庫欣綜合征中FHIT、Ki-67、PCNA的表達及相關因素的研究*

冼晶，黃高明，梁秀就，黃松，蔡勁薇，李勵，盧德成，羅佐杰

（1.廣西醫科大學第一附屬醫院 內分泌科，廣西 南寧 530021；2.廣西醫科大學公共衛生學院 流行病學與統計學教研室，廣西 南寧 530021；3.廣西醫科大學第一附屬醫院 病理科，廣西 南寧 530021）

論著

庫欣綜合征中FHIT、Ki-67、PCNA的表達及相關因素的研究*

冼晶1，黃高明2，梁秀就3，黃松1，蔡勁薇1，李勵1，盧德成1，羅佐杰1

（1.廣西醫科大學第一附屬醫院 內分泌科，廣西 南寧 530021；2.廣西醫科大學公共衛生學院 流行病學與統計學教研室，廣西 南寧 530021；3.廣西醫科大學第一附屬醫院 病理科，廣西 南寧 530021）

目的探討庫欣綜合征腎上腺皮質病變中腫瘤抑制基因脆性組氨酸三聯體（FHIT）、腫瘤增殖抗原Ki-67、增殖細胞核抗原（PCNA）的表達，探索鑒別庫欣綜合征腎上腺皮質病變的相關因素。方法應用免疫組織化學方法檢測49例庫欣綜合征腎上腺皮質病變（腺癌14例、腺瘤26例、增生9例）中FHIT、Ki-67、PCNA的表達，對臨床病理及生化指標采用有序結果的累積比數Logistic回歸分析探索鑒別庫欣綜合征皮質病變的相關因素。結果FHIT在腎上腺皮質增生中表達最高，腺瘤次之，腺癌最低（分別為100%、96.15%和42.96%），Ki-67與PCNA在腎上腺皮質腺癌的表達最高，腺瘤次之，增生最低（分別為85.71%、7.69%、0.00%和100%、96.15%、77.78%）。應用Logistic回歸分析發現FHIT、PCNA兩個因素與鑒別腺癌、腺瘤、增生的關系更為密切。結論FHIT、Ki-67和PCNA的表達與庫欣綜合征腎上腺皮質病變密切相關。Logistic回歸分析提示FHIT、PCNA與鑒別診斷的關系更為密切。

庫欣綜合征；FH IT；Ki-67；PCNA；Logistic回歸分析

庫欣綜合征（Hypercortisolism，cushing syndrome）腎上腺皮質病變表現為皮質腺癌、腺瘤及增生。3者在臨床上均可表現為庫欣綜合征，但治療方法及預后各不相同，而在臨床及病理形態學的鑒別診斷上有較大難度[1]。目前尚未見庫欣綜合征腎上腺皮質腺癌、腺瘤、增生的診斷相關因素的研究報道。本研究應用免疫組織化學方法，檢測庫欣綜合征腎上腺皮質病變（腺癌、腺瘤及皮質增生）中腫瘤抑制基因脆性組氨酸三聯體（fragile histindine triad，FHIT）、腫瘤增殖抗原Ki-67（Ki-67 nuclear antigen，Ki-67）、增殖細胞核抗原（proliferation cell nuclear antigen，PCNA）的表達并探討它們與皮質病變的關系。對庫欣綜合征的各項臨床病理及生化指標進行Logistic回歸分析，探討鑒別庫欣綜合征腎上腺皮質腺癌、腺瘤、增生的相關因素，旨在尋找在庫欣綜合征腎上腺皮質病變中有鑒別診斷意義的客觀指標。

1　資料與方法

1.1一般資料

組織標本為廣西醫科大學第一附屬醫院2005～2012年手術切除、經病理證實的庫欣綜合征腎上腺皮質病變石蠟包埋標本49例。其中，腎上腺皮質腺癌14例，腺瘤26例，增生9例；男性19例（37.5%），女性30例（62.5%）；年齡5~68歲，平均（35.84±16.18）歲。全部病例都有Cushing綜合征典型的臨床癥狀、體征和實驗室改變。全部病例行小劑量地塞米松抑制試驗均不被抑制。該研究獲得本單位倫理委員會的批準及受試者簽署的知情同意書。

