清、濃、醬三種大曲真菌多樣性初步分析

胡佳音，周　森，趙衛(wèi)鵬，于曉濤，劉紅霞，張如金

（北京順鑫農(nóng)業(yè)股份有限公司牛欄山酒廠，北京101301）

清、濃、醬三種大曲真菌多樣性初步分析

胡佳音，周森，趙衛(wèi)鵬，于曉濤，劉紅霞，張如金

（北京順鑫農(nóng)業(yè)股份有限公司牛欄山酒廠，北京101301）

采用傳統(tǒng)分離方法結(jié)合高通量測序?qū)η逑恪⑨u香、濃香3種大曲真菌進行多樣性分析，兩種方法所獲得結(jié)果較為一致。研究表明，清香型大曲真菌主體較為明顯，扣囊復(fù)膜酵母S.fibuligera和傘枝橫梗霉L.corymbifera是絕對主體，占94%，而生香酵母和釀酒酵母數(shù)量較少。濃香型大曲和醬香型大曲多樣性結(jié)果較為接近，兩種大曲中較難分離到酵母類真菌，其主體菌均為謝瓦散囊菌E.chevalieri。區(qū)別在于，濃香型大曲中真菌種類較多，數(shù)量較為接近，而醬香型大曲中，真菌多為耐熱絲狀真菌和青霉菌。

微生物； 真菌； 扣囊覆膜酵母； 謝瓦散囊菌； 高通量測序

中國白酒作為世界六大蒸餾酒之一，具有悠久的歷史和深厚的酒文化內(nèi)涵，深受消費者喜愛。大曲是白酒中主要糖化發(fā)酵劑，在釀造過程中起著糖化、生香、發(fā)酵、提供菌源的作用，具有“酒之骨”的美稱，可見大曲在發(fā)酵中的重要地位。大曲中真菌類微生物可分為絲狀真菌和酵母菌兩大類。其中，絲狀真菌往往具有較高的糖化力，例如米根霉、黑曲霉。而生香、發(fā)酵往往依靠生香酵母和釀酒酵母等酵母類真菌。可以看出，大曲中的真菌同大曲在釀造中的作用息息相關(guān)。同時，在大曲制作過程中真菌生長不僅代謝產(chǎn)物，更為發(fā)酵初期糖化提供各種酶類物質(zhì)。

清香、濃香、醬香是我國傳統(tǒng)的三大香型白酒，現(xiàn)今許多種香型均從其演變而來。對這3種大曲真菌多樣性進行研究，了解不同微生物之間的比例，使我們認識到不同香型大曲真菌之間的差異。

1　材料與方法

1.1實驗樣品

中低溫清香型大曲、中高溫濃香型大曲、高溫醬香型大曲。

1.2主要儀器

北京東聯(lián)哈爾儀器制造有限公司BSC-1100ⅡA2型生物安全柜；美國BIORAD公司梯度C1000快速梯度基因擴增儀；美國BIORAD公司基礎(chǔ)型水平電泳儀；美國BIORAD公司全自動凝膠成像儀；德國Eppendorf公司1-14k高速冷凍離心機；寧波江南SPX-320型生化培養(yǎng)箱。

