cells increased after treatment by LPS（100 ng/ml）.At the same time，the overexpression of BRG1 significantly promoted the release of pro-inflammatory cytokines IL-1，IL-6 and TNF-α；the silence of BRG1 inhibited the release of IL-1，IL-6 and TNF-α.Conclusions LPS could promote the expression of BRG1 protein both in vivo and in mouse liver cell lines，and intervention of BRG1 expression mightaffect the secretion of IL-1，IL-6 and TNF-α.

Brahma-related gene 1；lipopolysaccharide；acute hepatitis；pro-inflammatory factor

R-332

A

10.3969/j.issn.1005-8982.2016.14.006

1005-8982（2016）14-0027-05

2015-12-25

艾芬，E-mail：13006191071@163.com；Tel：13006191071