1.2檢測方法

采用EliVision TM super二步法，參照試劑盒說明書進行免疫組織化學染色。主要染色步驟：切片脫蠟和水化后抗原修復，一抗FHIT（工作濃度1∶100）、Ki-67（即用型）、PCNA（即用型）室溫下孵育60min，然后滴加放大劑、多聚酶結合物，DAB顯色，復染等。兔抗人FHIT濃縮型多克隆抗體購自北京中山生物技術公司，鼠抗人Ki-67、PCNA單克隆抗體和EliVision TM super檢測試劑盒為福州邁新生物技術公司產品。

1.3結果判斷

根據多數文獻的判斷方法，綜合考慮切片中陽性細胞著色強度、陽性細胞占所觀察同類細胞數的百分比兩項指標，判斷免疫組織化學結果：細胞核或細胞質呈棕褐色或棕黃色顆粒者為陽性細胞。FHIT蛋白定位于細胞質。Ki-67、PCNA陽性定位于細胞核。按染色強度評分：無色0分，淺黃色1分，棕黃色2分，棕褐色3分；再按陽性細胞所占的百分比評分：陽性細胞<5%為0分，6%～25%為1分，26%～50%為2分，51%～75%為3分，>75%為4分。染色強度與陽性細胞百分比的乘積：0分為陰性（-），1～4分為弱陽性（+），5～8分為中等陽性（++），9～12分為強陽性（+++）。Ki-67陽性定位于細胞核，陽性細胞數<10%為陰性（-），陽性細胞數≥10%為陽性：其中10%～25%為弱陽性（+），25%～50%為中等陽性（++），>50%為強陽性（+++）[2-3]。

1.4統計學方法

所有數據均采用SPSS 19.0統計學軟件包進行處理。計量指標采用均數±標準差（）表示，組間差異比較用方差分析及其兩兩檢驗（q檢驗）；分類資料用率或構成比（%）表示，組間比較采用χ2檢驗或Fisher精確概率法，其兩兩比較采用Bonferroni檢驗水準調整法；因素篩選采用有序結果的累積比數Logistic回歸分析。P<0.05為差異有統計學意義。

2　結果

2.1激素及生化指標情況

血皮質醇各時間段3組間差異無統計學意義（P>0.05）。血促腎上腺皮質激素（adreno cortico tropic hormone，ACTH）8AM和0AM 2組間差異有統計學意義（P<0.05），而4PM組間差異無統計學意義（P>0.05）。24 h尿17-OH、24 h尿17-KS以及血鉀3組間差異均無統計學意義（P>0.05）。激素及生化指標情況見表1。

2.2庫欣綜合征腎上腺皮質病變中FHIT、Ki-67、PCNA的表達

庫欣綜合征腎上腺皮質病變中FHIT的表達，腺癌的總陽性率均較腺瘤（χ2=11.925，P=0.001）及皮質增生低（χ2=5.568，P=0.018）。腺癌總陽性率為42.86%，僅表現為弱陽性，其余全部為陰性。腺瘤與皮質增生在總陽性率的比較中無統計學意義（Fisher精確概率P=1.000）。見表2。

庫欣綜合征腎上腺皮質病變中Ki-67的表達，總陽性率的表達腺癌較腺瘤（χ2=21.041，P< 0.001）、皮質增生為高（χ2=12.878，P<0.001）。腺瘤與皮質增生在總陽性率的表達比較中無統計學意義（Fisher精確概率P=1.000）。見表3。