1.3培養(yǎng)基

酵母分離培養(yǎng)基（YPD培養(yǎng)基）：yeast extract 10 g，蛋白胨20 g，葡萄糖20 g，瓊脂20 g，水1 L。

絲狀真菌分離培養(yǎng)基（PDA培養(yǎng)基）：馬鈴薯浸提液500 mL，葡萄糖20 g，瓊脂20 g，水500 mL。

孟加拉紅培養(yǎng)基：北京澳博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司。

察氏培養(yǎng)基：北京澳博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司。

1.4大曲微生物分離鑒定

將3種不同大曲分別粉碎混合，稱取10 g和1 g備用，取10 g大曲樣品于90 mL無菌水中振蕩混勻，擬定為10-1濃度。吸取1 mL到9 mL無菌水中為10-2，依次稀釋為10-3、10-4、10-5濃度，分別吸取10-3、10-4、10-5稀釋液0.1 mL，每個梯度分別涂布于相應(yīng)培養(yǎng)基平板上。將涂布好的平皿依常規(guī)培養(yǎng)法培養(yǎng)，培養(yǎng)的微生物包括絲狀真菌、酵母菌。培養(yǎng)溫度分別為絲狀真菌30℃、酵母28℃，培養(yǎng)時間根據(jù)菌落的生長情況而定，一般為24～48 h。根據(jù)選擇培養(yǎng)的結(jié)果，酵母菌以10-4板，絲狀真菌以10-3板為主計數(shù)，乘以稀釋倍數(shù)計算不同微生物的種群數(shù)量。其余梯度每個平板挑取不同形態(tài)的單菌落，接種在斜面上，28℃培養(yǎng)2 d，挑取新鮮的純菌接種至20%甘油管，于-80℃超低溫冰箱中保藏。

1.5真菌分子鑒定

酵母DNA采用酵母基因組DNA提取試劑盒（天根生化）提取，絲狀真菌先用液態(tài)氮處理后，采用土壤基因組DNA提取試劑盒（FastDNA SPIN Kit for Soil）提取。PCR反應(yīng)條件：94℃加熱3 min使模板DNA變性，然后進入下列溫度循環(huán)：94℃變性30 s，50℃退火30 s，72℃延伸45 s，共進行35個循環(huán)，最后在72℃延伸5 min。酵母類引物NL1（5'-GCATATCGGTAAGCGGAGGAAAAG）和NL4（5'-GGTCCGTGTTTCAAGACGG）。絲狀真菌采用ITS5（5'-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG）和ITS4（5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC）。

PCR產(chǎn)物送公司測序后，用Chromas軟件分析測序質(zhì)量，去除峰圖不可靠的部分對DNA序列進行手動校正，用校正后的序列在NCBI（http://www.ncbi.nlm.nih. gov/blast）中進行同源序列搜索。

1.63種大曲高通量測序

稱取1 g混勻大曲樣品，用Fastprep處理后，采用土壤基因組DNA提取試劑盒（FastDNA SPIN Kit for Soil）提取。濃度檢測合格后，送北京奧維森公司對真菌Its區(qū)Its1-Its2進行高通量測序，原始序列數(shù)據(jù)通過公司進行質(zhì)量控制，舍棄低質(zhì)量序列。之后用QIIME軟件進行總體分析，利用軟件將序列相似性大于97%的定位為1個OTU（operational taxonomic units）。選取分析數(shù)據(jù)中每個OTU中具有代表性的序列，通過blast比對，獲得每一個OTU種名。

2　結(jié)果與分析

2.13種大曲真菌分離數(shù)據(jù)

通過表1可以看出，清香型大曲中的主要真菌為扣囊復(fù)膜酵母和絲狀真菌，而釀酒和生香類酵母數(shù)量較少。濃香型大曲中，主要真菌是絲狀真菌且含有少量扣囊復(fù)膜酵母。醬香型大曲中，所分離到真菌均為絲狀真菌，未分離到其余真菌。

表1　3種大曲真菌分離結(jié)果　（cfu/g）

通過表2可以看出，同醬香型和濃香型大曲相比，清香型大曲中酵母類真菌種類較多，分別為異常漢遜酵母、扣囊復(fù)膜酵母、釀酒酵母、東方伊薩酵母、弗比恩畢赤酵母5種。絲狀真菌為產(chǎn)黃青霉、分枝橫梗霉和傘枝橫梗霉3種。濃香型大曲和醬香型大曲中未分離到酵母類真菌，均為絲狀真菌。濃香型大曲中分離到4種絲狀真菌，分別為：黃曲霉A.flavus、嗜熱子囊菌T.lanuginosus、微小根毛霉R.pusillus和謝瓦散囊菌E.chevalieri。醬香型大曲共分離到7種絲狀真菌，分別為：嗜熱子囊菌T.lanuginosus、曲霉A.hiratsukae、絲衣霉B.spectabilis、產(chǎn)黃青霉P.chrysogenum、曲霉A.ochraceus、傘枝橫梗霉L.corymbifera、謝瓦散囊菌E.chevalieri。