表1　激素及生化指標情況 （）

表1　激素及生化指標情況 （）

組別腺癌腺瘤皮質增生F值P值血皮質醇/（nmol/L）8AM　897.09±231.87　821.83±247.53　920.26±192.22　0.781　0.464 4PM　519.93±239.34　666.41±226.16　798.49±306.61　3.272　0.047 0AM　523.54±128.64　531.65±269.70　771.38±337.63　2.996　0.060血ACTH/（pmol/L）8AM　3.55±1.56　3.78±1.63　5.85±1.53　6.055　0.005 4PM　3.27±1.89　2.49±0.92　3.56±0.81　3.363　0.043 0AM　3.99±1.78　2.73±1.30　3.36±1.27　3.414　0.041 24 h尿17-OH/（μmol/L）21.20±10.08 16.29±8.96 15.71±5.58 1.487 0.237 24 h尿17-KS/（μmol/L）25.43±11.88 17.65±8.57 18.79±5.42 3.152 0.052血鉀/（mmol/L）3.69±0.59 3.32±0.65 3.30±0.79 1.489 0.236

表2　FHIT在皮質醇增多癥腎上腺病變中的表達　例（%）

庫欣綜合征腎上腺皮質病變中PCNA的表達，雖然腺瘤、腺癌、皮質增生3者的總陽性率總的差異無統計學意義（χ2=4.560，P=0.102），但是在分級比較中，腺癌在較高陽性（++/+++）的表達比腺瘤（χ2=4.660，P=0.031）及增生高（χ2=9.136，P=0.003）；腺瘤與增生差異無統計學意義（χ2=1.571，P=0.210）。見表4。

2.3庫欣綜合征腎上腺皮質病變中FHIT、Ki-67、PCNA表達與臨床指標的關系

49例組織標本中FHIT、Ki-67、PCNA表達與患者的年齡、性別、發病部位（左側或右側）無關（P> 0.05）。見表5。

2.4庫欣綜合征腎上腺皮質病變影響因素分析

分析庫欣綜合征與各項臨床及生化指標的關系，用logistic回歸作因素篩選。由于庫欣綜合征的組織學類型分為皮質增生、腺瘤、腺癌3類，屬有序多分類的資料，故采用有序結果的Logistic回歸分析。因素篩選采用逐步法，入選α水平為0.05，剔除α水平為0.10。方程的擬合優度檢驗：χ2=9.422，P=0.991>0.05，說明方程擬合效果好。分析結果表明：只有FHIT和PCNA 2個因素與庫欣綜合征腎上腺皮質病變有關，FHIT呈負相關，PCNA呈正相關。見表6。

表5　庫欣綜合征腎上腺皮質病變中FHIT、Ki-67、PCNA表達與臨床指標的關系　例（%）

表6　多因素有序Logistic回歸分析結果

3　討論

FHIT是1996年OHTA等[4]發現的擬定的抑癌基因，其基因結構和功能改變與人類多種惡性腫瘤的發生、發展有關[5]。在人類多種惡性腫瘤及多種惡性腫瘤細胞系中FHIT基因呈現高頻率的純合缺失、雜合缺失或異常轉錄。大約70%的人類上皮腫瘤和某些癌出現FHIT基因缺失、甲基化或蛋白質表達減少[6]。各種致癌因素影響亦可使FHIT蛋白表達受阻，從而使FHIT蛋白表達降低。病變組織中檢測到FHIT蛋白表達的缺失以及缺失的程度與其良惡性及預后有關，相反FHIT蛋白的高表達提示為良性[7]。本研究發現，在庫欣綜合征腎上腺皮質病變中，FHIT在腺癌的表達率最低（P<0.05），且全部為陰性或弱陽性，皮質增生的表達率最高（P<0.05），且全部為強陽性表達，腺瘤的表達介于兩者之間，提示在庫欣綜合征腎上腺皮質病變中，腎上腺皮質腺癌的FHIT基因轉錄產物異常及其蛋白缺失或減少較腺瘤和增生更為明顯，FHIT基因轉錄產物異常及其蛋白表達的改變與腎上腺皮質病變的良惡性有密切關系，其表達下調與腎上腺皮質腺癌發生、發展有密切關系。本研究同時發現FHIT在腎上腺皮質腺癌中除有陰性表達外，另有6/14例為弱陽性表達，提示FHIT基因轉錄產物異常及其蛋白缺失或減少在惡性腫瘤中亦非全部缺失，部分特別是惡性程度較低腺癌僅為蛋白表達的減少而非完全缺失。

Ki-67是目前已知的增殖抗原中最具增殖能力及應用最廣泛的增殖細胞標記之一，與腫瘤惡性程度、浸潤、轉移、復發密切相關[8-9]。本研究發現庫欣綜合征腎上腺皮質病變中，Ki-67在腺癌的表達率最高（P<0.05），較腺瘤和增生更為明顯（P<0.05），提示皮質腺癌的細胞增殖較腺瘤和皮質增生更為活躍。另外發現Ki-67的表達隨增生、腺瘤、腺癌的細胞增殖程度的提高，表達的陽性強度增加，陽性率亦有增加。提示Ki-67表達的高低可反映腫瘤的良惡性。

PCNA在腫瘤細胞中的表達情況可以敏感地反映腫瘤細胞的增殖活性，與腫瘤的生物學行為及惡性程度密切相關。較高的PCNA表達率反映了高水平的細胞增殖狀態[10]。本研究發現，在庫欣綜合征腎上腺皮質病變中，PCNA的表達在腺癌最高，腺瘤次之，增生最低（P<0.05）。從增生、腺瘤到腺癌，隨著細胞增殖水平的提高，PCNA表達的陽性強度亦隨之增加。且由于增生和腺瘤的細胞增殖水平不同，PCNA表達高低也可以作為兩者的判斷指標。

在臨床上，腫瘤大小常作為區別腫瘤良惡性的指標。腎上腺皮質腫瘤直徑超過5 cm應考慮有惡變的可能。而腎上腺位于腹后腔，腫瘤太小時不易觸到，體格檢查時發現有腹部包塊提示腫瘤直徑較大。能否觸及腹部包塊及腫瘤大小對鑒別庫欣綜合征腎上腺皮質病變的類型有價值。庫欣綜合征超過半數患者出現骨量減少或病理性骨折。皮質腺癌的骨量減少甚至病理性骨折更明顯。其原因可能與皮質醇增多引起的骨量丟失過多、破骨增加等因素有關。但骨量減少或骨折是否與腫瘤的良惡性有關尚未見相關報道。臨床上庫欣綜合征患者血皮質醇8AM、4PM和0AM均可出現升高并伴有節律紊亂。4PM血皮質醇可能因受影響因素較多而未見有相關統計的報道。庫欣綜合征患者由于腎上腺皮質腺癌、腺瘤或增生自主分泌皮質醇增多，抑制垂體ACTH的分泌，使血ACTH水平降低。8AM血ACTH水平可能是鑒別腎上腺皮質腺癌、腺瘤及增生的指標之一。

多因素Logistic回歸分析模型結果只有FHIT、PCNA兩個因素進入模型。提示FHIT和PCNA這兩個因素與鑒別診斷的關系更為密切。主要原因是其他因素與這兩個因素具有較高的相關性，因此，在多因素分析時被排除在方程之外。另外研究的病例數相對較少也是影響多因素分析結果的可能原因。

[1]ISIDORIA M,KALTSAS G A,MOHAMMED S,et al.Discriminatory value of the low-dose dexamethasone suppression test in establishing the diagnosis and differential diagnosis of cushing's syndrome[J].J.Clin Endocrinol Metab,Nov 2003,88(11): 5299-5306.

[2]KHALIFEH I,MUNKARAH A R,SCHIMP V,et al.The impact of c-kit and Ki-67 expression on patients prognosis in advanced ovarian serous carcinoma[J].Int J Gynecol Pathol,2005,24(3): 228-234.