表2　3種大曲真菌分離結(jié)果

由于絲狀真菌具有孢子和密集菌絲，僅僅依靠傳統(tǒng)方法分離較難準確獲得大曲中真菌種類規(guī)律，所以，絲狀真菌種類統(tǒng)計需要結(jié)合高通量數(shù)據(jù)進行確定。

圖1　清香型大曲高通量數(shù)據(jù)

2.23種大曲高通量測序結(jié)果分析

本次高通量測序中清香型大曲中共獲得79種OUT，挑選數(shù)量較多的前20種OUT Blast比對后進行分析。由圖1可以看出，在清香型大曲中，扣囊復(fù)膜酵母S.fibuligera是絕對主體，占73%，傘枝橫梗霉L.corymbifera占21%，熱帶假絲酵母C.tropicalis占2.2%，P.sorbitophila 占1.2%，畢赤酵母P.kudriavzevii占0.5%，釀酒酵母S. cerevisiae占0.5%，其余真菌占1.6%。可以看出，扣囊復(fù)膜酵母和傘枝橫梗霉在清香型大曲中占94%，是構(gòu)成清香型大曲真菌的主要微生物，生香類酵母和產(chǎn)酒類酵母在大曲中數(shù)量較少。

本次高通量測序中濃香型大曲中共獲得142種OUT，挑選數(shù)量較多的前20種OUT Blast比對后進行分析。通過圖2可以看出，濃香型大曲微生物多樣性較為豐富，主要真菌為謝瓦散囊菌E.chevalieri，占52%，米曲霉A.oryzae占11.7%，畢赤酵母P.kudriavzevii占8.9%，嗜熱子囊菌T.lanugin占6.2%，假絲酵母C.catenulata占3.2%，異常維克漢米酵母W.anomalus占2.4%，扣囊復(fù)膜酵母S.fibuligera占1.9%。可以看出，濃香型大曲中，主體真菌微生物是謝瓦散囊菌，占52%，其余像米曲霉、畢赤酵母、嗜熱子囊菌等真菌在大曲中所占比例為34.3%。余下的真菌雖然所占比例較少，但種類較多，共占13.7%。

圖2　濃香型大曲高通量數(shù)據(jù)

圖3　醬香型大曲高通量測序

本次高通量測序中醬香型大曲中共獲得139種OUT，挑選數(shù)量較多的前20種OUT Blast比對后進行分析。由圖3可以看出，醬香型大曲中主要真菌為謝瓦散囊菌E.chevalieri（占43%）和嗜熱子囊菌T.lanuginosus（占34.8%）這兩類。其他如多變擬青霉P.variotii占6.5%，青霉屬Penicillium sp.占5.9%，熱子囊菌T.crustaceus占4.9%，余下真菌共占4.9%。可以看出，醬香型大曲中酵母類真菌數(shù)量較少，主要為高溫高滲絲狀真菌。整個大曲中，謝瓦散囊菌和嗜熱子囊菌共占77.8%，為主體微生物。其余數(shù)量較多的真菌屬于青霉屬和耐熱子囊菌類。

3　討論

對3種大曲進行真菌多樣性分析，可以看出，兩種方法所獲得結(jié)果較為一致。

清香型大曲屬于中低溫培養(yǎng)大曲，較適應(yīng)真菌類生長，因此真菌種類較多。其中最主要的真菌是扣囊復(fù)膜酵母和傘枝橫梗霉，而被認為在發(fā)酵中起主要作用的釀酒酵母和生香酵母所占比例較少，在大曲中只是充當種子作用。