[3]KISIELEWSKA J,LU P,WHITAKER M.GFP-PCNA as an S-phase marker in embryos during the first and subsequent cell cycles[J].Bio of the Cell,2005,97(3):221-229.

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[10]趙陽,李曉軍,隋昕,等.PCNA和Caspase-3在肺癌組織中的表達及意義[J].細胞與分子免疫學雜志,2010,26(2):154-156.

（張蕾編輯）

Expression of FHIT，K i-67 and PCNA in Cushing syndrome and related factors*

Jing Xian1,Gao-ming Huang2,Xiu-jiu Liang3,Song Huang1, Jing-wei Cai1,Li Li1,De-cheng Lu1,Zuo-jie Luo1
（1.Department of Endocrinology，the First Affiliated Hospital of Guangxi Medical University，Nanning，Guangxi530021，China；2.Department of Epidmiology and Statistics，Public Health College of Guangxi Medical University，Nanning，Guangxi530021，China；3.Department of Pathology，the First Affiliated Hospital of Guangxi Medical University，Nanning，Guangxi 530021，China）

Objective To study the expression of FHIT，Ki-67 and PCNA in hypercortisolism of various adrenocortical diseases and explore the correlative factors of the differential diagnosis of hypercortisolism of adrenocortical adenocarcinoma，adenoma and hyperplasia.Methods The expressions of FHIT，Ki-67 and PCNA were detected by immunohistochemical staining in 49 cases of adrenocortical diseases，which included 14 cases of adrenocortical carcinoma，26 cases of adrenocortical adenoma and 9 cases of adrenocortical hyperplasia.The factors correlated to differential diagnosis of hypercortisolism of various adrenocortical diseases were analyzed statistically by ordinal logistic regression.Results The expression rate of FHIT in adrenocortical hyperplasia，adrenocortical adenoma and adrenocortical adenocarcinoma was 100.00%，96.15%and 42.96%，respectively.The expression rate of Ki-67 in adreno－cortical adenocarcinoma and adrenocortical adenoma was 85.71%and 7.96%，respectively，while there was no expression atall in adrenocortical hyperplasia（0.00%）.The expression rate of PCNA in adrenocortical adenocarcinoma，adrenocortical adenoma and adrenocortical hyperplasia was 100.00%，96.15%and 77.78%，respectively.Logistic regression single-factor analysis revealed that 8 factors including FHIT，Ki-67，PCNA，abdominal mass，tumor size，osteopenia or fracture，serum cortisol level（4 pm）and blood ACTH level（8 am）were possibly linked to the differential diagnosis of hypercortisolism of the adrenocortical diseases，and multiple-factor analysis showed that FHIT and PCNA were the factors closely correlated to differential diagnosis of adrenocortical carcinoma，adenoma and hyperplasia. Conclusions The expressions of FHIT，Ki-67 and PCNA are strongly related with hypercortisolism of various adrenocortical diseases.They might be applied as the markers for distinguishing adrenocortical carcinoma，adrenocortical adenoma and adrenocortical hyperp lasia.The results of logistic regression analysis suggest that FHIT，Ki-67，PCNA，abdominal mass，tumor size，osteopenia or fracture，serum cortisol（4 pm）and blood ACTH level（8 am）may be the correlated factors of differential diagnosis of adrenocortical carcinoma，adenoma and hyperplasia；moreover，FHIT and PCNA are the factors closely correlated to differential diagnosis of hypercortisolism of adrenocortical diseases.

hypercortisolism；FHIT；Ki-67；PCNA；logistic regression

R 586.2

A

10.3969/j.issn.1005-8982.2016.14.008

1005-8982（2016）14-0037-05

2015-11-30

國家自然科學基金項目（No：81060220）；廣西自然科學基金項目（No：2011GXNSFA018172）；廣西留學回國人員科學基金（No：桂科回0731019）；廣西青年科學基金（No：桂科青0728073）；廣西衛生廳自籌經費科研課題項目（No：Z20133027）

羅佐杰，E-mail：zluo888@163.com