濃香型大曲屬于中高溫大曲，制曲溫度一般在50～60℃。傳統(tǒng)分離方法只在濃香型大曲中分離到絲狀真菌和扣囊復(fù)膜酵母。但在高通量分析中，濃香型大曲中微生物種類較多，其主體為謝瓦散囊菌，同時也檢測到了畢赤酵母、假絲酵母、異常維克漢姆酵母等生香類酵母，而這些生香類酵母菌在傳統(tǒng)分離方法中并未分離到。推斷認為，由于濃香型大曲制曲過程中溫度過高，造成多數(shù)酵母類微生物死亡，而其DNA在制曲過程中并未降解，所以在高通量中被檢測出而無法分離到活體菌株。

醬香型大曲屬于高溫大曲，制曲溫度一般在60～70℃，造成了其主體真菌屬于耐高溫一類的謝瓦散囊菌、嗜熱子囊菌、多變擬青霉、熱子囊菌等，而酵母類真菌和不耐高溫類絲狀真菌等無法在醬香型大曲中存活。

制曲過程是環(huán)境中微生物的富集過程，同時也是一個選擇優(yōu)化的過程，為不同香型發(fā)酵菌系的形成提供了重要保障。清香型白酒屬于清蒸清茬發(fā)酵工藝，其制曲工藝采用中低溫制曲，這種較為溫和的制曲方式可以保證其中釀酒酵母、生香酵母及絲狀真菌的存活，從而提供其發(fā)酵中所需要的多種真菌。相對于清香型白酒，濃香型白酒在發(fā)酵中窖泥和母糟內(nèi)含有大量發(fā)酵所需酵母菌和絲狀真菌，醬香型白酒入池前需要進行堆積富集微生物，這兩種香型在發(fā)酵前均可以從發(fā)酵環(huán)境中獲得眾多真菌。所以，濃香、醬香兩種大曲中主體真菌均為耐熱真菌，較難分離到酵母類真菌。

對以上3種大曲微生物多樣性進行系統(tǒng)分析，使我們認識到3種大曲微生物之間的差異，既可以對不同香型強化大曲提供理論指導(dǎo)，也可以對不同大曲混合發(fā)酵生產(chǎn)特色香型等工藝的改進提供理論支撐。

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Preliminary Analysis of Fungal Diversity in Qingxiang Daqu，Nongxiang Daqu and Jiangxiang Daqu

HU Jiayin，ZHOU Sen，ZHAO Weipeng，YU Xiaotao，LIU Hongxia and ZHANG Rujin
（Niulanshan Distillery，ShunxinAgriculture Co.Ltd.，Beijing 101301，China）

Fungal diversity in Qingxiang Daqu，Jiangxiang Daqu and Nongxiang Daqu was analyzed by using traditional separation methods/ high throughput sequencing.Both methods obtained almost identical results.The main fungi of Qingxiang Daqu was evident，S.fibuligera and L.corymbifera accounted for 94%，and the amount of aroma-producing yeasts and S.cerevisiae was less.The fungal diversity of Nongxiang Daqu and Jiangxiang Daqu were more similar.Yeast-like fungi were hardly isolated in both Daqu and their main fungus was E.chevalieri.The difference was that，there were more fungal varieties in Nongxiang Daqu and their amounts were close，however，fungi in Jiangxiang Daqu were mainly heat-resistance filamentous fungi and Penicillium.（Trans.by YUE Yang）

microbe；fungus；Saccharomycopsis fibuligera；Eurotium chevalieri；high throughput sequencing

TS261.1；Q93-3；TS262.3

A

1001-9286（2016）08-0087-04

10.13746/j.njkj.2016121

2016-04-11

周森（1986-），男，工程師，大學(xué)本科，研究方向為白酒釀造微生物研究。

張如金。

優(yōu)先數(shù)字出版時間：2016-06-16；地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/52.1051.TS.20160616.1431.004.html。